Browsing by Author "Loureiro, Pedro"
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- Alpha-thalassemia due to novel deletions and complex rearrangements in the subtelomeric region of chromosome 16pPublication . Ferrão, José; Silva, Marisa; Gonçalves, Lúcia; Gomes, Susana; Loureiro, Pedro; Coelho, Andreia; Miranda, Armandina; Seuanes, Filomena; Batalha Reis, Ana; Pina, Francisca; Maia, Raquel; Kjollerstrom, Paula; Monteiro, Estela; F. Lacerda, João; Lavinha, João; Gonçalves, João; Faustino, PaulaIntroduction: Inherited deletions removing the α-globin genes and/or their upstream regulatory elements (MCSs) give rise to alpha-thalassemia, one of the most common genetic recessive disorders worldwide. The pathology is characterized by microcytic hypochromic anemia due to reduction of the α-globin chain synthesis, which are essential for hemoglobin tetramerization. Material and Methods: In order to clarify the suggestive α-thalassemia phenotype in eleven patients, we performed Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification with commercial and synthetic engineered probes, gap-PCR, and Sanger sequencing to search for deletions in the subtelomeric region of chromosome 16p. Results: We have identified five distinct large deletions, two of them novel, and one indel. The deletions range from approximately 3.3 to 323 kb, and i) remove the whole α-globin cluster; or ii) remove exclusively the upstream regulatory elements leaving the α-globin genes structurally intact. The indel consists in the loss of MCS-R2 (HS-40), which is the most important distal regulatory element for the α-globin gene expression, and the insertion of 39 bp, seemingly resulting from a complex rearrangement involving two DNA segments (probably from chromosome 3q) bridging the deletion breakpoints with a CC-bp orphan sequence in between. Finally, in one patient no α-globin deletion or point mutation were found. This patient revealed to be a very unusual case of acquired alpha-thalassemia associated with a myelodysplastic syndrome. Conclusions: Our study widens the spectrum of molecular lesions by which α-thalassemia may occur and emphasizes the importance of diagnosing large α-zero-deletions to provide patients with appropriate genetic counseling.
- Alpha-thalassemia due to novel deletions and complex rearrangements in the subtelomeric region of chromosome 16pPublication . Ferrão, José; Silva, Marisa; Gonçalves, Lúcia; Gomes, Susana; Loureiro, Pedro; Coelho, Andreia; Miranda, Armandina; Seuanes, Filomena; Batalha Reis, Ana; Valtonen-André, Camila; Sonesson, Annika; Pina, Francisca; Maia, Raquel; Kjollerstrom, Paula; Monteiro, Estela; F. Lacerda, João; Lavinha, João; Gonçalves, João; Faustino, PaulaIntroduction: Inherited deletions removing the α-globin genes and/or their upstream regulatory elements (MCSs) give rise to alpha-thalassemia, one of the most common genetic recessive disorders worldwide. The pathology is characterized by microcytic hypochromic anemia due to reduction of the α-globin chain synthesis, which are essential for hemoglobin tetramerization. Material and Methods: In order to clarify the suggestive α-thalassemia phenotype in eleven patients, we performed Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification with commercial and synthetic probes, gap-PCR, and Sanger sequencing to search for deletions in the subtelomeric region of chromosome 16p. Results: We have identified six distinct large deletions, three of them novel, and one indel. The deletions range from approximately 3.3 to 323 kb, and i) remove the whole α-globin cluster; or ii) remove exclusively the upstream regulatory elements leaving the α-globin genes structurally intact. The indel consists in the loss of MCS-R2 (HS-40), which is the most important distal regulatory element for the α-globin gene expression, and the insertion of 39 nt, seemingly resulting from a complex rearrangement involving two DNA segments (probably from chromosome 3q), bridging the deletion breakpoints with a CC-bp orphan sequence in between. Finally, in one patient no α-globin deletion or point mutation were found. This patient revealed to have acquired alpha-thalassemia associated with a myelodysplastic syndrome. Conclusions: Our study widens the spectrum of molecular lesions by which α-thalassemia may occur and emphasizes the importance of diagnosing large α0-deletions to provide patients with appropriate genetic counseling.
- Base molecular da hemocromatose hereditária não-clássica em PortugalPublication . Faria, Ricardo; Silva, Bruno; Silva, Catarina; Loureiro, Pedro; Queiroz, Ana; Esteves, Jorge; Mendes, Diana; Fleming, Rita; Vieira, Luís; Gonçalves, João; Lavinha, João; Faustino, PaulaA Hemocromatose Hereditária (HH) é uma doença autossómica recessiva caracterizada pela absorção excessiva de ferro a nível intestinal e sua acumulação em órgãos vitais, podendo originar cardiomiopatia, cirrose e carcinoma hepatocelular. O correspondente diagnóstico molecular é obtido pela associação com genótipos específicos no gene HFE (homozigotia para p.Cys282Tyr ou heterozigotia composta p.Cys282Tyr/p.His63Asp). Contudo, nos países do sul da Europa, cerca de um terço dos doentes com diagnóstico clínico de HH não apresenta os referidos genótipos. Para identificar a base molecular da HH não-clássica em Portugal usaram-se metodologias de pesquisa geral de variantes genéticas (SSCP e dHPLC), Next-Generation Sequencing (NGS) e sequenciação de Sanger, cobrindo seis genes relacionados com o metabolismo do ferro em 303 doentes. Identificaram-se 69 variantes diferentes e de vários tipos, por ex. missense, nonsense, de splicing, que perturbam a transcrição do gene ou a regulação da tradução do mRNA. Seguidamente, realizaram-se estudos in silico e in vitro para esclarecer o significado etiológico de algumas das novas variantes. Concluiu-se que a base molecular desta patologia é bastante heterogénea e que a NGS é uma ferramenta adequada para efetuar a análise simultânea dos vários genes num grande número de amostras. Contudo, o estabelecimento da relevância clínica de algumas variantes requer a realização de estudos funcionais.
- Eleven years experience of being under external quality assessment for the molecular genetic diagnosis of hereditary haemochromatosis HFE-associated and accreditation under ISO 15189Publication . Loureiro, Pedro; Gomes, Susana; Torgal, Helena; Isidro, Glória; Gonçalves, JoãoLaboratory quality is continuously present in our daily practice of molecular diagnosis in human genetics. Our participation in external quality assessment (EQA), specially with EMQN, gave us the opportunity to improve the reports of our genetic tests, to compare our performance/scores with other European laboratories, and to be permanently updated with the most recent recommendations for best practice in human molecular diagnosis. Since 2005, our lab has been participating in the EMQN external quality assessment program for the molecular diagnosis of hereditary haemochromatosis HFE-associated (HH-HFE). Since then, our score regarding the genotyping category has achieved every year the highest marks (2.0), while for the interpretation category, in two years, the mean score was 1.75. These scores lead us to improve the “interpretation section” of our reports in order to give the best result to the physicians and patients. In addition of a correct genotyping, the report “interpretation section” is particularly important, it should include the main suggestions for the best patient’s clinical management: i) immediate impact of the result for the patient, ii) patient’s clinical follow-up and other diagnostic options, iii) long term-impact (specially in predictive tests), iv) relevance of the result for relatives and, v) recommendations of genetic counselling. In accordance with OCDE disease specific guidelines for quality assurance in molecular genetic testing, and with the requirements of ISO 15189, in 2014 we were the first Portuguese laboratory accredited by IPAC, for HH-HFE - variants p.H63D and p.C282Y, and other genetic tests (http://www.ipac.pt/pesquisa/ ficha_15189.asp?id=E0015). Accreditation under the International Standard ISO 15189 is challenging but contributes to introduce improvements in our current practice because it comprises “management requirements” (e.g. quality management system, external services and supplies, preventive and corrective actions, control of records) and “technical requirements” (e.g. accommodation and environmental conditions, laboratory equipment, reagents and consumables, training and qualifications of personnel, examination processes, results reporting). Accreditation enhances laboratory quality at different levels, gives credibility, competency and confidence, but primarily contributes to a better patient’s clinical diagnosis reducing the turnaround time, patient management and treatment, and genetic counselling.
- Genética molecular das hemoglobinopatias no Departamento de Genética Humana do INSA: uma trajetória de contributos para a ciência e para a sociedadePublication . Faustino, Paula; Loureiro, Pedro; Gomes, Susana; Lopes, Pedro; Gonçalves, João
- Hemocromatose hereditária associada ao gene HFE: resultados do diagnóstico molecular, correlação genótipo-fenótipo e importância da qualidade laboratorialPublication . Fonseca, Pedro; Loureiro, Pedro; Gomes, Susana; Faustino, Paula; Gonçalves, JoãoA hemocromatose hereditária (HH) associada ao gene HFE, dado ser uma doença autossómica recessiva com penetrância incompleta, deve obedecer a uma estratégia de análise molecular que compreenda, em primeiro lugar, a pesquisa das alterações moleculares que ocorrem mais frequentemente no referido gene (p.H63D e p.C282Y). Deve dar-se prioridade à pesquisa da alteração p.C282Y já que esta, quando presente em homozigotia, não havendo outros fatores de risco associados, permite confirmar a doença em indivíduos com fenótipo clínico sugestivo de HH e/ou apresentam biomarcadores séricos indicadores de sobrecarga em ferro, nomeadamente saturação da transferrina e ferritina elevadas. Neste trabalho, o estudo molecular de 1838 doentes com parâmetros clínicos e/ou bioquímicos relacionados com HH, revelou a presença de homozigotia para a alteração p.C282Y em 4% dos indivíduos analisados, valor muito acima do estimado para a população em geral (~0,09%) enquanto que a homozigotia para p.H63D foi de 7,9%, o qual corresponde a duas vezes o valor previsto para a população em geral (~4%). Ou seja, estes resultados, sustentam que a referida pesquisa, antecedida de aconselhamento genético, deverá ser realizada para confirmar (em indivíduos com índices bioquímicos de sobrecarga em ferro) a suspeita de HH. O diagnóstico molecular antecedido da ocorrência dos sintomas graves da HH, permite antecipar a vigilância clínica, prevenindo a progressão da doença para as manifestações mais graves que incluem, por exemplo, cirrose e carcinoma hepatocelular. Complementarmente, valoriza-se também a importância da participação dos laboratórios em ensaios de avaliação externa da qualidade, o que permite melhorar o desempenho dos mesmos no âmbito da genotipagem, interpretação de resultados e qualidade dos relatórios.
- Hemoglobin variants with electrophoretic mobility similar to hemoglobin SPublication . Miranda, Armandina; Faustino, Paula; Gonçalves, João; Seuanes, Filomena; Copeto, Sandra; Loureiro, Pedro; Costa, Alcina; Costa, Sandra; Seixas, Maria TeresaHemoglobinopathies are among the most common inherited diseases around the world and are one of the world’s major health problems. They are monogenic diseases of autosomal recessive transmission resulting from mutations affecting the genes responsible for the synthesis of globin chains. Abnormal hemoglobins (Hb), named Hb variants, are caused by structural defects resulting from an altered amino acid sequence in globin chains, being Hb S the more frequent and pathogenic/disease associated. The aim of this work was to identify and characterize Hb variants with mobility similar to Hb S when using common laboratorial methodologies, such as isoelectric focusing and high pressure ion exchange chromatography (HPLC). Hemoglobin analysis was performed by isoelectric focusing and HPLC. Globin chain variants were classified in alpha or beta type by reversed phase high performance chromatography. Hb S was confirmed by the solubility test. In order to identify the rare Hb variants, molecular analyses were performed in patient’s DNA. From 2010 to 2016, in the routine practice of our laboratory, 601 cases of variants of Hb were detected with mobility Hb S-like. Amongst them, 433 were confirmed as being Hb S (72.0%). Others hemoglobins also with clinical relevance, Hb D and Hb Lepore, were prevalent, 90 (15.0%) and 61 (10.2%), respectively. The remaining 17 cases were classified as rare (2.8%) and 10 of them were identified by molecular studies as: Hb Maputo (1), Hb G-Coushata (1), Hb Summer Hill (1), Hb Setif (1), Hb G Waimanalo (1), Hb D Iran (1) Hb Oleander (1), Hb Ottawa (1), Hb Etobicoque (1) and Hb Matsue-Oki (1). Hb Matsue-Oki was found in compound heterozygosity with the –α3.7kb-thalassemia deletion. We can conclude that combining the results obtained by the different biochemical methodologies allow the presumptive identification of the more prevalent variants, namely Hb S, Hb D and Hb Lepore, and direct the molecular study for the definitive identification. This study also revealed that several rare variants have similar mobility as Hb S and, consequently, some safety measures should be applied in order to achieve their accurate identification. A correct laboratorial diagnosis is essential for proper patient’s clinical management and genetic counselling.
- Hemoglobinas variantes com mobilidade eletroforética semelhante à da Hemoglobina SPublication . Miranda, Armandina; Seuanes, Filomena; Copeto, Sandra; Loureiro, Pedro; Costa, Alcina; Costa, Sandra; Seixas, Maria Teresa; Gonçalves, João; Gonçalves, João; Faustino, PaulaAs hemoglobinopatias são doenças monogénicas hereditárias, de transmissão autossómica recessiva, resultantes de mutações nos genes codificantes para as cadeias de globina da hemoglobina (Hb), ou nas suas regiões regulatórias. Encontram-se entre as doenças hereditárias mais comuns e constituem um dos principais problemas de saúde a nível mundial.
- Hemoglobinas variantes com mobilidade eletroforética semelhante à da Hemoglobina SPublication . Miranda, Armandina; Seuanes, Filomena; Copeto, Sandra; Loureiro, Pedro; Costa, Alcina; Costa, Sandra; Seixas, Maria Teresa; Gonçalves, João; Faustino, PaulaIntrodução: As hemoglobinopatias são doenças monogénicas hereditárias, de transmissão autossómica recessiva, resultantes de mutações nos genes codificantes para as cadeias de globina da hemoglobina (Hb), ou nas suas regiões regulatórias. Encontram-se entre as doenças hereditárias mais comuns e constituem um dos principais problemas de saúde a nível mundial. As variantes das hemoglobinas são causadas por defeitos estruturais resultantes de alterações na sequência de aminoácidos nas cadeias de globina, sendo a Hb S a mais frequente e associada a patologia. As hemoglobinopatias são as únicas, entre todas as doenças genéticas, em que a deteção de portadores é possível por testes hematológicos e bioquímicos. No entanto, a análise molecular do respetivo gene, deve ser realizada para a identificação definitiva de casos complexos ou quando os resultados hematológicos/bioquímicos não são conclusivos. A identificação de hemoglobinopatias é frequentemente presuntiva, com base em tempos de retenção e padrões de migração, e deve ser baseada preferencialmente no mínimo em duas metodologias com princípios de separação diferentes. A identificação definitiva requer a análise do respetivo gene, espectrometria de massa ou sequenciação de proteínas 1, 2 .Os procedimentos analíticos mais comumente utilizados devem ter capacidade de detetar as variantes de hemoglobina clinicamente mais significativas: Hb S, Hb C, Hb D Punjab, Hb Lepore , Hb E e Hb OArab. .Objetivo: Caraterizar e identificar as variantes de Hb com mobilidade eletroforética semelhante à Hb S..
- Hemoglobinopatias: a que casais oferecer o diagnóstico pré-natal?Publication . Gonçalves, João; Loureiro, Pedro; Gomes, Susana; Faustino, PaulaAs hemoglobinopatias (alfa-talassémia, beta-talassémia, drepanocitose e talassodrepanocitose) constituem anemias hereditárias, de transmissão autossómica recessiva, que nas suas formas mais graves são altamente incapacitantes. Dada a impossibilidade de cura, aos casais em risco de terem descendência afetada com as formas mais graves da doença deve ser disponibilizada a realização de diagnóstico pré-natal (DPN) molecular. Anteriormente à disponibilização do DPN já deve conhecer-se a alteração molecular de cada progenitor, uma vez que isto permite: i) a classificação de cada mutação quanto às suas consequências funcionais; ii) o conhecimento dos possíveis genótipos do feto; e iii) inferir o respetivo fenótipo clínico/sintomatologia associado a cada genótipo do futuro descendente. Assim, se um dos genótipos possíveis do descendente corresponder a uma forma grave de hemoglobinopatia (drepanocitose, talassémia major/intermédia, talassodrepanocitose, doença da hemoglobina H ou síndrome de Hb Bart’s Hydrops Foetalis) é mandatório oferecer ao casal o DPN, contrariamente aos casais que possuam mutações suaves não está indicada esta disponibilização. As alterações moleculares mais frequentemente associadas às hemoglobinopatias em Portugal são bem conhecidas assim como a sua distribuição geográficaa,b. Contudo, face aos fluxos migratórios recentes, têm sido introduzidas em Portugal novas mutações que interessa identificar e caracterizar. Assim, o diagnóstico clínico, hematológico e bioquímico, a investigação molecular, o estabelecimento de testes genéticos fiáveis e o aconselhamento genético deverão continuar a contribuir de forma concertada e continuada para a identificação de portadores e de casais em risco, para identificar as novas alterações moleculares e respetiva correlação genótipo/fenótipo. Nos últimos 16 anos realizámos 224 DPNs de hemoglobinopatias, sendo 43 fetos afetados e dos 181 restantes, 107 eram portadores/heterozigóticos e 74 apresentavam um genótipo normal. Estes resultados são reveladores do impacto que o rastreio de portadores de hemoglobinopatias tem tido na nossa população, refletindo a identificação de casais em risco e a efetiva prevenção das hemoglobinopatias em Portugal. a) Martins MC, et al (1993). J Med Genet 30:235-239. b) Faustino P, et al (1992). Hum Genet 89:573-576.