DDI - Dissertações de mestrado
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- Activities of an aqueous plant extract against herpes simplex virus type2 (HSV 2): role in virus replication and progeny yieldPublication . Mota Mendes, Ana Rita; Caeiro, Maria Filomena; Lopo, SílviaHerpes simplex virus type 2 (HSV-2) is widely distributed through the human population, infecting more than 500 million people globally. Although causing generally mild infections this virus may cause severe symptoms occasionally, mainly in immunocompromised patients. Presently, there are a number of systemic antiviral agents against herpesvirus, the most commonly used being acyclovir (ACV) and its prodrugs. However, long term treatments with these drugs may result in the development of resistance, especially in immunocompromised patients, which leads to a continuous search for new and better therapeutic alternatives. According to the World Health Organization (WHO) plants would be the best sources for obtaining a wide variety of drugs. In fact, in the last decades many pharmacological and chemical studies have focused on medicinal plants and the discovery of new natural therapeutic compounds. In this study the anti-herpetic action of an aqueous extract was evaluated. The product was obtained by decoction of stem and leaves from Solidago virgaurea, a perennial herb member of the Asteraceae family. The study of the aqueous extract activity included a preliminary evaluation of its cytotoxicity in Vero cells – by the MTT assay - in the same conditions that are applied for viral production. Extract direct effect on viral particles – virucidal effect – was also assessed, having proved null. Anti-herpetic activity was investigated through two kinds of experiments: treatment of infected cells during virus production that revealed a mean yield reduction of 94 % in treated relatively to non-treated cells and an IC50 of 35.1 μg/mL; and treatment of infected cells during virus titration, which revealed slighter inhibition but significant size differences between virus plaques formed in treated and control conditions (smaller in treatment conditions). To further evaluate the mechanisms that mediate the aqueous extract inhibitory effect, infected cells – treated and non-treated - and virus particles – produced in treated and non-treated cells - were visualized through Transmission Electron Microscopy (TEM), revealing less damage due to infection in treated cells and a reduced amount of viral particles in HSV-2 suspensions produced in treated cells, relatively to controls. A kinetic of the first hours of the infection was performed with and without treatment, to assess possible differences in DNA production. Extracted samples were subjected to qPCR and results showed that the amount of viral DNA raises significantly slower in treated versus non-treated infected cells, throughout the infection. This is consistent with the effective reduction of the extract when added at later infection times - 4-6 h p.i. - when DNA replication is already in an advanced stage. Our results suggest that the aqueous extract inhibits HSV-2 replication, when present at the beginning of the infection, possibly by interfering with the viral DNA synthesis.
- Aspergillus isolados em diferentes contextos indoor e ocupacionais: sua potencial relevância para a saúdePublication . Simões, Daniela; Sabino, Raquel; Deodália, Maria AntunesIntrodução: A exposição a elevadas concentrações de conídios fúngicos, nomeadamente do género Aspergillus, constitui um potencial fator de risco para o desenvolvimento de sintomas respiratórios em contextos ocupacionais e não-ocupacionais. Aspergillus fumigatus tem conídios de pequenas dimensões, com elevada capacidade de aerossolização e dispersão, sendo o principal agente responsável por aspergiloses brocopulmonares alérgicas, crónicas e invasivas. O seu elevado número de divisões mitóticas gera uma variada gama de mutações espontâneas que na presença de azóis pode originar estirpes com mutações que conferem resistência a estes antifúngicos. Na medicina, os azóis mais utilizados são os triazóis itraconazol, voriconazol e posaconazol, molecular e estruturalmente semelhantes aos fungicidas agrícolas propiconazol, tebuconazol, difenoconazol, epoxiconazol e bromuconazol, presentes em 60,9% dos fungicidas azóis permitidos em Portugal. Os ambientes interiores ocupacionais e não-ocupacionais podem ser ricos em elevadas concentrações de esporos e determinadas espécies de Aspergillus que podem eventualmente causar riscos respiratórios aos seus ocupantes. Os trabalhadores agrícolas estão expostos a grandes concentrações de bioaerossóis e, consequentemente, a maiores concentrações de microrganismos em suspensão no ar, apresentando uma maior prevalência de sintomas respiratórios comparativamente a habitantes urbanos. As estufas são ambientes com características microclimáticas ótimas para a formação de bioaerossóis, para o crescimento de fungos e seleção de isolados resistentes, aumentando o risco de desenvolvimento de sintomas respiratórios dos trabalhadores. Objetivos: Este estudo teve como objetivo conhecer a epidemiologia molecular das espécies de Aspergillus em diferentes contextos ocupacionais e não-ocupacionais e os padrões de suscetibilidade dos isolados de A. fumigatus. Foi ainda estudada a exposição a fungos em trabalhadores agrícolas (nomeadamente no ambiente específico das estufas). Por último, foi otimizada (e aplicada a isolados laboratoriais) uma metodologia para pesquisa de mutações no gene Cyp51A e seu promotor, em Aspergillus fumigatus. Materiais e Métodos: Foi feita uma amostragem do ar interior em estufas agrícolas e no exterior das estufas pelo método de sedimentação em placa. Os 19 isolados de Aspergillus provenientes das colheitas ambientais, 60 estirpes de Aspergillus ambientais recebidas do exterior e 5 estirpes de referência foram identificados por biologia molecular com recurso à sequenciação dos genes β-tubulina e calmodulina. A suscetibilidade de todos os isolados A. fumigatus foi testada por meios de screening com itraconazol (4μg/ml), voriconazol (1 ou 4μg/ml) e posaconazol (0,5μg/ml), com confirmação de falsos positivos por teste de suscetibilidade de difusão em gradiente. Foi otimizada a técnica de PCR e sequenciação do gene Cyp51A e do respetivo promotor, testando diferentes condições de forma a obter os melhores resultados de amplificação de A. fumigatus sensu stricto e com a máxima especificidade. A pesquisa de mutações no gene Cyp51A e seu promotor foi efetuada utilizando as reações otimizadas aplicadas às 5 estirpes de referência e 1 A. fumigatus isolado nas colheitas ambientais. Resultados: Os fungos que foram encontrados em maior quantidade e mais frequentemente em contexto agrícola pertencem aos géneros Cladosporium e Aspergillus. Foi encontrada uma maior diversidade e quantidade de esporos fúngicos em estufa do que no exterior, sendo a diferença entre o interior e o exterior estatisticamente significativa. As culturas de plantas aromáticas parecem estar associadas a uma maior exposição a esporos fúngicos. Foram também encontradas diferenças significativas relativamente à diversidade de géneros fúngicos consoante a cultura ou atividade em questão, nomeadamente a associação de Aspergillus spp., à apanha de alface. No que respeita aos outros ambientes ocupacionais estudados, ressalvam-se os trabalhadores da indústria de resíduos que se verificou estarem expostos principalmente a A. tubingensis enquanto a espécie de Aspergillus mais frequentemente encontrada nos restantes contextos foi A. fumigatus. Não foram encontradas resistências aos azóis testados. Conclusão: O estudo da epidemiologia molecular de Aspergillus isolados de diferentes contextos ocupacionais e não-ocupacionais permitiu encontrar um elevado número de espécies de Aspergillus. Nenhum dos isolados A. fumigatus apresentou resistência aos azóis clínicos testados. Os trabalhadores agrícolas quando desenvolvem as suas atividades no interior das estufas estão expostos a uma maior diversidade e quantidade de fungos, incluindo Aspergillus, do que no exterior. Nos ambientes estudados a espécie de Aspergillus mais frequentemente encontrada foi Aspergillus fumigatus, o que potencialmente aumenta o risco dos seus ocupantes desenvolverem sintomas respiratórios. Os agricultores e os trabalhadores da indústria de resíduos estão expostos principalmente a espécies crípticas do género Aspergillus. A otimização da metodologia para pesquisa de mutações no gene Cyp51A e no seu promotor de estirpes Aspergillus fumigatus sensu stricto permitiu detetar todas as mutações das estirpes resistentes utilizadas (com mutações conhecidas) e a sua aplicação numa estirpe ambiental, proveniente das recolhas ambientais no interior das estufas, resultou numa deteção bem-sucedida de mutações, não tendo sido encontradas, no entanto, mutações que conferem resistência.
- Avaliação da resistência a antibióticos em estirpes de cianobactérias isoladas de ambientes hídricosPublication . Oliveira, Micaela; Dias, Elsa; Dias, Deodália[PT] Os ambientes hídricos constituem veículos para a emergência e disseminação da resistência a antibióticos. As cianobactérias encontram-se amplamente distribuidas nestes ambientes, estando frequentemente expostas a antibióticos, bactérias resistentes e genes de resistência. Contudo, o seu papel no resistoma hídrico nunca foi investigado. Este trabalho pretendeu avaliar a susceptibilidade de oito estirpes de Microcystis aeruginosa, oito estirpes de Planktothrix agardhii e oito estirpes de Planktothrix mougeotii a diferentes antibióticos (amoxicilina, ceftazidima, ceftriaxona, canamicina, gentamicina, tetraciclina, ácido nalidíxico, norfloxacina e trimetoprim). Para tal, foi utilizado um procedimento baseado no método standard Broth Microdilution para bactérias, no qual as cianobactérias foram expostas a diluições sucessivas de cada antibiótico em meio Z8 (0,0015 mg/L – 1,6 mg/L) e mantidas numa câmara de culturas sob ciclos de 14 horas de luz – com uma intensidade de 16 ± 4 μEm-2 s-1 – e 10 horas de escuro, a uma temperatura de 20 ± 1ºC. O crescimento celular foi seguido durante 14 dias (observação macroscópica, microscópica e leitura da DO450nm) e as concentrações inibitórias mínimas de cada antibiótico (CIMs) foram calculadas para cada estirpe. Nenhuma das estirpes foi susceptível a qualquer das concentrações de ácido nalidíxico e de trimetoprim testadas. Adicionalmente, as estirpes de M. aeruginosa apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina, as estirpes de P. agardhii apresentaram uma susceptibilidade reduzida à norfloxacina e as estirpes de P. mougeotii não foram susceptíveis à amoxicilina nem à norfloxacina e apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina. Foi também pesquisada a presença de genes e de integrões associados à resistência a antibióticos nas cianobactérias em estudo por PCR e posterior sequenciação dos produtos obtidos. Foram encontrados genes de resistência à estreptomicina numa estirpe de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em quatro estirpes de P. mougeotii; genes de resistência às sulfonamidas em quatro estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em cinco estirpes de P. mougeotii; integrões de classe 1 em duas estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em três estirpes de P. mougeotii. Adicionalmente, o gene qacE foi encontrado numa estirpe de M. aeruginosa e numa estirpe de P. agardhii. Os resultados obtidos sugerem que as cianobactérias apresentam resistência intrínseca a alguns antibióticos e que, de acordo com o seu local de origem, podem apresentar resistência adquirida a outros. Assim, tudo indica que, de facto, as cianobactérias desempenham um papel importante no resistoma hídrico.
- Avaliação da resistência de Trichophyton rubrum ao antifúngico terbinafina e caracterização fenotípica e genotípica de fungos dermatófitosPublication . Henriques, Camila Valadas; Sabino, Raquel; Dias, DeodáliaOs dermatófitos são um grupo de fungos filamentosos com uma distribuição cosmopolita, que têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados (pele, cabelo e unhas) de humanos e outros animais e provocar uma infeção superficial denominada de dermatofitose. As dermatofitoses são responsáveis por 3 - 4% dos casos afeções dermatológicas, sendo a infeção superficial mais comum em humanos (com uma prevalência entre os 20-25%). No entanto, espera-se que a sua prevalência continue a aumentar devido ao aparecimento de novos fatores de risco. As espécies do género Trichophyton são os principais agentes causadores de patologias como pé de atleta e onicomicose nas mãos e pés e estima-se que afete ~1.000.000.000 de pessoas em todo o mundo. T. rubrum e T. interdigitale são os principais agentes etiológicos com prevalências de 80% e 20%, respetivamente. Em Portugal, é estimado que 1.510.391 de portugueses sofram de dermatofitoses, correspondendo a uma incidência de 14.300 infeções por dermatófitos por cada 1.000.000 de habitantes. Para o tratamento das dermatofitoses, a primeira terapia a ser prescrita é, na grande maioria dos casos, a terbinafina. Desde 2017 que os casos de resistência a este antifúngico por parte de T. rubrum e T. interdigitale têm vindo a aumentar gradualmente. Os mecanismos de resistência à terbinafina são, essencialmente, descritos como mutações pontuais no gene que codifica a esqualeno epoxidase. Assim, neste estudo, procurámos perceber se a problemática de resistência ao antifúngico terbinafina em T. rubrum e T. interdigitale estaria ou não negligenciada em Portugal. Cento e sessenta e quatro isolados de T. rubrum e T. interdigitale foram identificados até à espécie através de tecnologias moleculares e também com recurso a espectoctrometria de massa (MALDI-TOF). De seguida, verificámos a presença da resistência ao antifúngico terbinafina nestes isolados e pesquisámos as mutações associadas a essa mesma resistência. Para tal, procedemos à otimização e implementação de metodologias que permitiram efetuar a avaliação da resistência de isolados de T. rubrum e T. interdigitale, quer por método cultural quer por metodologias moleculares com sequenciação do gene da esqualeno epoxidase (SQLE) seguida de deteção de mutações neste gene que conferem resistência a este composto. A caracterização dos padrões de suscetibilidade ao antifúngico terbinafina foi feita recorrendo a meios de screening (agar suplementado com terbinafina) e ao método das microdiluições em caldo. Numa primeira abordagem, de 102 isolados de T. rubrum, apenas 1 isolado (nº126) revelou ser resistente á terbinafina por meio de screening e dos 17 isolados T. interdigitale, apenas 3 demonstraram ser resistentes à terbinafina por meio de screening em ambas as concentrações utilizadas definidas pela norma EUCAST (0.06 mg/L e 0.125 mg/L). De acordo com a metodologia das microdiluições, 2,44% dos isolados apresentaram menor suscetibilidade à terbinafina. Os nossos resultados demonstram que o isolado nº126 (T. rubrum) revelou ser bastante resistente à terbinafina com uma CMI de 8 mg/L, os isolados nº 63 e nº94 (T. interdigitale) apresentaram CMIs superiores a 8 mg/L o que representa uma baixa suscetibilidade à terbinafina. O isolado T. interdigitale nº 59 apresentou uma CMI igual a 1 mg/L o que revela uma resistência moderada à terbinafina. A otimização da PCR de amplificação e sequenciação do gene da SQLE de T. rubrum e T. interdigitale permitiu a deteção de mutações pontuais apenas num isolado de cada espécie num total de quatro isolados classificados como resistentes. O isolado T. rubrum nº126, após análise da sequência do gene da SQLE, apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE o que corresponde a uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma isoleucina. Apesar de as substituições mais comuns e que levam a uma maior resistência à terbinafina serem L393F e F397L, a substituição F397I detetada no isolado T. rubrum deste estudo, sugere causar uma elevada resistência à terbinafina. Relativamente aos isolados resistentes T. interdigitale, apenas o isolado nº 94 apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE, ocorrendo uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma leucina, o que confirma a sua CMI superior a 8 mg/L. Nos restantes isolados resistentes pertencentes à espécie T. interdigitale, não foram encontradas quaisquer mutações no gene que codifica a SQLE. Este estudo, permitiu-nos efetuar uma caracterização da população amostrada, das amostras biológicas e dos isolados do género Trichophyton obtidos por cultura destas amostras. Foi também possível detetar, pela primeira vez, isolados do género Trichophyton resistentes à terbinafina em Portugal. Foi ainda possível estimar, dentro dos isolados estudados, uma frequência de resistência de 2,44%. A resistência à terbinafina por parte de T. rubrum e T. interdigitale é um problema real em todo o mundo e estima-se que os casos continuem em aumentar e por isso acreditamos que, a aplicação do método de screening e das microdiluições bem como a implementação da reação de PCR para pesquisa de mutações que conferem essa mesma resistência será uma mais valia e um contributo importante no que toca ao diagnóstico e posterior terapia das dermatofitoses reportadas em Portugal.
- Caracterização dos mecanismos de resistência à ampicilina em estirpes clínicas de Haemophilus influenzae isoladas em Portugal entre o período de 2009 a 2012Publication . Barrulas Guilherme, Elsa; Lavado, Maria Paula Bajanca; Dias, Deodália Maria Antunes[PT] O Haemophilus influenzae (H. Influenzae) é uma bactéria Gram-negativa restrita ao aparelho respiratório humano, normalmente responsável por infeções respiratórias adquiridas na comunidade. A gravidade destas infeções resulta inicialmente num diagnóstico presuntivo, sendo posteriormente estabelecido um tratamento antibiótico empírico. A resistência desta bactéria aos antibióticos β-lactâmicos pode constituir sérias implicações a nível clínico, sendo que, o uso inapropriado destes antibióticos e a utilização de antibióticos de largo espectro têm contribuído grandemente para a emergência da resistência a esta classe de antibióticos. A resistência à ampicilina pode ser mediada por dois mecanismos: a produção de enzima β-lactamase, responsável pela inativação enzimática dos antibióticos β-lactâmicos, e pela presença de proteínas de ligação à penicilina alteradas que se traduz numa diminuição da afinidade aos mesmos. A amostra de 248 estirpes clínicas de H. influenzae foi selecionada com base na concentração inibitória mínima (CIM) à ampicilina, tendo como objetivo a caracterização dos mecanismos de resistência aos antibióticos β-lactâmicos em estirpes clínicas isoladas em Portugal. Foram estudadas 140 estirpes não produtoras de β-lactamase com CIM à ampicilina ≥1mg/L, 66 estirpes produtoras de β-lactamase com CIM≥8mg/L, e ainda um grupo controlo de 42 estirpes suscetíveis com CIM1mg/L. A sequência do gene ftsI foi amplificada e sequenciada para todas as estirpes. Da totalidade, 204 estirpes apresentavam mutações na região da transpeptidase do gene ftsI, nomeadamente 136 gBLNAR de 140 estirpes BLNAR, 24 gBLNAR de 42 estirpes BLNAS e 44 gBLPACR de 66 estirpes BLPAR. Foram identificados 40 padrões mutacionais que foram incluídos em grupos e subgrupos previamente descritos (I, IIa, IIb, IIc, IId e III-like). A análise destes padrões permitiu a classificação da maioria das estirpes no grupo mutacional II (78,5%), e as substituições aminoacídicas mais frequentes situavam-se próximo do domínio KTG: Val547Ile (88,7%), Asn526Lys (76,9%) e Asn569Ser (72,6%). A relação entre as mutações identificadas e os níveis de suscetibilidade à ampicilina permitiu constatar que 8,8% das estirpes eram suscetíveis, 8,8% eram resistentes devido à produção de β-lactamase (BLPAR), 64,5% eram resistentes pela alteração das PBPs, e 17,7% apresentavam ambos os mecanismos de resistência (BLPACR). Comparando estes resultados com os resultados obtido no período 2001-2008, verificou-se um aumento do número de estirpes suscetíveis à ampicilina, e também do número de estirpes resistentes com mutações no gene ftsI. Pela caracterização das estirpes e relação clonal entre as estirpes BLNAR e BLPACR por Multilocus Sequence Typing (MLST), verificou-se que as estirpes BLNAR apresentam uma grande heterogeneidade genética e que as estirpes BLPACR também não aparentam ter uma grande proximidade filogenética entre si.
- Caracterização dos mecanismos de resistência aos antibióticos em estirpes de origem humana, ambientes associados aos cuidados de saúde e veterináriaPublication . Salgueiro, Vanessa; Caniça, Manuela; Rebelo, Maria TeresaA resistência aos antibióticos é atualmente um problema de saúde pública a nível mundial. Este fenómeno envolve diversos mecanismos e espécies bacterianas, revelando-se de extrema importância a sua compreensão, através de investigação e vigilância, para evitar possíveis disseminações. Neste âmbito, este trabalho teve como principal objetivo a caracterização de mecanismos de resistência aos antibióticos em 139 estirpes bacterianas com três origens distintas: hospitais (Acinetobacter baumannii, Exiguobacterium acetylicum, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis e Staphylococ-cus epidermidis), ambiente de instituições de cuidados continuados (Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter junii, Acinetobacter pittii, Klebsiella oxyto-ca, Micrococcus luteus, Pantoea spp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas oryzihabi-tans, Pseudomonas putida, Sphingomonas paucimobilis, S. capitis, Staphylococcus capi-tis/caprae/warneri, S. epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis e Staphylococcus xylosos) e animais (S. aureus e Staphylococcus simiae). A realização de testes de suscetibilidade aos antibióticos (difusão em disco e E-teste) permitiu não só a identificação de estirpes com suscetibilidade diminuída às várias classes de antibióticos ensaiadas, mas também a orientação da pesquisa de genes de resistência por PCR (Polymerase Chain Reaction). Procurou-se estudar a diversidade genética das es-tirpes de A. baumannii através da deteção de linhagens clonais com importância internacio-nal e MLST (Multilocus Sequence Typing). No caso particular de S. aureus, a tipagem dos genes spa e agr, assim como MLST, permitiram estabelecer relações genéticas entre estas estirpes. Por outro lado, o método de PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis), utilizado para K. oxytoca, possibilitou a avaliação da clonalidade de uma estirpe ambiental em relação a estirpes de origem clínica. A maioria das estirpes coletadas em hospitais possuía um fenótipo de multirresistên-cia, ao contrário das estipes com origem nos lares e em animais. Aí se destaca a suscetibili-dade diminuída à ciprofloxacina e cefoxitina, esta última por expressão do gene mecA, em S. aureus e a suscetibilidade diminuída aos carbapenemes em A. baumannii e P. aerugino-sa, diminuindo as opções de tratamento disponíveis para infeções causadas por estas bactérias. Em A. baumannii foram encontrados os genes blaOXA-66 e blaOXA-23 e a sequência de inserção ISAba1. Em P. aeruginosa detetaram-se os genes blaGES-7-tipo, blaVEB-tipo, blaVIM-2 e blaVIM-11. A identificação do mesmo tipo de spa e ST em estirpes de S. aureus com origem humana e animal demonstra a possível disseminação entre estes dois reservatórios. A caracterização molecular permitiu ainda identificar uma eventual transferência de uma estirpe e/ou de determinantes de resistência entre S. capitis de um hospital e de um lar, situados na mesma área geográfica. Os lares e os animais, em paralelo com o Homem, poderão ser reservatórios de genes de resistência. Assim, é essencial um melhor conhecimento dos mecanismos de resistência e das vias de disseminação nestes reservatórios, para intervir e controlar a sua emergência e expansão.
- Characterization and Biofilm Assessment of haemophilus influenzae Isolates from Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease and Otitis MediaPublication . Cunha Batista, Beatriz; Bajanca-Lavado, Maria Paula; Jordão, LuísaHaemophilus influenzae is a commensal microorganism of the human nasopharynx, responsible for both invasive and non-invasive diseases. This work focused on the study of 93 H. influenzae isolates, collected between 2013 and 2018, from patients with two epidemiologically relevant non-invasive diseases: Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and Otitis Media (OM). Phenotypical and molecular characterizations were performed for the isolates, regarding capsular typing, β-lactamase production, antibiotic susceptibility, genetic diversity by MLST, presence/absence of virulence factors (pilA, hifA, hmw1A, hmw2A, hia and ompP5) and ability to produce biofilms. COPD isolates were collected from adults (100%), while 98.2% of OM isolates were collected from children. Non-typeable H. influenzae (NTHi) was the aetiological agent in COPD (97.4%) and OM (100%). Regarding antibiotic susceptibility, it should be noticed that 15.1% of the isolates were β-lactamase producers. MLST revealed a high genetic diversity among COPD and OM isolates, with 31 STs in 41 analysed isolates. pilA and ompP5 genes were present in more than 50% of COPD and OM isolates. hifA and hia genes were identified in less than half of the isolates, with a higher prevalence of these among OM isolates. hmw1A and hmw2A genes were respectively identified in 25.5% and 32.7% of OM isolates, while both hmw genes were present in 76.3% of COPD isolates. Biofilm production was observed for 14.0% and 29.0% of all isolates after 24h and 48h, respectively. No relationship between biofilm production and clinical source could be established, as well as with the presence of virulence factors (pilA, hmw1A e hmw2A) involved in biofilm production. COPD and OM are frequently associated with NTHi. Since no vaccines are available, monitoring of these diseases is highly recommended, as these constitute a Public Health threat associated with a high economic and social burden.
- Controlo de qualidade em laboratório clínico: hemoglobinopatiasPublication . Vilhena, Filipa; Caniça, Manuela; Faria, Ana Paula; Miranda, Armandina[PT] O laboratório clínico deve utilizar metodologias de controlo de qualidade que permitam identificar, prevenir e corrigir possíveis falhas e assim garantir a exatidão dos seus resultados. O Controlo de Qualidade laboratorial é de elevada importância quer através da aplicação de metodologias de Controlo de Qualidade Interno (CQI) para avaliação da precisão analítica, quer através da participação em programas de Avaliação Externa da Qualidade (AEQ) para avaliação da exatidão analítica. As hemoglobinopatias são doenças monogénicas com transmissão de forma autossómica recessiva, causadas por mutações ao nível dos genes das globinas humanas, que conduzem à síntese reduzida da hemoglobina (talassémias) ou à formação de hemoglobinas estruturalmente anómalas (variantes). O estudo apresentado incidiu sobre os resultados do CQI e da participação em programas de AEQ da Unidade de Diagnóstico Laboratorial de Referência (UDR) do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, bem como dos ensaios de AEQ organizados pelo Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade (PNAEQ) ao nível do doseamento de Hb A2, Hb F e Hb S realizados entre 2011 e 2014. Ao nível do CQI, verificou-se uma melhoria da precisão analítica no doseamento de amostras controlo de nível de concentração normal para a Hb A2, normal e elevado para a Hb F. O erro total associado ao doseamento da Hb A2 e da Hb F apresenta, de um modo geral, uma tendência decrescente. Relativamente ao doseamento da Hb S o mesmo só se verifica para as amostras analisadas no equipamento HA 8160. Entre 2011 e 2014 foram organizados pelo PNAEQ oito ensaios no âmbito das hemoglobinopatias. Os resultados obtidos indicam que, para as diferentes hemoglobinas estudadas, existe uma grande variabilidade nos resultados entre os laboratórios participantes.
- Desenvolvimento de um ensaio para genotipagem do vírus da Hepatite C numa população de infectados em ambiente prisionalPublication . Avó, Ana Patricia; Pádua, Elizabeth; Crespo, Ana[PT] O vírus da hepatite C (VHC) é caracterizado por uma elevada variabilidade genética traduzida na sua classificação em 6 diferentes genótipos, e em mais de 80 subtipos com distintos padrões de distribuição epidemiológica no mundo. Os vários genótipos estão associados a uma diferente evolução da infecção e progressão da doença, sendo por isso a classificação do VHC a principal ferramenta do clínico para a determinação da dosagem e duração do tratamento dos doentes. O presente estudo pretendeu desenvolver um método alternativo de genotipagem e subtipagem do VHC, no contexto de um laboratório de referência, que permitisse por um lado, reduzir os custos, e por outro lado, obter uma melhoria na classificação do vírus. No presente trabalho foram analisadas amostras de referência e amostras clínicas de 72 reclusos infectados por VHC, com resultados previamente conhecidos dos níveis de RNA e de genotipagem obtidos pelo método comercial LiPA. As amostras foram sujeitas a extracção de RNA e síntese de cDNA, amplificação por heminested PCR e sequenciação, e ainda, a análise filogenética de sequências nucleotídicas das regiões C/E1 e NS5B do VHC. Os resultados foram comparados com os previamente conhecidos obtidos pelo método LiPA. Independentemente das regiões genómicas, a subtipagem do VHC pelo método desenvolvido foi conseguida em 95,8% (69/72) dos casos, uma proporção bastante superior comparativamente à obtida no método LiPA (47,2%, 34/72), mostrando assim um melhor desempenho em identificar ou discriminar o subtipo VHC. Informação molecular conjunta para as duas regiões genómicas foi obtida em 88,9% (64/72) dos casos com identificação de um recombinante intergenótipo 1b/2k e um recombinante intragenótipo 2q/2k para a região C/E1 e 2k/2a para a região NS5B. Adicionalmente, 2 casos apresentaram uma classificação de VHC discordante, 1b/4a e 3a/4a, respectivamente para as regiões C/E1 e NS5B analisadas. Contudo, nestes casos não foi possível descartar a hipótese de possíveis infecções mistas. O elevado desempenho do método desenvolvido na detecção e classificação do VHC pode possibilitar de um modo mais preciso uma correlação clínica com os subtipos virais do VHC, e deste modo viabilizar um melhor entendimento do papel da variabilidade genómica na história natural e progressão da infecção do VHC.
- Desenvolvimento de uma técnica de PCR em Tempo Real para deteção do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1Publication . Almeida, Vanessa; Pádua, Elizabeth; Crespo, Ana[PT] As crianças verticalmente infetadas por VIH-1 têm elevado risco de progressão para SIDA nos primeiros anos de vida. Por um lado, este facto evidencia a importância do diagnóstico precoce da infeção permitindo tratamento atempado, e por outro lado, fundamenta ainda a procura constante da melhoria dos ensaios experimentais de diagnóstico. A técnica de nested PCR implementada no laboratório para diagnóstico precoce é sensível e específica, mas obriga a uma manipulação de produtos amplificados com maior risco da ocorrência de contaminações. É também considerado um método moroso já que associa a duas reações de amplificação sequenciais uma eletroforese em gel de agarose para deteção dos produtos amplificados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio experimental sensível e específico, alternativo à técnica de nested PCR, que pudesse conduzir à obtenção de ganhos no tempo de saída de resultados e na redução do risco de ocorrência de contaminações. Diferentes ensaios experimentais de PCR em Tempo Real foram desenvolvidos para a amplificação de fragmentos do VIH-1 (região LTR e pol) e efetuada uma avaliação prévia de resultados com a utilização de 3 grupos de amostras de referência: amostras positivas (n=15), amostras com ADN VIH-1 quantificado (n=8) e amostras negativas (n=11, positivas para VIH-2). Nos ensaios, foram diretamente testadas amostras de ADN viral extraído de CMSP ou sintetizado a partir de plasma, e também, amostras correspondentes a produtos de PCR gerados por uma prévia amplificação do ADN através de PCR Convencional. Foi selecionado o algoritmo experimental que revelou melhor desempenho na deteção da infeção VIH-1 para análise de amostras clinicas. Estas amostras foram obtidas entre 2009 e 2011, e correspondem a amostras colhidas a mães infetadas (positivas VIH-1, n=149) e a filhos em que não ocorreu a transmissão do vírus (amostras negativas, n=20). O algoritmo experimental em Tempo Real escolhido correspondeu à amplificação de fragmentos de VIH-1 (região LTR) utilizando a combinação dos primers HL456N e HL602C com a sonda TaqMan SHL478N, a partir de amostras de ADN previamente submetidas a PCR Convencional com os primers externos HL456N e HL650C. Em resultado da prévia avaliação com amostras de referência, este algoritmo revelou sensibilidade de 86,7% e um limite de deteção ADN VIH-1 de 0,8 cópias/amostra. Com amostras clínicas foi obtida uma sensibilidade de 75,2 % e de especificidade de 100%. A confirmação da infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 87,5% dos casos (112 casos positivos entre 128 estudados). Foi também obtido um valor de Kappa de 0,417 que mostrou uma concordância moderada entre resultados esperados e obtidos. Comparativamente, na técnica de nested PCR eram conhecidos valores de sensibilidade e especificidade respetivamente de 81,9% e 100% e uma concordância estimada pelo valor de Kappa de 0,565. A confirmação dos casos de infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 95,3% dos casos (122 casos positivos entre 128 estudados). Embora se tenha conseguido informação útil e obtido ganhos em tempo através do algoritmo experimental desenvolvido, este apresenta sensibilidade inferior à técnica de nested PCR utilizada no laboratório. Deste modo, para além do aumento da população/amostras em estudo, que se concluiu ser necessário para melhor tratamento estatístico dos resultados, será também essencial um incremento da sensibilidade dos ensaios que poderá ser obtido explorando outras regiões genómicas alvo alternativas às utilizadas no presente estudo.
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