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- Diagnóstico laboratorial das infeções fúngicas invasivasPublication . Verissimo, CristinaAs infeções fúngicas invasivas (IFI) estão associadas a elevada mortalidade. O diagnóstico numa fase inicial é determinante para o sucesso da terapia. As leveduras do género Candida são os agentes mais frequentes de infeção fúngica invasiva; No grupo dos fungos filamentosos o género Aspergillus e os fungos asseptados da ordem Mucorales são referidos como os principais agentes de IFI, no entanto outras espécies têm vindo a emergir, nomedamente Rhodotorula spp. Trichopoporon spp., Fusarium spp. Scedosporium spp. Devido à falta de métodos capazes de diagnosticar com exatidão as infeções fungicas invasivas o diagnóstico destas infeções deverá ser baseado em várias abordagens complementares que incluem: critérios clínicos, imagiologia compatível, histopatologia, cultura e métodos não culturais (pesquisa de antigénio, DNA fúngico). Os métodos moleculares têm vindo a ser melhorados de modo a assegurar reprodutibilidade intra e inter laboratorial, com vista à sua validação para diagnóstico laboratorial. Perspetivam-se novas metodologias que permitam tornar mais rápido o diagnóstico das infeções fúngicas invasivas e guidelines incluam os métodos não culturais, com vista a melhor adequação da terapia antifúngica. Nesta apresenção serão abordadas as diferentes metodologias disponiveis para o diagnóstico laboratorial das infeções fúngicas, principais vantagens e limitações.
- Aplicação de desenho de experiências na otimização do teor proteico na maltagem do Trigo SarracenoPublication . Rosa, Filipa Alexandra Raposo; Vilela de Matos, Ana Sofia Leonardo; Motta, CarlaCom a crescente consciencialização e procura por um estilo de vida mais saudável, é cada vez maior a procura por alimentos mais ricos nutricionalmente e que demonstrem ainda benefícios adicionais para a saúde humana, como os denominados alimentos funcionais. O trigo sarraceno é uma reconhecida fonte de nutrientes, dotado de amido resistente, que proporciona um alto teor de hidratos de carbono, e rico em proteína, vitaminas, minerais e principalmente fibra, prevenindo situações de obstipação e obesidade. Devido à ausência de glúten na sua composição, é utilizado como substituto dos cereais na dieta de pacientes celíacos a fim de evitar desequilíbrios nutricionais, sendo recomendado pela Organização Mundial de Gastroenterologia para pacientes que sofrem da doença. O processo de maltagem é uma das formas de processamento mais promissoras na melhoria da qualidade proteica dos alimentos e, por isso, o foco deste estudo será a otimização do teor proteico e respetivos aminoácidos essenciais durante o mesmo. Com este objetivo e numa fase inicial, determinou-se o tempo de demolha necessário para obter um teor de humidade de 50%, de modo a que se dê a absorção adequada de água, e o tempo de secagem até um teor inferior a 10% para que terminem os processos metabólicos que se iniciaram durante a germinação. Numa segunda fase, aplicou-se desenho de experiências com 2 fatores, tempo (h) e temperatura de germinação (ºC), a 3 níveis em 2 blocos, duas temperaturas de demolha (ºC). De modo a selecionar os fatores significativos e a melhor combinação de níveis, recorreu-se à análise de variância e às superfícies de resposta, respetivamente. Verificou-se que são necessárias 2h de demolha e 4h de secagem para atingir os teores de humidade desejados. Relativamente às características analisadas através do desenho de experiências, observou-se que para o teor proteico apenas a temperatura de demolha é significativa, com valores mais elevados para uma temperatura de 30 ºC. Relativamente aos aminoácidos essenciais, com exceção da metionina, cujos fatores significativos são o tempo e a temperatura de germinação, sendo a melhor combinação uma temperatura de 18 ºC e um tempo de 72 h, para os restantes aminoácidos apenas o tempo de germinação é significativo, com melhores resultados para uma germinação com a duração de 48 h.
- Computational and validation approaches in proteomics discovery of disease biomarkersPublication . Costa, André; Penque, Deborah; Dias, DeodáliaO estudo em larga escala de proteínas, a proteómica, está a mudar amplamente a nossa compreensão das funções dos genes na era pós-genómica. Depois da revolução na genómica pelos métodos de sequenciação de ADN (ácido desoxirribonucleico), a proteómica tem vindo a aumentar o nosso conhecimento sobre a variabilidade, localização, função e vias metabólicas das proteínas na célula, tecido ou organismo. O desenvolvimento de biomarcadores, como uma componente relevante na tomada de decisões, tanto nos processos clínicos quanto no desenvolvimento de novos medicamentos, é uma área emergente onde a proteómica tem vindo a ganhar relevo. As tecnologias proteómicas permitem uma análise comparativa, qualitativa e quantitativa de milhares de proteínas de células/tecidos de doentes versus indivíduos controles, assim como, de doentes antes e depois de um determinado tratamento. As proteínas identificadas diferencialmente abundantes e/ou modificadas pós-traducionalmente na condição de doença ou em resposta a terapia, são possíveis candidatas a biomacardores destas condições. No entanto, a interpretação da enorme quantidade de dados proteómicos, gerados principalmente por experiências baseadas em espectrometria de massa (MS), requer suporte computacional para processamento e análise dos dados de forma efetiva e robusta. A Proteómica computacional estuda os métodos computacionais, algoritmos, bases de dados e metodologias utilizadas para processar, gerir, analisar e interpretar os dados produzidos em experiências proteómicas na identificação de potenciais biomarcadores. O Laboratório de Proteómica do INSA (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge), através da busca de biomarcadores proteómicos para compreensão de doenças tais como a Anemia das Células Falciformes (ACF), tem produzido grandes dados de MS que necessitam de análise computacional, sendo este o principal propósito deste projeto (ver abaixo objetivo deste estudo). A ACF, também denominada por drepanocitose ou anemia drepanocítica, é um distúrbio monogénico autossómico recessivo, clinicamente heterogéneo, caracterizado por episódios recorrentes de hemólise grave, vaso-oclusão e infecção. Vários modificadores genéticos e ambientais foram sugeridos para modular o início e o curso da ACF. Especificamente, os componentes vasculares da patologia (por exemplo, acidente vascular cerebral) foram submetidos a pesquisas intensivas e o uso de metodologias proteómicas promete oferecer novas percepções moleculares sobre a fisiopatologia da ACF. A mudança do estado estacionário para a crise ainda é em grande parte imprevisível. A fim de descobrir biomarcadores putativos para essa exacerbação, o laboratório do INSA analisou por proteómica de shotgun MS, amostras de plasma e glóbulos vermelhos (GV), de um grupo de pacientes com ACF em estado estacionário e em crise (episódio de vaso-oclusão). Objetivo do estudo: Este estudo teve como objetivo analisar os dados de shotgun MS gerados para a ACF através de plataformas de proteómica computacional de código aberto, nomeadamente o PatternLab e o MaxQuant , no sentido de identificar proteínas como possíveis candidatos a biomarcadores da ACF e em particular da ACF associada a vaso-oclusão. O PatternLab for Proteomics é um ambiente computacional integrado para análise de proteómica shotgun, formatando bancos de dados de sequências, que realizam a correspondência de espectro peptídico, filtrando estatisticamente e organizando dados por proteómica diferencial, exibindo resultados em formato de gráficos, realizando estudos orientados por similaridade com dados de sequenciação de novo, ajudando à compreensão do significado biológico dos dados à luz da Ontologia Genética (Gene Ontology). O MaxQuant é um conjunto de algoritmos, que inclui a detecção de picos e a pontuação de péptidos, realiza a calibração em massa e pesquisas em bancos de dados para identificação de proteínas, quantifica proteínas identificadas e fornece estatísticas resumidas. Para validar os achados proteómicos, algumas das proteínas identificadas diferencialmente na patologia por essas plataformas computacionais, foram selecionadas para validação (verificação) através de abordagens como Western blot. O Western blot é uma técnica bioquímica imunológica na qual uma mistura de proteínas é separada por gel 1DSDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), transferida para uma membrana, posteriormente incubada com anticorpo específico contra a proteína de interesse. A reação, geralmente visualizada por quimioluminescência, pode ser quantificada por densitometria. De todas as 111 proteínas diferencialmente expressas identificadas (74 da fração citoplasmática e 37 da fração membranar) associadas ao evento de crise na ACF, a peroxiredoxina-2, a catalase, a Hsp70 e Hsp 90 foram validadas por Western blot. Destas 4 proteínas, apenas a peroxiredoxina-2 apresentou significância estatística. Das proteínas diferencialmente expressas que hipoteticamente podem estar associadas à ACF, um promissor biomarcador de crise, nomeadamente, a Voltagedependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) foi encontrada diminuída. Os resultados sugerem que episódios de vaso-oclusão em doentes com ACF podem estar associados à diminuição da VDAC1 nos glóbulos vermelhos. Os resultados deste projeto após apresentação e discussão podem contribuir para um melhor entendimento das vias moleculares associadas à ACF, bem como para a identificação de modulações proteicas específicas, como possíveis candidatos a biomarcadores para essas patologias.
- Influenza Vaccine Effectiveness in Portugal: Season 2018-19 reportPublication . Gómez, Verónica; Kislaya, Irina; Pechirra, Pedro; Conde, Patrícia; Costa, Inês; Nunes, Baltazar; Guiomar, Raquel; Machado, AusendaThe results to be presented are related to the 2018/19 EuroEVA season (the Portuguese component of the multicentre I-MOVE study) and aimed to estimate the end of season influenza vaccine effectiveness i) in general population; ii) in <65 and ≥65 years age groups; iii) in the target group for vaccination and iv) by influenza A subtype.
- 3-Oxo-β-Sultams and 4-Oxo-β-Lactams as Chemical Tools for Activity-based Protein Profiling of Serine HydrolasesPublication . Carvalho, Luis Miguel Afonso; Moreira, Rui; Lucas, Susana; Penque, DeborahActivity-based protein profiling (ABPP) is a technique that analyzes the dynamics in enzymatic activity in complex proteomes by using small molecular probes, deemed activity-based probes (ABPs), containing a reactive group to covalently bind enzyme catalytic residues, a tag for detection of labeled targets and a linker as a spacer and also specificity-enhancing. Different warheads have been developed to engage a wide range of enzymatic families but there is a constant need to create new chemical tools to expand the pool of engageable targets. In this work we evaluated two 4-membered ring warheads as new warheads for ABPP of serine hydrolases. The 3-Oxo-β-Sultam warhead was revealed to be a highly reactive chemotype which labels a wide range of proteins with limited target occupancy. A crystallographic analysis of the reaction of 3-Oxo-β-Sultams with elastase enzymes revealed a previously unknown mechanism of inhibition of these enzymes by sulfonylation, suggesting 3-Oxo-β-Sultam compounds could be used to expand the pool of available sulfonylating tools in chemical biology. 4-Oxo-β-Lactams were shown to potently hit a selected group of serine hydrolase with high target occupancy, including human neutrophil elastase (HNE) and members of the ABHD and DPP families of enzymes. A competitive-ABPP approach revealed high potency of a library of 4-Oxo-β-Lactams to target these enzymes. 4-Oxo-β-Lactams were identified used as a new chemotype for DPP8 and DPP9 inhibition. Crystallography experiments revealed a new binding mode of these enzymes with 4-Oxo-β-Lactams, highlighting that these compounds could be used to pursue selective DPP8 or DPP9 inhibitors, a highly pursued field in current medicinal chemistry.
- Contribution to biomonitoring of a non-phthalate plasticizer: analysis of biomarkers of genotoxic effects of DINCH in human cellsPublication . Vasconcelos, Ana Luísa Teixeira Franco; Dias, Deodália Maria Antunes; Louro, HenriquetaThe human exposure to plasticizers is continuous, since their pervasiveness in a vast range of plastic consumer products (e.g. food packages, healthcare products and textiles). Their ability to migrate and leach to the environment or food was previously demonstrated, therefore, increasing the risk of exposure as well as the risk of potential adverse health outcomes, with a subsequent socioeconomical impact. During the last decades, the adverse health effects of phthalates (e.g. DEHP, DINP), which are the main group of plasticizers used by the industry, has been demonstrated namely the disruption of the male reproductive system development, and the onset of carcinogenesis in humans. So, their application in many consumer products was restricted or even prohibited, which lead to the development of greener alternative plasticizers; within this group, DINCH is the main alternant used to increase the flexibility and durability of polymeric matrices. Concomitantly, the detection of DINCH in human surroundings and in biological matrices has increased during the last decade. This prompt the establishment of biomonitoring guidance values for DINCH metabolites in urine, as a measure of precaution; however, the studies about potential adverse effects of DINCH in humans are still scarce. Given the broad applications and the increasing levels of human exposure, the aim of this study was to analyse the cytotoxicity and genotoxicity of DINCH in human liver (HepG2) and kidney (HK-2) cell lines. Accordingly, the assays used herein were the colorimetric MTT assay, to determine cell viabilities; the modified alkaline comet assay, to detect DNA damage and repair; and the micronucleus assay, to examine chromosomal permanent damages. The results showed that DINCH did not affect cell viabilities, however, was able to induce mild mitogenic effects in human renal cells. After a prolonged exposure, there were mild to moderate cytotoxic and cytostatic effects, in both cell lines. In human hepatic cells, the plasticizer caused transient oxidative DNA damaging effects, but did not cause primary DNA damage, in both cell lines, regardless the exposure periods. Concerning the chromosomal damage, DINCH and its metabolites did not increase the micronucleus levels in both cell lines, with and without metabolic activation. Other biomarkers of genotoxicity were significantly increased after exposure, without a dose-response effect. These results are in line with previous in vivo and in vitro studies, which concluded that DINCH is a non-genotoxic compound, but can induce cytotoxic effects after prolonged exposure. Furthermore, this work is a valuable contribute to the assessment risk of DINCH in humans, because it is the first genotoxic study, to the best of our knowledge, using human cell lines. Nonetheless, more studies are needed to confirm these results, as well as to further investigate the long-term effects of oxidative damage in human health, since the human exposure to DINCH is expected to increase in the future.
- Plano de atividades 2019Publication . Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPPlano de atividades do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) para o ano de 2019. O INSA é um organismo público integrado na administração indireta do Estado, sob a tutela do Ministério da Saúde. Enquanto Laboratório do Estado, o Instituto tem por missão contribuir para ganhos em saúde pública através de atividades de investigação e desenvolvimento tecnológico, atividade laboratorial de referência, observação da saúde e vigilância epidemiológica, bem como coordenar a avaliação externa da qualidade laboratorial, difundir a cultura científica, fomentar a capacitação e formação e ainda assegurar a prestação de serviços diferenciados, nos referidos domínios. Este instrumento constitui um referencial para a atividade a desenvolver pelo Instituto durante este ano, baseado nas estratégias, objetivos e metas institucionalmente consensualizados.
- Avaliação do valor nutricional de cereais de pequeno-almoço recorrendo a modelos de perfil nutricionalPublication . Matias, Filipa Nunes; Coelho dos Santos, Mariana; Figueira, Maria EduardoIntrodução: Uma das preocupações a que as organizações de saúde pública nacionais e internacionais têm tentado dar resposta nas últimas décadas tem sido a de promover uma alimentação adequada de forma a satisfazer as necessidades nutricionais da população. A importância para a saúde pública de certos nutrientes e alimentos foi reconhecida através de recomendações alimentares e de directrizes alimentares nacionais e internacionais. Diversos governos implementaram diferentes medidas para levar a cabo as estratégias sugeridas pela OMS em relação à melhoria da qualidade da dieta. Entre essas medidas está a criação de perfis nutricionais que permitem ao consumidor fazer uma selecção de alimentos saudáveis, especialmente no que diz respeito ao grupo dos alimentos processados. Diversos modelos de perfil nutricional têm sido desenvolvidos com o objectivo específico de definir a qualidade nutricional de alimentos individuais ou de grupos de alimentos, classificando-os de acordo com o seu conteúdo específico em nutrientes ou ingredientes de interesse. Os modelos de perfil nutricional podem ser aplicados com a finalidade de orientarem na reformulação de produtos alimentares, na definição de padrões específicos de composição nutricional, na regulamentação do marketing de produtos alimentares dirigidos a crianças, no estabelecimento de alegações de saúde e nutrição e na criação de logótipos de rotulagem de produtos. Os critérios nutricionais dos modelos de perfil nutricional seleccionados para este estudo, OMS Europa, Ofcom e EU Pledge, têm em comum a restrição de alimentos menos saudáveis à publicidade infantil, como forma de prevenir o excesso de peso e a obesidade infantil. Objectivo: Esta tese teve como objectivo geral a avaliação do valor nutricional de cereais de pequeno-almoço recorrendo à aplicação de três modelos de Perfil nutricional. Metodologia: O estudo envolveu a recolha de dados num total de 217 cereais de pequeno-almoço, que foram seleccionados com base na “Lista de Alimentos” do Inquérito Alimentar Nacional e de Actividade Física 2015-2016, e após observação in loco da oferta existente nas unidades comerciais escolhidas. Tratou-se de um estudo transversal exploratório que utilizou dados de uma amostra de conveniência. Foram aplicados os critérios nutricionais dos três modelos aos cereais em estudo, tendo sido feita uma análise e respectiva avaliação da classificação obtida. Resultados: Os resultados deste estudo mostraram que 16,6 % dos cereais de pequeno-almoço são adequados para serem publicitados de acordo com o modelo da OMS Europa, 25,3 % pelo Ofcom e 69,1 % pelo EU Pledge. O teor de açúcares totais foi o factor que determinou a maior percentagem de incumprimento nos modelos da OMS e EU Pledge. Conclusão: Pelos resultados obtidos, e após análise ao cumprimento/ incumprimento dos critérios nutricionais estabelecidos pelos três modelos, ficou demonstrado que o modelo mais adequado à protecção das crianças contra o marketing infantil foi o modelo da OMS Europa.
- Effect of pre-analytical conditions on prothrombin time and partial activated thromboplastin timePublication . Moutinho, Beatriz; Pinto, Beatriz; Cardoso, Rita; Alves, Helena; Botelho, MónicaClinical analysis often involves clotting assays. Although the guidelines suggest the storing and freezing of samples before these assays, there are contradictory results in the literature. The objective of this study was to analyse the effect of the temperature and the storage of plasma sample on Prothrombin Time (PT) and Activated Partial Thromboplastin Time (aPTT) in clinical samples for 65 patients without coagulation disorders.