DDI - Dissertações de mestrado
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- Pesquisa de bactérias entéricas multirresistentes em perus produzidos para consumo humano - Existe risco para a Saúde Pública?Publication . Martins, Margarida Isidro; Pista, Ângela; Pina, FranciscoAs doenças de origem alimentar constituem um grave problema de saúde pública, e os produtos alimentares de origem animal são uma das principais fontes de contaminação. Igualmente preocupante é o aumento de estirpes multirresistentes. Este estudo teve como objetivo analisar o papel dos perus enquanto reservatórios e potenciais fontes de transmissão de Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. e Shigella spp. ao Homem, através do isolamento e caracterização fenotípica e genotípica destas bactérias de fezes (n = 108) e carnes cruas de peru (n = 33), em Portugal. Em nenhuma das matrizes foi isolada Shigella spp., enquanto Salmonella spp. foi apenas isolada numa amostra de fezes (0,9%). Isolou-se E. coli em todas as amostras de fezes e em 90,9% das amostras de carne. E. coli enteropatogénica foi identificada em 0,9% dos isolados de fezes. Os 138 isolados de E. coli sequenciados apresentaram genes de virulência de E. coli patogénica extraintestinal e 31,2% foram classificados como E. coli patogénica aviária. Foi observada uma grande diversidade de serotipos e sequências tipo. Salmonella Newport foi suscetível aos antibióticos testados. Em E. coli, foram observadas resistências em 74,1% dos isolados de fezes e 90,0% dos de carne, e, respetivamente, 52,8% e 70,0% foram multirresistentes. No geral, as resistências mais frequentes foram à ampicilina, tetraciclina e ciprofloxacina, e foram identificados cinco isolados produtores de beta-lactamases de espetro alargado. Oito isolados de E. coli apresentaram genes de resistência para a colistina (mcr-1.1). A análise filogenética dos isolados de E. coli permitiu identificar 13 clusters. Foi identificado um cluster entre o isolado de Salmonella Newport e outro isolado nacional. Os resultados deste estudo realçam o papel dos perus como uma potencial fonte de doenças zoonóticas para o Homem e a importância da abordagem One Health, de forma a garantir a segurança alimentar e promover a saúde pública.
- Genotipagem de isolados de Aspergillus fumigatus de origem clínica e ambientalPublication . Morais, Susana; Sabino, Raquel; Barata, MargaridaAspergillus fumigatus é um fungo sapróbio, ubíquo no ambiente, com crescente importância clínica para a saúde humana, pois é responsável por provocar, entre outras patologias, infeções invasivas graves, especialmente em indivíduos imunocomprometidos. Dada a elevada taxa de mortalidade associada às infeções relacionadas com este fungo, bem como a emergência de um grave problema de resistência aos antifúngicos triazóis utilizados como primeira linha de tratamento nestas, torna-se importante perceber a sua dinâmica no ambiente e no organismo humano. Além disso, o aparecimento de novos grupos de risco aos quais a infeção está associada, tem vindo a levantar também uma crescente preocupação no que toca aos critérios para diagnóstico e tratamento da doença, que ainda representam um desafio. O conhecimento da epidemiologia do fungo permite uma melhor perceção das suas interações com o ambiente e com o Homem, tornando esta área de elevada importância no contexto da relevância crescente de Aspergillus fumigatus na clínica. No presente estudo, foi utilizada uma técnica robusta de genotipagem, específica para Aspergillus fumigatus sensu stricto, o ensaio STRAf, que permite distinguir diferentes estirpes desta espécie, através da amplificação de loci específicos numa reação de amplificação multiplex com primers marcados com fluorescência. Com o ensaio realizado foi possível comprovar a grande variabilidade genética de Aspergillus fumigatus, tendo-se observado 85 genótipos de entre os 100 isolados viáveis analisados. Foi também possível perceber a interação entre alguns dos isolados em estudo. A técnica revelou, como esperado, um elevado poder discriminatório (0,9820) o que confirma a sua utilidade em futuros estudos epidemiológicos de grande escala, essenciais para melhor entender como abordar a problemática crescente que este fungo tem representado.
- Molecular studies on HSV: replication rate, infection capacity and progenyPublication . Azevedo, Aleksandra; Lopo, Sílvia; Nunes, AlexandraHerpes simplex viruses (HSV) are ubiquitous host-adapted pathogens that cause a variety of different disorders. There are two sub-types: HSV-1, which is traditionally associated with oro-facial infections, and HSV-2 that is mostly associated with genital ulcers. This distinction, however, is becoming less evident since HSV-1 frequency in genital infections is increasing due to social, demographic and migratory tendencies, making genital herpes one of the most prevalent sexually transmitted infections worldwide. A better understanding on genital HSV-1 and HSV-2 infections is mandatory to the pathogenesis of human herpes disease. The scope of this thesis was to evaluate the life cycle of various HSV-1 and HSV-2 genital clinical isolates with different viral loads in three distinct host cell lines, giving special focus on both capacity and efficiency of viral infection, in terms of replication rate and progeny. Our results showed that: i) both HSV-1 and HSV-2 isolates exhibited similar infection patterns regardless MOI, with DNA starting to be synthesized nearly at 6-12h post-infection; ii) regardless HSV subtype, initial viral concentrations do not apparently affect adherence to any host cell line nor the generated progeny; iii) Vero E6 cells seemed the most appropriated cell line for HSV-2 infection; iv) HeLa229 cells appeared to be the most suitable for HSV-1 infection for smaller inoculums; and v) Vero cell line had the worst viral growth results for both HSV subtypes. In general, HSV-2 displayed always lower both attachment capacities and growth rates than HSV-1, although higher progenies were seen in Vero E6 cell line. Overall, the findings presented in this MSc thesis will certainly constitute a step forward for the understanding of the pathogenesis of the human herpes genital infections.
- Avaliação da resistência de Trichophyton rubrum ao antifúngico terbinafina e caracterização fenotípica e genotípica de fungos dermatófitosPublication . Henriques, Camila Valadas; Sabino, Raquel; Dias, DeodáliaOs dermatófitos são um grupo de fungos filamentosos com uma distribuição cosmopolita, que têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados (pele, cabelo e unhas) de humanos e outros animais e provocar uma infeção superficial denominada de dermatofitose. As dermatofitoses são responsáveis por 3 - 4% dos casos afeções dermatológicas, sendo a infeção superficial mais comum em humanos (com uma prevalência entre os 20-25%). No entanto, espera-se que a sua prevalência continue a aumentar devido ao aparecimento de novos fatores de risco. As espécies do género Trichophyton são os principais agentes causadores de patologias como pé de atleta e onicomicose nas mãos e pés e estima-se que afete ~1.000.000.000 de pessoas em todo o mundo. T. rubrum e T. interdigitale são os principais agentes etiológicos com prevalências de 80% e 20%, respetivamente. Em Portugal, é estimado que 1.510.391 de portugueses sofram de dermatofitoses, correspondendo a uma incidência de 14.300 infeções por dermatófitos por cada 1.000.000 de habitantes. Para o tratamento das dermatofitoses, a primeira terapia a ser prescrita é, na grande maioria dos casos, a terbinafina. Desde 2017 que os casos de resistência a este antifúngico por parte de T. rubrum e T. interdigitale têm vindo a aumentar gradualmente. Os mecanismos de resistência à terbinafina são, essencialmente, descritos como mutações pontuais no gene que codifica a esqualeno epoxidase. Assim, neste estudo, procurámos perceber se a problemática de resistência ao antifúngico terbinafina em T. rubrum e T. interdigitale estaria ou não negligenciada em Portugal. Cento e sessenta e quatro isolados de T. rubrum e T. interdigitale foram identificados até à espécie através de tecnologias moleculares e também com recurso a espectoctrometria de massa (MALDI-TOF). De seguida, verificámos a presença da resistência ao antifúngico terbinafina nestes isolados e pesquisámos as mutações associadas a essa mesma resistência. Para tal, procedemos à otimização e implementação de metodologias que permitiram efetuar a avaliação da resistência de isolados de T. rubrum e T. interdigitale, quer por método cultural quer por metodologias moleculares com sequenciação do gene da esqualeno epoxidase (SQLE) seguida de deteção de mutações neste gene que conferem resistência a este composto. A caracterização dos padrões de suscetibilidade ao antifúngico terbinafina foi feita recorrendo a meios de screening (agar suplementado com terbinafina) e ao método das microdiluições em caldo. Numa primeira abordagem, de 102 isolados de T. rubrum, apenas 1 isolado (nº126) revelou ser resistente á terbinafina por meio de screening e dos 17 isolados T. interdigitale, apenas 3 demonstraram ser resistentes à terbinafina por meio de screening em ambas as concentrações utilizadas definidas pela norma EUCAST (0.06 mg/L e 0.125 mg/L). De acordo com a metodologia das microdiluições, 2,44% dos isolados apresentaram menor suscetibilidade à terbinafina. Os nossos resultados demonstram que o isolado nº126 (T. rubrum) revelou ser bastante resistente à terbinafina com uma CMI de 8 mg/L, os isolados nº 63 e nº94 (T. interdigitale) apresentaram CMIs superiores a 8 mg/L o que representa uma baixa suscetibilidade à terbinafina. O isolado T. interdigitale nº 59 apresentou uma CMI igual a 1 mg/L o que revela uma resistência moderada à terbinafina. A otimização da PCR de amplificação e sequenciação do gene da SQLE de T. rubrum e T. interdigitale permitiu a deteção de mutações pontuais apenas num isolado de cada espécie num total de quatro isolados classificados como resistentes. O isolado T. rubrum nº126, após análise da sequência do gene da SQLE, apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE o que corresponde a uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma isoleucina. Apesar de as substituições mais comuns e que levam a uma maior resistência à terbinafina serem L393F e F397L, a substituição F397I detetada no isolado T. rubrum deste estudo, sugere causar uma elevada resistência à terbinafina. Relativamente aos isolados resistentes T. interdigitale, apenas o isolado nº 94 apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE, ocorrendo uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma leucina, o que confirma a sua CMI superior a 8 mg/L. Nos restantes isolados resistentes pertencentes à espécie T. interdigitale, não foram encontradas quaisquer mutações no gene que codifica a SQLE. Este estudo, permitiu-nos efetuar uma caracterização da população amostrada, das amostras biológicas e dos isolados do género Trichophyton obtidos por cultura destas amostras. Foi também possível detetar, pela primeira vez, isolados do género Trichophyton resistentes à terbinafina em Portugal. Foi ainda possível estimar, dentro dos isolados estudados, uma frequência de resistência de 2,44%. A resistência à terbinafina por parte de T. rubrum e T. interdigitale é um problema real em todo o mundo e estima-se que os casos continuem em aumentar e por isso acreditamos que, a aplicação do método de screening e das microdiluições bem como a implementação da reação de PCR para pesquisa de mutações que conferem essa mesma resistência será uma mais valia e um contributo importante no que toca ao diagnóstico e posterior terapia das dermatofitoses reportadas em Portugal.
- Epidemiologia e frequência de Aspergillus em doentes com suspeita de patologia respiratória fúngicaPublication . Oliveira, Mariana; Sabino, Raquel; Rebelo, Maria TeresaO género Aspergillus é composto por centenas de espécies de fungos ubíquos que são agentes patogénicos oportunistas do ser humano, particularmente dos indivíduos imunocomprometidos e/ou com danos estruturais nos pulmões resultado de patologias prévias como tuberculose pulmonar. Aspergilose é o nome dado ao espetro de patologias causadas por Aspergillus e que se estendem desde a reação hipersensível do hospedeiro aos fungos até à infeção invasiva cuja taxa de letalidade é elevada. O tratamento destas patologias depende essencialmente dos antifúngicos da classe dos azóis, contudo a emergência de resistência por A. fumigatus sensu stricto assim como a resistência intrínseca das espécies crípticas pode comprometer esta terapêutica. O diagnóstico de aspergilose está dependente da deteção laboratorial direta e/ou indireta de Aspergillus nas amostras biológicas dos pacientes através das técnicas culturais e imunoenzimáticas, mas a sensibilidade e a especificidade destas técnicas varia amplamente. Posto isto, este trabalho foi realizado com os seguintes objetivos: (i) a vigilância de Aspergillus em pacientes com sintomas de patologia respiratória fúngica, nomeadamente em grupos de risco de aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia) e (ii) a otimização da deteção molecular de Aspergillus e/ou de outros fungos potencialmente patogénicos através de PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e de técnicas de next generation sequencing, respetivamente. No âmbito do estudo da epidemiologia de aspergilose em doentes com suspeita de infeção fúngica do trato respiratório foram analisadas retrospetivamente as amostras respiratórias de 146 pacientes que se encontravam conservadas no Laboratório Nacional de Referência de Infeções Parasitárias e Fúngicas. Cinquenta e sete destes pacientes (39,0%) foram positivos para Aspergillus através das técnicas cultural, imunoenzimática e molecular. Cinquenta e oito colónias de Aspergillus foram isoladas e identificadas através de sequenciação dos genes para a calmodulina ou a β-tubulina e por PCR em tempo real. Detetaram-se 6 secções de Aspergillus distintas, sendo a mais frequente a Nigri (42,1%) seguida de Fumigati (33,3%) e de Flavi (8,6%). Quanto às espécies, as mais frequentemente identificadas foram A. niger sensu stricto (33,9%) seguida de A. fumigatus sensu stricto (32,1%). Identificaram-se também 9 espécies crípticas cuja frequência foi 21,4%. Paralelamente ao estudo epidemiológico indicado, analisou-se o perfil de suscetibilidade aos azóis de Aspergillus da secção Fumigati que haviam sido isolados de produtos respiratórios e conservados em coleção de culturas no âmbito do programa de Vigilância em Aspergillus. Os isolados identificados como Aspergillus fumigatus sensu stricto (n=45), A. lentulus (n=4), A. udagawae (n=2) e A. pseudofelis (n=1) foram inoculados em meios de screening com voriconazol, itraconazol e posaconazol e o seu crescimento foi caracterizado. Os resultados foram corroborados pelas técnicas de E-test e através de PCR multiplex em tempo real para deteção de mutações no gene Cyp51A. Nenhum isolado de A. fumigatus sensu stricto revelou resistência aos azóis, mas foi detetada menor suscetibilidade ao voriconazol num isolado da espécie A. udagawae e ao voriconazol (CMI = 1 μg/ml) e ao itraconazol (CMI = 2 μg/ml) em A. pseudofelis. Com o objetivo de comparar os resultados obtidos por técnicas convencionais com os das técnicas moleculares, o DNA extraído do sobrenadante de 44 amostras respiratórias que haviam sido previamente analisadas através de ELISA para deteção de galactomanano e/ou pela técnica cultural foi sujeito ao PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e compararam-se os resultados obtidos pelas várias técnicas. Verificou-se que o PCR multiplex em tempo real permitiu obter uma taxa de positividade superior à das técnicas convencionais de diagnóstico de aspergilose, particularmente nos pacientes em risco de desenvolver aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia). Procedeu-se também à otimização da amplificação e vii sequenciação por técnicas de next generation sequencing da região ITS e do gene calmodulina do DNA extraído de amostras respiratórias. Este estudo piloto de análise metagenómica permitiu detetar os fungos Pneumocystis e Cryptococcus mo micobioma dos pacientes VIH positivo que frequentemente desenvolvem pneumocistose e criptococose. Detetaram-se também outros fungos potencialmente patogénicos nomeadamente dos géneros Aspergillus, Trichosporon, Saccharomyces e Schizophyllum. Conclui-se assim que a distribuição de Aspergillus é complexa e diversa e que a resistência aos azóis não aparenta ser um problema nas estirpes analisadas, contudo a monitorização contínua é fundamental. Essa monitorização deve incluir não só as técnicas de determinação do perfil de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos como a identificação molecular das espécies, particularmente devido à elevada frequência com que as espécies crípticas foram detetadas neste trabalho assim como a resistência intrínseca aos antifúngicos que algumas delas apresentaram. Conclui-se também que as técnicas moleculares têm uma grande capacidade de detetar rápida e eficazmente fungos potencialmente patogénicos nas amostras biológicas humanas pelo que esforços para a sua otimização, padronização e validação clínica devem ser realizados no futuro.
- Characterization and Biofilm Assessment of haemophilus influenzae Isolates from Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease and Otitis MediaPublication . Cunha Batista, Beatriz; Bajanca-Lavado, Maria Paula; Jordão, LuísaHaemophilus influenzae is a commensal microorganism of the human nasopharynx, responsible for both invasive and non-invasive diseases. This work focused on the study of 93 H. influenzae isolates, collected between 2013 and 2018, from patients with two epidemiologically relevant non-invasive diseases: Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and Otitis Media (OM). Phenotypical and molecular characterizations were performed for the isolates, regarding capsular typing, β-lactamase production, antibiotic susceptibility, genetic diversity by MLST, presence/absence of virulence factors (pilA, hifA, hmw1A, hmw2A, hia and ompP5) and ability to produce biofilms. COPD isolates were collected from adults (100%), while 98.2% of OM isolates were collected from children. Non-typeable H. influenzae (NTHi) was the aetiological agent in COPD (97.4%) and OM (100%). Regarding antibiotic susceptibility, it should be noticed that 15.1% of the isolates were β-lactamase producers. MLST revealed a high genetic diversity among COPD and OM isolates, with 31 STs in 41 analysed isolates. pilA and ompP5 genes were present in more than 50% of COPD and OM isolates. hifA and hia genes were identified in less than half of the isolates, with a higher prevalence of these among OM isolates. hmw1A and hmw2A genes were respectively identified in 25.5% and 32.7% of OM isolates, while both hmw genes were present in 76.3% of COPD isolates. Biofilm production was observed for 14.0% and 29.0% of all isolates after 24h and 48h, respectively. No relationship between biofilm production and clinical source could be established, as well as with the presence of virulence factors (pilA, hmw1A e hmw2A) involved in biofilm production. COPD and OM are frequently associated with NTHi. Since no vaccines are available, monitoring of these diseases is highly recommended, as these constitute a Public Health threat associated with a high economic and social burden.
- Aspergillus isolados em diferentes contextos indoor e ocupacionais: sua potencial relevância para a saúdePublication . Simões, Daniela; Sabino, Raquel; Deodália, Maria AntunesIntrodução: A exposição a elevadas concentrações de conídios fúngicos, nomeadamente do género Aspergillus, constitui um potencial fator de risco para o desenvolvimento de sintomas respiratórios em contextos ocupacionais e não-ocupacionais. Aspergillus fumigatus tem conídios de pequenas dimensões, com elevada capacidade de aerossolização e dispersão, sendo o principal agente responsável por aspergiloses brocopulmonares alérgicas, crónicas e invasivas. O seu elevado número de divisões mitóticas gera uma variada gama de mutações espontâneas que na presença de azóis pode originar estirpes com mutações que conferem resistência a estes antifúngicos. Na medicina, os azóis mais utilizados são os triazóis itraconazol, voriconazol e posaconazol, molecular e estruturalmente semelhantes aos fungicidas agrícolas propiconazol, tebuconazol, difenoconazol, epoxiconazol e bromuconazol, presentes em 60,9% dos fungicidas azóis permitidos em Portugal. Os ambientes interiores ocupacionais e não-ocupacionais podem ser ricos em elevadas concentrações de esporos e determinadas espécies de Aspergillus que podem eventualmente causar riscos respiratórios aos seus ocupantes. Os trabalhadores agrícolas estão expostos a grandes concentrações de bioaerossóis e, consequentemente, a maiores concentrações de microrganismos em suspensão no ar, apresentando uma maior prevalência de sintomas respiratórios comparativamente a habitantes urbanos. As estufas são ambientes com características microclimáticas ótimas para a formação de bioaerossóis, para o crescimento de fungos e seleção de isolados resistentes, aumentando o risco de desenvolvimento de sintomas respiratórios dos trabalhadores. Objetivos: Este estudo teve como objetivo conhecer a epidemiologia molecular das espécies de Aspergillus em diferentes contextos ocupacionais e não-ocupacionais e os padrões de suscetibilidade dos isolados de A. fumigatus. Foi ainda estudada a exposição a fungos em trabalhadores agrícolas (nomeadamente no ambiente específico das estufas). Por último, foi otimizada (e aplicada a isolados laboratoriais) uma metodologia para pesquisa de mutações no gene Cyp51A e seu promotor, em Aspergillus fumigatus. Materiais e Métodos: Foi feita uma amostragem do ar interior em estufas agrícolas e no exterior das estufas pelo método de sedimentação em placa. Os 19 isolados de Aspergillus provenientes das colheitas ambientais, 60 estirpes de Aspergillus ambientais recebidas do exterior e 5 estirpes de referência foram identificados por biologia molecular com recurso à sequenciação dos genes β-tubulina e calmodulina. A suscetibilidade de todos os isolados A. fumigatus foi testada por meios de screening com itraconazol (4μg/ml), voriconazol (1 ou 4μg/ml) e posaconazol (0,5μg/ml), com confirmação de falsos positivos por teste de suscetibilidade de difusão em gradiente. Foi otimizada a técnica de PCR e sequenciação do gene Cyp51A e do respetivo promotor, testando diferentes condições de forma a obter os melhores resultados de amplificação de A. fumigatus sensu stricto e com a máxima especificidade. A pesquisa de mutações no gene Cyp51A e seu promotor foi efetuada utilizando as reações otimizadas aplicadas às 5 estirpes de referência e 1 A. fumigatus isolado nas colheitas ambientais. Resultados: Os fungos que foram encontrados em maior quantidade e mais frequentemente em contexto agrícola pertencem aos géneros Cladosporium e Aspergillus. Foi encontrada uma maior diversidade e quantidade de esporos fúngicos em estufa do que no exterior, sendo a diferença entre o interior e o exterior estatisticamente significativa. As culturas de plantas aromáticas parecem estar associadas a uma maior exposição a esporos fúngicos. Foram também encontradas diferenças significativas relativamente à diversidade de géneros fúngicos consoante a cultura ou atividade em questão, nomeadamente a associação de Aspergillus spp., à apanha de alface. No que respeita aos outros ambientes ocupacionais estudados, ressalvam-se os trabalhadores da indústria de resíduos que se verificou estarem expostos principalmente a A. tubingensis enquanto a espécie de Aspergillus mais frequentemente encontrada nos restantes contextos foi A. fumigatus. Não foram encontradas resistências aos azóis testados. Conclusão: O estudo da epidemiologia molecular de Aspergillus isolados de diferentes contextos ocupacionais e não-ocupacionais permitiu encontrar um elevado número de espécies de Aspergillus. Nenhum dos isolados A. fumigatus apresentou resistência aos azóis clínicos testados. Os trabalhadores agrícolas quando desenvolvem as suas atividades no interior das estufas estão expostos a uma maior diversidade e quantidade de fungos, incluindo Aspergillus, do que no exterior. Nos ambientes estudados a espécie de Aspergillus mais frequentemente encontrada foi Aspergillus fumigatus, o que potencialmente aumenta o risco dos seus ocupantes desenvolverem sintomas respiratórios. Os agricultores e os trabalhadores da indústria de resíduos estão expostos principalmente a espécies crípticas do género Aspergillus. A otimização da metodologia para pesquisa de mutações no gene Cyp51A e no seu promotor de estirpes Aspergillus fumigatus sensu stricto permitiu detetar todas as mutações das estirpes resistentes utilizadas (com mutações conhecidas) e a sua aplicação numa estirpe ambiental, proveniente das recolhas ambientais no interior das estufas, resultou numa deteção bem-sucedida de mutações, não tendo sido encontradas, no entanto, mutações que conferem resistência.
- Molecular epidemiology and antibiotic resistance of Clostridium difficile: focus on toxin A-negative/toxin B-positive strains isolated in PortugalPublication . Menezes, Juliana; Oleastro, Mónica; Tenreiro, AnaClostridium difficile affects patients in hospitals and communities worldwide, is responsible for significant annual mortalities and represents a considerable economic burden on healthcare systems. This bacterium might also be carried asymptomatically in the gut, potentially leading to ‘silent’ onward transmission. Treatment has always been difficult, because the disease is both caused and resolved by antibiotic intake. The two main C. difficile virulence factors are toxins A and B, both of which are pro-inflammatory and enterotoxic in human intestine. Clinically relevant toxin A-negative/toxin B-positive strains that cause diarrhoea and colitis in humans have been isolated with increasing frequency worldwide, namely the multidrug resistant PCR-ribotype (RT) 017. Previous studies documented changes in C. difficile infection (CDI) epidemiology associated with the rapid emergence of antibiotic-resistant strains, highlighting the importance of antimicrobial susceptibility surveillance. The present work describes epidemiological and antimicrobial susceptibility data of C. difficile strains isolated in Portugal. A total of 378 C. difficile strains from 11 Portuguese hospital centres were characterized regarding toxin profile and RT, and part of these strains were also evaluated for its susceptibility to moxifloxacin, vancomycin, metronidazole, rifampicin and imipenem and determinants of antimicrobial resistance. Multilocus variable tandem repeat analysis (MLVA) and whole genome sequencing (WGS) analysis was also performed in a subgroup of epidemic, multidrug isolates. Most of the isolates were toxigenic (91.3%), of which 94.2% had both toxins A and B and 25.8% of them also had a binary toxin. Seventy-five different RTs were identified. RT027, RT014, RT106 and RT017 were the most frequently isolated. There was no evidence of resistance to vancomycin among the 183 tested strains, and reduced susceptibility to metronidazole was rare (2.2%). Resistance to moxifloxacin was evident in multiple RTs, and were mainly from RTs positive for the three toxins, RT027 (18/18), RT126 (8/9) and RT078 (6/12), except the RT017 (19/19), which is toxin A-negative/toxin B-positive. All moxifloxacin-resistant strains exhibited a known mutation in GyrA (Thr82Ile). Rifampicin resistance was found in 11.5% of the 183 strains tested, most from RT017 (19/19) but also in one strain from RT241 and other from RT043. Most rifampicin-resistant strains harbour the previously described mutations in RpoB (His502Asn and Arg505Lys), although one mutation, Ser507Leu, found alone in a resistant strain was not previously described. Of the 181 strains belonging to 57 RTs tested for imipenem susceptibility, only strains from RT017 showing high level of resistance to this antibiotic (MIC > 32 mg/L). The resistance determinants, ermB and tetM genes were present in 34 (10.1%) and in 63 (20.12%) strains, respectively, being that 22 (6.5%) contained both genes. Twenty strains were toxin A-negative/toxin B-positive, 19 of them belonging to the well-known emerging RT017, 11 from hospital A isolated in a short period of time suggesting that an outbreak have occurred, the remaining eight from hospital B, isolated between 2016 and 2017, where this RT seems to be endemic. Overall, these strains were multiresistant, presenting resistance to six of the 10 antibiotics tested: moxifloxacin, rifampicin, imipenem, tetracycline, clindamycin and erythromycin (these two belonging to the MLSB group), with high level of resistance. PCR screening of the resistance determinants showed that all strains harboured the tetM gene, but only the eight strains from hospital B were positive for ermB. Analysis by WGS revealed the presence of the ermG gene in the ermB-negative/MLSB-resistant strains. This gene was found to be in a putative mobile element of 63 kb exclusive of the hospital A clonal cluster. Transformation of a susceptible strain (C. difficile 630Δerm), with a plasmid containing the ermG gene, proved that the presence of this gene provides high resistance to clindamycin and erythromycin in C. difficile. Mutations in penicillin-binding proteins were also observed in all imipenem resistant strains. Phylogenetic analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of RT017 isolates collected from 2012 to 2017 revealed three clusters, each from a single hospital. Subtyping MLVA was also applied to detect the clonal spread of C. difficile belonging to toxin A-negative/toxin B-positive, and the results were overall similar with the WGS analysis. In addition, 74 SNPs variations were found among RT017 strains, namely in proteins involved in antimicrobial resistance and in hypothetical proteins. The current work gives a contribution to the knowledge of the molecular epidemiology and resistance patterns of C. difficile in Portugal. The results presented herein alert to the presence of multidrug resistant strains of RT017 in Portuguese hospitals in endemic and outbreak situations, and indicates the need for adequate use of antimicrobial agents, especially carbapenems, whose resistance was only observed among the strains of this emerging RTs. The lineage of strains from RT017 appears to be constantly evolving, acquiring new resistance determinants, which highlights the need for continued epidemiological and antimicrobial surveillance. The wide variety of RTs found suggests that there are other routes of transmission beyond nosocomial transmission, raising concern about the epidemiological change in this pathogen. As such, other potential sources, particularly in animals, which may also act as a reservoir for C. difficile and antimicrobial resistance determinants, should be investigated in the future. Finally, this study provides the basis for investigating important factors for the spread and persistence of toxin A-negative/toxin B-positive strains, such as studies on the importance of proteins that distinguish these strains, namely the hypothetical proteins.
- Infeção invasiva por Haemophilus influenzae: caracterização fenotípica e molecular e estudo da virulência de estirpes isoladas em PortugalPublication . Heliodoro, Catarina Isabel Moreira; Lavado, Maria Paula Bajanca; Dias, DeodáliaHaemophilus influenzae é um microrganismo responsável por infeções invasivas graves no Homem, apesar de ser frequentemente encontrado como colonizador do trato respiratório. Este agente patogénico é dinâmico e a sua epidemiologia tem vindo a mudar desde a introdução da vacina nos anos 90. Até à data, foram identificados 6 tipos capsulares (a-f), apesar de a maioria das estirpes caracterizadas atualmente serem não capsuladas (HiNC). Estudos anteriores caracterizaram a doença invasiva em Portugal, entre 1989-2001 e entre 2002-2010. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e molecularmente os isolados clínicos de doença invasiva em Portugal, durante um período de 6 anos (2011-2016), e comparar os resultados obtidos com os de estudos realizados anteriormente, bem como identificar a presença/ausência de 6 dos fatores de virulência destas estirpes. Durante o período de estudo considerado foram analisadas 174 estirpes invasivas, provenientes de 32 hospitais. A cápsula e o serotipo capsular foram identificados e caracterizados através de amplificação por PCR. A produção de β-lactamase foi pesquisada com nitrocefin, e a suscetibilidade aos antibióticos foi determinada pelo método da microdiluição em placa, de acordo com as diretrizes do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). De modo a avaliar a relação genética entre os isolados, foi realizada a técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST), para amplificar e sequenciar os fragmentos internos dos 7 genes ‘housekeeping’ – adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi, e recA. O sequence type (ST) foi atribuído através da base de dados de MLST para H. influenzae (https://pubmlst.org/hinfluenzae/), e as distâncias alélicas entre os STs foram representadas através da análise do algoritmo goeBURST, na plataforma PHYLOViZ. A presença/ausência dos fatores de virulência pilA, ompP5, hmw1A/hmw2A, hifA, e hia foi determinada por amplificação por PCR. As estirpes HiNC foram as principais responsáveis por doença invasiva (143/174; 82%); no entanto, 31 estirpes (31/174; 17,8%) eram capsuladas e foram caracterizadas como: 4 do serotipo a (2,3%), 21 do serotipo b (12,1%), 2 do serotipo e (1,1%), e 4 do serotipo f (2,3%). A maior parte das estirpes eram suscetíveis aos antibióticos estudados, com 12% (21/174) de estirpes resistentes à ampicilina por produção de β-lactamase. O MLST foi realizado para 136 estirpes e revelou elevada variabilidade genética entre 106 HiNC, com 71 STs diferentes (71/106; 67%). Pelo contrário, as estirpes capsuladas eram clonais: Hib-ST6 e ST-190, Hia-ST23, Hie-ST18, e Hif-ST124. Em Portugal, as estirpes HiNC suscetíveis aos antibióticos e apresentando elevada diversidade genética são as principais responsáveis pela doença invasiva a H. influenzae, apesar de estirpes Hib ainda circularem numa percentagem considerável no nosso país. Estirpes do serotipo não-b têm vindo a emergir, após a introdução da vacina contra o Hib, nomeadamente os serotipos a e f. Os fatores de virulência estudados, essenciais na fase de adesão ao hospedeiro, não se encontram obrigatoriamente em todas as estirpes e a sua presença não está associada a uma maior gravidade da infeção. No entanto, eventos como recombinação genética, ou variação de fase, estão entre os fatores que mais contribuem para o fitness do microrganismo, aquando da colonização da nasofaringe, contribuindo para uma maior patogenicidade, principalmente das estirpes HiNC. Devido à sua dinâmica evolutiva, é necessária a continuação da vigilância da doença invasiva a H. influenzae em Portugal, para que se possam desenvolver estratégias de prevenção adequadas.
- Activities of an aqueous plant extract against herpes simplex virus type2 (HSV 2): role in virus replication and progeny yieldPublication . Mota Mendes, Ana Rita; Caeiro, Maria Filomena; Lopo, SílviaHerpes simplex virus type 2 (HSV-2) is widely distributed through the human population, infecting more than 500 million people globally. Although causing generally mild infections this virus may cause severe symptoms occasionally, mainly in immunocompromised patients. Presently, there are a number of systemic antiviral agents against herpesvirus, the most commonly used being acyclovir (ACV) and its prodrugs. However, long term treatments with these drugs may result in the development of resistance, especially in immunocompromised patients, which leads to a continuous search for new and better therapeutic alternatives. According to the World Health Organization (WHO) plants would be the best sources for obtaining a wide variety of drugs. In fact, in the last decades many pharmacological and chemical studies have focused on medicinal plants and the discovery of new natural therapeutic compounds. In this study the anti-herpetic action of an aqueous extract was evaluated. The product was obtained by decoction of stem and leaves from Solidago virgaurea, a perennial herb member of the Asteraceae family. The study of the aqueous extract activity included a preliminary evaluation of its cytotoxicity in Vero cells – by the MTT assay - in the same conditions that are applied for viral production. Extract direct effect on viral particles – virucidal effect – was also assessed, having proved null. Anti-herpetic activity was investigated through two kinds of experiments: treatment of infected cells during virus production that revealed a mean yield reduction of 94 % in treated relatively to non-treated cells and an IC50 of 35.1 μg/mL; and treatment of infected cells during virus titration, which revealed slighter inhibition but significant size differences between virus plaques formed in treated and control conditions (smaller in treatment conditions). To further evaluate the mechanisms that mediate the aqueous extract inhibitory effect, infected cells – treated and non-treated - and virus particles – produced in treated and non-treated cells - were visualized through Transmission Electron Microscopy (TEM), revealing less damage due to infection in treated cells and a reduced amount of viral particles in HSV-2 suspensions produced in treated cells, relatively to controls. A kinetic of the first hours of the infection was performed with and without treatment, to assess possible differences in DNA production. Extracted samples were subjected to qPCR and results showed that the amount of viral DNA raises significantly slower in treated versus non-treated infected cells, throughout the infection. This is consistent with the effective reduction of the extract when added at later infection times - 4-6 h p.i. - when DNA replication is already in an advanced stage. Our results suggest that the aqueous extract inhibits HSV-2 replication, when present at the beginning of the infection, possibly by interfering with the viral DNA synthesis.
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