DDI - Dissertações de mestrado
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- Conhecer a epidemiologia da infeção por vírus da imunodeficiência humana tipo 2 (VIH-2) em indivíduos residentes em Portugal: o que mudou nas últimas décadas?Publication . Mendes, Inês Filipa Santos; Pádua, Elizabeth; Piedade, JoãoThe main objectives of this study were to analyse the epidemiological evolution of HIV-2 infection in Portugal using demographic, clinical and laboratory data corresponding to samples from HIV-2-infected parturients received at INSA, and to conduct the molecular characterisation of HIV-2 in a convenience sample, focusing on the phylogenetic classification of viruses and identification of resistance mutations. The analysis of the overall sample received at the laboratory between 2006 and 2023 was based on known demographic and clinical data. The molecular analysis of HIV-2 was performed on selected samples, subjected to DNA extraction, nested-PCR amplification of the PR-RT and IN regions of the pol gene and the amplified samples sequenced by the Sanger method. The results obtained were discovered with several bioinformatics programs, the respective phylogenetic trees were constructed and the search for resistance mutations was carried out with available international databases. An analysis of data from samples of the total population (n=183) revealed that 16.6% of the parturients infected with HIV-2 were Portuguese, but there was a clear predominance of women born in Africa (83.4%), mostly in Guinea-Bissau and in the age group of 30-39 years. Between 2006 and 2023, an apparent general improvement in the immunological situation was observed, with an increase in the proportion of women with CD4+ T cells above 500 cells/μL and an increase in the rate of adherence to ART during pregnancy (56.2% to 64.0%), which was higher among African women (69.6%) compared to Portuguese women (66.7%). Over time, a transition from ART regimens containing only NRTI to NRTI regimens combined with INSTI was achieved, and between 2018 and 2023, this regimen was prescribed to 56.5% of parturients. The analysis of the selected convenience sample (n=99) proved to be representative of the total samples received in the laboratory between 2011 and 2023, for the demographic and clinical variations analysed. Amplification was successful in 48.5% of the samples for PR-RT and 46.5% of the samples for IN, with all sequences phylogenetically in HIV-2 group A and excluded of cluster A2. It was observed that 12 sequences derived from samples of 12 women presented mutations of interest, namely, in 7 of 45 sequences of the RT group and in 5 of 35 sequences of the IN group. Three sequences from each group presented accessory mutations associated with a possible reduction in susceptibility to antiretrovirals (I75V, V111I and F214L in RT and I84V, A153S in IN). However, resistance mutations were identified in 4 RT sequences and 2 IN sequences (K70R, Q151M, M184V and S215Y in RT and R263K and N155H in IN). This study revealed the need for greater efforts to implement measures to increase adherence to ART, as well as screening for HIV-2 infection, to prevent transmission and improve clinical outcomes in patients. The results produced in this study may contribute to updating knowledge about the epidemiological and molecular characteristics of HIV-2 in Portugal, as well as evidence of the existence of resistance mutations with an impact on the treatment of the infection.
- Bioinformatics toolbox for comparative clustering evaluation of Whole-Genome Sequencing (WGS) pipelines for bacteria routine surveillancePublication . Pereira, Joana Vanessa Gomes; Mixão, Verónica de Pinho; Couto, Francisco José MoreiraWhole-Genome Sequencing (WGS) provides higher resolution than traditional typing to distinguish closely related isolates. As result, disease surveillance increasingly adopts WGS, with international agencies recommending its use in reference laboratories. However, the heterogeneity of workflows and unequal resources raise concerns about inter-laboratory result comparability and, consequently, data sharing and communication. To address these issues, this thesis project developed EvalTree, a Python-based command-line tool to compare clustering results from two typing solutions, including traditional and genome-scale approaches, assessing their congruence at all possible resolution levels. EvalTree accepts two input folders or clustering files, processes them, and produces multiple outputs, including an user-friendly HTML report. When a folder generated by ReporTree, a tool to identify genetic clusters at all possible distance thresholds, is provided as input, EvalTree enables not only the inter-pipeline clustering comparison, but also detection of stable clustering regions, cluster characterization using metadata, and assessment of outbreak signal overlap. EvalTree was validated and benchmarked using a large (2946 isolates) and diverse dataset of Salmonella enterica, showing it accurately reproduces a recently published large-scale evaluation of inter-pipeline congruence at the European level. Its running time was mainly affected by dataset diversity rather than size. To further demonstrate its applicability, EvalTree supported the implementation of the S. enterica genomic surveillance pipeline at the Portuguese National Institute of Health (INSA), by comparing its performance with that of the European Food Safety Authority (EFSA), revealing high cluster congruence and similar resolution power. In summary, EvalTree is a novel bioinformatics tool (available through conda installation) that offers a practical, flexible solution to evaluate cluster congruence between the pipelines of different laboratories, supporting inter-laboratory communication in a One Health framework. It also promotes the long-term sustainability of any pipeline by enabling informed decision-making throughout its life-cycle (e.g., evaluating software updates).
- Implementation of a data analysis pipeline for the genetic characterization of non-seasonal influenza A WGS samples in the context of laboratory surveillance of viral outbreaksPublication . Pereira, João Luís Gomes; Sobral, Daniel Vieira Noro e Silva; Couto, Francisco José MoreiraBackground: Influenza A viruses (IAV) are rapidly evolving pathogens with high zoonotic and pandemic potential. Their segmented genome allows antigenic drift and reassortment, key drivers of adaptation and cross-species transmission. The ongoing H5Nx panzootic underscores the need for timely genomic surveillance to detect adaptive mutations, reassortments, and antiviral resistance. Existing frameworks such as the INSaFLU-TELEVIR platform, work well for seasonal strains but face challenges with non-seasonal IAV due to reference selection, representation bias, and database redundancies. Objectives: This project aimed to develop an automated pipeline for the genetic characterization of non-seasonal IAV whole-genome sequencing (WGS) samples. Goals were: (1) accurate identification of genomic segments, subtypes/genotypes, host origins and closely-related reference sequences per segment; (2) characterization of mutations of biological relevance, including host adaptation and antiviral resistance; (3) integration of results into user-friendly and machine-readable outputs. Methods: The pipeline, named AFluID (Automatic Influenza Identification pipeline), was implemented in Python and combined clustering (cd-hit), similarity search (BLAST), clade assignment (Nextclade), and mutation screening (FluMut). It was validated on curated datasets from NCBI, GISAID, EQA panels, and Portuguese outbreak samples resulting from an INSA-INIAV-IP cooperation. Results: AFluID rapidly identified IAV segments and subtypes across datasets, while its multi-feature design further streamlined the identification of closely-related references (and detection of reassortment events), along with clade classification, host/geographic inference, and identification of mutations potentially linked to adaptation, virulence, and resistance. Proof-of-concept analysis of outbreak samples confirmed applicability in real surveillance scenarios. Conclusions: AFluID addresses major limitations of current pipelines by offering an automated, scalable, and reproducible framework tailored for non-seasonal IAV. Although reassortment detection requires further refinement, the pipeline strengthens laboratory surveillance capacity and represents a step toward integration with global frameworks such as INSaFLU.
- Desenvolvimento de uma metodologia para sequenciação de regiões altamente polimórficas de HCMV para avaliação dos perfis mutacionais da população viralPublication . Carrasqueira, Patrícia Isabel Barreiros; Ferreira, Rita; Paixão, Paulo; Chasqueira, Maria de JesusO citomegalovírus humano (HCMV, do inglês human cytomegalovirus) possui um genoma de ~236 kb sendo o herpesvírus que causa infeções no Homem com maior diversidade genética conhecida. Apesar dos inúmeros esforços para associar os polimorfismos virais e a diversidade da população intra- paciente com o aumento da aptidão viral, com os resultados clínicos e com a latência, as correlações permanecem inconclusivas. Neste estudo, foi desenvolvido um ensaio de tilling PCR multiplex para a sequenciação simultânea de múltiplas regiões genómicas hipervariáveis do HCMV, com o objetivo de caracterizar o polimorfismo deste vírus. Para tirar partido do potencial da sequenciação direcionada de última geração (tNGS, do inglês targeted next-generation sequencing), foi concebida uma tilling PCR multiplex para amplificação de ~ 8% do genoma de HCMV em 7 regiões discretas abrangendo 14 loci polimórficos de interesse (UL33, UL55, UL73, UL74, UL75, UL100, UL115, UL128, UL130, UL131A, UL144, UL146, UL147 e UL147A). Esta abordagem teve por base o desenho de 145 primers diferentes que em conjunto originam 51 amplicões. A otimização de todo o workflow foi realizada tanto ao nível técnico como ao nível da análise bioinformática, com resultados muito promissores. A metodologia foi aplicada a um conjunto de 30 amostras clínicas, tendo-se verificado que cinco apresentavam resultados compatíveis com infeções mistas, sendo que nenhuma destas provinha de infeções congénitas. Da sequenciação das 7 regiões das restantes 25 amostras resultaram sequências consensus de elevada qualidade para a maior parte delas correspondendo a uma elevada taxa de sucesso de 92.6% (162/175). De notar que embora o sucesso da metodologia tenda a diminuir com menores cargas virais foi total mesmo para amostras clínicas com carga viral mais baixa (Ct>25). Verificou-se ainda que, tanto ao nível das sequências concatenadas como gene-a-gene, as amostras clínicas portuguesas não só apresentavam variabilidade genética idêntica à já identificada no conjunto global das sequências retiradas do NCBI (n = 344) como apresentavam diferentes níveis de diversidade entre si. Por fim, focando a análise de polimorfismo em pares de amostras de 3 hospedeiros diferentes verificou-se que estas não apresentavam quaisquer diferenças entre si. Em conclusão a metodologia desenvolvida abre perspetivas promissoras para investigações futuras, que permitam estudar a relação entre polimorfismos do HCMV, a sua aptidão viral e correlacioná-los com os desfechos clínicos.
- Investigação laboratorial do vírus monkeypox e avaliação das medidas de biossegurança nos laboratórios em PortugalPublication . Francisco, Rafaela Maria da Costa Godinho Dias; Cordeiro, Rita; Barroso, Maria HelenaO vírus monkeypox (MPXV), pertencente ao género Orthopoxvirus (OPXV), emergiu como um agente patogénico de relevância crescente devido à sua capacidade de transmissão sustentada fora das regiões endémicas e ao declínio da imunidade populacional após a interrupção da vacinação contra a varíola. Na sequência do surto multinacional de 2022 e da continuidade de novas cadeias de transmissão nos anos seguintes, tornou-se essencial reforçar a investigação virológica, epidemiológica e serológica, bem como avaliar de forma sistemática as condições de biossegurança e bioproteção nos laboratórios de referência. Este trabalho teve como objetivos: analisar os aspetos epidemiológicos, virológicos e genómicos dos casos suspeitos e confirmados durante o terceiro surto de mpox registado em Portugal; avaliar o potencial de diagnóstico clínico incorreto com varicela durante o primeiro surto; determinar a resposta serológica IgG anti-OPXV em indivíduos com e sem confirmação laboratorial de mpox; e caracterizar as práticas de biossegurança e bioprotecção em laboratórios portugueses, incluindo laboratórios BSL-3. Os resultados revelaram a circulação de múltiplas sublinhagens do clade IIb, demonstrando que o surto resultou de várias introduções independentes. Verificou-se um predomínio de casos em homens adultos jovens e maior positividade em exsudados de lesão. A investigação do diagnóstico diferencial mostrou que uma proporção significativa das amostras inicialmente suspeitas correspondia a infeções por VZV. A análise serológica evidenciou variação dos títulos de IgG entre grupos etários e clínicos, destacando a influência da imunidade prévia à varíola nos indivíduos mais velhos. A avaliação da biossegurança e bioproteção identificou níveis heterogéneos de maturidade e áreas prioritárias de melhoria, especialmente nos sistemas de gestão e nas práticas de resposta a emergências. Globalmente, este estudo contribui para o reforço da vigilância laboratorial e epidemiológica da mpox em Portugal, fornecendo evidência científica crucial para a preparação e resposta a futuras emergências biológicas. Os resultados sublinham ainda a importância estratégica da biossegurança e bioproteção na manipulação de agentes emergentes e na mitigação dos riscos associados.
- Pesquisa de bactérias entéricas multirresistentes em perus produzidos para consumo humano - Existe risco para a Saúde Pública?Publication . Martins, Margarida Isidro; Pista, Ângela; Pina, FranciscoAs doenças de origem alimentar constituem um grave problema de saúde pública, e os produtos alimentares de origem animal são uma das principais fontes de contaminação. Igualmente preocupante é o aumento de estirpes multirresistentes. Este estudo teve como objetivo analisar o papel dos perus enquanto reservatórios e potenciais fontes de transmissão de Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. e Shigella spp. ao Homem, através do isolamento e caracterização fenotípica e genotípica destas bactérias de fezes (n = 108) e carnes cruas de peru (n = 33), em Portugal. Em nenhuma das matrizes foi isolada Shigella spp., enquanto Salmonella spp. foi apenas isolada numa amostra de fezes (0,9%). Isolou-se E. coli em todas as amostras de fezes e em 90,9% das amostras de carne. E. coli enteropatogénica foi identificada em 0,9% dos isolados de fezes. Os 138 isolados de E. coli sequenciados apresentaram genes de virulência de E. coli patogénica extraintestinal e 31,2% foram classificados como E. coli patogénica aviária. Foi observada uma grande diversidade de serotipos e sequências tipo. Salmonella Newport foi suscetível aos antibióticos testados. Em E. coli, foram observadas resistências em 74,1% dos isolados de fezes e 90,0% dos de carne, e, respetivamente, 52,8% e 70,0% foram multirresistentes. No geral, as resistências mais frequentes foram à ampicilina, tetraciclina e ciprofloxacina, e foram identificados cinco isolados produtores de beta-lactamases de espetro alargado. Oito isolados de E. coli apresentaram genes de resistência para a colistina (mcr-1.1). A análise filogenética dos isolados de E. coli permitiu identificar 13 clusters. Foi identificado um cluster entre o isolado de Salmonella Newport e outro isolado nacional. Os resultados deste estudo realçam o papel dos perus como uma potencial fonte de doenças zoonóticas para o Homem e a importância da abordagem One Health, de forma a garantir a segurança alimentar e promover a saúde pública.
- Genotipagem de isolados de Aspergillus fumigatus de origem clínica e ambientalPublication . Morais, Susana; Sabino, Raquel; Barata, MargaridaAspergillus fumigatus é um fungo sapróbio, ubíquo no ambiente, com crescente importância clínica para a saúde humana, pois é responsável por provocar, entre outras patologias, infeções invasivas graves, especialmente em indivíduos imunocomprometidos. Dada a elevada taxa de mortalidade associada às infeções relacionadas com este fungo, bem como a emergência de um grave problema de resistência aos antifúngicos triazóis utilizados como primeira linha de tratamento nestas, torna-se importante perceber a sua dinâmica no ambiente e no organismo humano. Além disso, o aparecimento de novos grupos de risco aos quais a infeção está associada, tem vindo a levantar também uma crescente preocupação no que toca aos critérios para diagnóstico e tratamento da doença, que ainda representam um desafio. O conhecimento da epidemiologia do fungo permite uma melhor perceção das suas interações com o ambiente e com o Homem, tornando esta área de elevada importância no contexto da relevância crescente de Aspergillus fumigatus na clínica. No presente estudo, foi utilizada uma técnica robusta de genotipagem, específica para Aspergillus fumigatus sensu stricto, o ensaio STRAf, que permite distinguir diferentes estirpes desta espécie, através da amplificação de loci específicos numa reação de amplificação multiplex com primers marcados com fluorescência. Com o ensaio realizado foi possível comprovar a grande variabilidade genética de Aspergillus fumigatus, tendo-se observado 85 genótipos de entre os 100 isolados viáveis analisados. Foi também possível perceber a interação entre alguns dos isolados em estudo. A técnica revelou, como esperado, um elevado poder discriminatório (0,9820) o que confirma a sua utilidade em futuros estudos epidemiológicos de grande escala, essenciais para melhor entender como abordar a problemática crescente que este fungo tem representado.
- Molecular studies on HSV: replication rate, infection capacity and progenyPublication . Azevedo, Aleksandra; Lopo, Sílvia; Nunes, AlexandraHerpes simplex viruses (HSV) are ubiquitous host-adapted pathogens that cause a variety of different disorders. There are two sub-types: HSV-1, which is traditionally associated with oro-facial infections, and HSV-2 that is mostly associated with genital ulcers. This distinction, however, is becoming less evident since HSV-1 frequency in genital infections is increasing due to social, demographic and migratory tendencies, making genital herpes one of the most prevalent sexually transmitted infections worldwide. A better understanding on genital HSV-1 and HSV-2 infections is mandatory to the pathogenesis of human herpes disease. The scope of this thesis was to evaluate the life cycle of various HSV-1 and HSV-2 genital clinical isolates with different viral loads in three distinct host cell lines, giving special focus on both capacity and efficiency of viral infection, in terms of replication rate and progeny. Our results showed that: i) both HSV-1 and HSV-2 isolates exhibited similar infection patterns regardless MOI, with DNA starting to be synthesized nearly at 6-12h post-infection; ii) regardless HSV subtype, initial viral concentrations do not apparently affect adherence to any host cell line nor the generated progeny; iii) Vero E6 cells seemed the most appropriated cell line for HSV-2 infection; iv) HeLa229 cells appeared to be the most suitable for HSV-1 infection for smaller inoculums; and v) Vero cell line had the worst viral growth results for both HSV subtypes. In general, HSV-2 displayed always lower both attachment capacities and growth rates than HSV-1, although higher progenies were seen in Vero E6 cell line. Overall, the findings presented in this MSc thesis will certainly constitute a step forward for the understanding of the pathogenesis of the human herpes genital infections.
- Avaliação da resistência de Trichophyton rubrum ao antifúngico terbinafina e caracterização fenotípica e genotípica de fungos dermatófitosPublication . Henriques, Camila Valadas; Sabino, Raquel; Dias, DeodáliaOs dermatófitos são um grupo de fungos filamentosos com uma distribuição cosmopolita, que têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados (pele, cabelo e unhas) de humanos e outros animais e provocar uma infeção superficial denominada de dermatofitose. As dermatofitoses são responsáveis por 3 - 4% dos casos afeções dermatológicas, sendo a infeção superficial mais comum em humanos (com uma prevalência entre os 20-25%). No entanto, espera-se que a sua prevalência continue a aumentar devido ao aparecimento de novos fatores de risco. As espécies do género Trichophyton são os principais agentes causadores de patologias como pé de atleta e onicomicose nas mãos e pés e estima-se que afete ~1.000.000.000 de pessoas em todo o mundo. T. rubrum e T. interdigitale são os principais agentes etiológicos com prevalências de 80% e 20%, respetivamente. Em Portugal, é estimado que 1.510.391 de portugueses sofram de dermatofitoses, correspondendo a uma incidência de 14.300 infeções por dermatófitos por cada 1.000.000 de habitantes. Para o tratamento das dermatofitoses, a primeira terapia a ser prescrita é, na grande maioria dos casos, a terbinafina. Desde 2017 que os casos de resistência a este antifúngico por parte de T. rubrum e T. interdigitale têm vindo a aumentar gradualmente. Os mecanismos de resistência à terbinafina são, essencialmente, descritos como mutações pontuais no gene que codifica a esqualeno epoxidase. Assim, neste estudo, procurámos perceber se a problemática de resistência ao antifúngico terbinafina em T. rubrum e T. interdigitale estaria ou não negligenciada em Portugal. Cento e sessenta e quatro isolados de T. rubrum e T. interdigitale foram identificados até à espécie através de tecnologias moleculares e também com recurso a espectoctrometria de massa (MALDI-TOF). De seguida, verificámos a presença da resistência ao antifúngico terbinafina nestes isolados e pesquisámos as mutações associadas a essa mesma resistência. Para tal, procedemos à otimização e implementação de metodologias que permitiram efetuar a avaliação da resistência de isolados de T. rubrum e T. interdigitale, quer por método cultural quer por metodologias moleculares com sequenciação do gene da esqualeno epoxidase (SQLE) seguida de deteção de mutações neste gene que conferem resistência a este composto. A caracterização dos padrões de suscetibilidade ao antifúngico terbinafina foi feita recorrendo a meios de screening (agar suplementado com terbinafina) e ao método das microdiluições em caldo. Numa primeira abordagem, de 102 isolados de T. rubrum, apenas 1 isolado (nº126) revelou ser resistente á terbinafina por meio de screening e dos 17 isolados T. interdigitale, apenas 3 demonstraram ser resistentes à terbinafina por meio de screening em ambas as concentrações utilizadas definidas pela norma EUCAST (0.06 mg/L e 0.125 mg/L). De acordo com a metodologia das microdiluições, 2,44% dos isolados apresentaram menor suscetibilidade à terbinafina. Os nossos resultados demonstram que o isolado nº126 (T. rubrum) revelou ser bastante resistente à terbinafina com uma CMI de 8 mg/L, os isolados nº 63 e nº94 (T. interdigitale) apresentaram CMIs superiores a 8 mg/L o que representa uma baixa suscetibilidade à terbinafina. O isolado T. interdigitale nº 59 apresentou uma CMI igual a 1 mg/L o que revela uma resistência moderada à terbinafina. A otimização da PCR de amplificação e sequenciação do gene da SQLE de T. rubrum e T. interdigitale permitiu a deteção de mutações pontuais apenas num isolado de cada espécie num total de quatro isolados classificados como resistentes. O isolado T. rubrum nº126, após análise da sequência do gene da SQLE, apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE o que corresponde a uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma isoleucina. Apesar de as substituições mais comuns e que levam a uma maior resistência à terbinafina serem L393F e F397L, a substituição F397I detetada no isolado T. rubrum deste estudo, sugere causar uma elevada resistência à terbinafina. Relativamente aos isolados resistentes T. interdigitale, apenas o isolado nº 94 apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE, ocorrendo uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma leucina, o que confirma a sua CMI superior a 8 mg/L. Nos restantes isolados resistentes pertencentes à espécie T. interdigitale, não foram encontradas quaisquer mutações no gene que codifica a SQLE. Este estudo, permitiu-nos efetuar uma caracterização da população amostrada, das amostras biológicas e dos isolados do género Trichophyton obtidos por cultura destas amostras. Foi também possível detetar, pela primeira vez, isolados do género Trichophyton resistentes à terbinafina em Portugal. Foi ainda possível estimar, dentro dos isolados estudados, uma frequência de resistência de 2,44%. A resistência à terbinafina por parte de T. rubrum e T. interdigitale é um problema real em todo o mundo e estima-se que os casos continuem em aumentar e por isso acreditamos que, a aplicação do método de screening e das microdiluições bem como a implementação da reação de PCR para pesquisa de mutações que conferem essa mesma resistência será uma mais valia e um contributo importante no que toca ao diagnóstico e posterior terapia das dermatofitoses reportadas em Portugal.
- Epidemiologia e frequência de Aspergillus em doentes com suspeita de patologia respiratória fúngicaPublication . Oliveira, Mariana; Sabino, Raquel; Rebelo, Maria TeresaO género Aspergillus é composto por centenas de espécies de fungos ubíquos que são agentes patogénicos oportunistas do ser humano, particularmente dos indivíduos imunocomprometidos e/ou com danos estruturais nos pulmões resultado de patologias prévias como tuberculose pulmonar. Aspergilose é o nome dado ao espetro de patologias causadas por Aspergillus e que se estendem desde a reação hipersensível do hospedeiro aos fungos até à infeção invasiva cuja taxa de letalidade é elevada. O tratamento destas patologias depende essencialmente dos antifúngicos da classe dos azóis, contudo a emergência de resistência por A. fumigatus sensu stricto assim como a resistência intrínseca das espécies crípticas pode comprometer esta terapêutica. O diagnóstico de aspergilose está dependente da deteção laboratorial direta e/ou indireta de Aspergillus nas amostras biológicas dos pacientes através das técnicas culturais e imunoenzimáticas, mas a sensibilidade e a especificidade destas técnicas varia amplamente. Posto isto, este trabalho foi realizado com os seguintes objetivos: (i) a vigilância de Aspergillus em pacientes com sintomas de patologia respiratória fúngica, nomeadamente em grupos de risco de aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia) e (ii) a otimização da deteção molecular de Aspergillus e/ou de outros fungos potencialmente patogénicos através de PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e de técnicas de next generation sequencing, respetivamente. No âmbito do estudo da epidemiologia de aspergilose em doentes com suspeita de infeção fúngica do trato respiratório foram analisadas retrospetivamente as amostras respiratórias de 146 pacientes que se encontravam conservadas no Laboratório Nacional de Referência de Infeções Parasitárias e Fúngicas. Cinquenta e sete destes pacientes (39,0%) foram positivos para Aspergillus através das técnicas cultural, imunoenzimática e molecular. Cinquenta e oito colónias de Aspergillus foram isoladas e identificadas através de sequenciação dos genes para a calmodulina ou a β-tubulina e por PCR em tempo real. Detetaram-se 6 secções de Aspergillus distintas, sendo a mais frequente a Nigri (42,1%) seguida de Fumigati (33,3%) e de Flavi (8,6%). Quanto às espécies, as mais frequentemente identificadas foram A. niger sensu stricto (33,9%) seguida de A. fumigatus sensu stricto (32,1%). Identificaram-se também 9 espécies crípticas cuja frequência foi 21,4%. Paralelamente ao estudo epidemiológico indicado, analisou-se o perfil de suscetibilidade aos azóis de Aspergillus da secção Fumigati que haviam sido isolados de produtos respiratórios e conservados em coleção de culturas no âmbito do programa de Vigilância em Aspergillus. Os isolados identificados como Aspergillus fumigatus sensu stricto (n=45), A. lentulus (n=4), A. udagawae (n=2) e A. pseudofelis (n=1) foram inoculados em meios de screening com voriconazol, itraconazol e posaconazol e o seu crescimento foi caracterizado. Os resultados foram corroborados pelas técnicas de E-test e através de PCR multiplex em tempo real para deteção de mutações no gene Cyp51A. Nenhum isolado de A. fumigatus sensu stricto revelou resistência aos azóis, mas foi detetada menor suscetibilidade ao voriconazol num isolado da espécie A. udagawae e ao voriconazol (CMI = 1 μg/ml) e ao itraconazol (CMI = 2 μg/ml) em A. pseudofelis. Com o objetivo de comparar os resultados obtidos por técnicas convencionais com os das técnicas moleculares, o DNA extraído do sobrenadante de 44 amostras respiratórias que haviam sido previamente analisadas através de ELISA para deteção de galactomanano e/ou pela técnica cultural foi sujeito ao PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e compararam-se os resultados obtidos pelas várias técnicas. Verificou-se que o PCR multiplex em tempo real permitiu obter uma taxa de positividade superior à das técnicas convencionais de diagnóstico de aspergilose, particularmente nos pacientes em risco de desenvolver aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia). Procedeu-se também à otimização da amplificação e vii sequenciação por técnicas de next generation sequencing da região ITS e do gene calmodulina do DNA extraído de amostras respiratórias. Este estudo piloto de análise metagenómica permitiu detetar os fungos Pneumocystis e Cryptococcus mo micobioma dos pacientes VIH positivo que frequentemente desenvolvem pneumocistose e criptococose. Detetaram-se também outros fungos potencialmente patogénicos nomeadamente dos géneros Aspergillus, Trichosporon, Saccharomyces e Schizophyllum. Conclui-se assim que a distribuição de Aspergillus é complexa e diversa e que a resistência aos azóis não aparenta ser um problema nas estirpes analisadas, contudo a monitorização contínua é fundamental. Essa monitorização deve incluir não só as técnicas de determinação do perfil de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos como a identificação molecular das espécies, particularmente devido à elevada frequência com que as espécies crípticas foram detetadas neste trabalho assim como a resistência intrínseca aos antifúngicos que algumas delas apresentaram. Conclui-se também que as técnicas moleculares têm uma grande capacidade de detetar rápida e eficazmente fungos potencialmente patogénicos nas amostras biológicas humanas pelo que esforços para a sua otimização, padronização e validação clínica devem ser realizados no futuro.
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