INSA - Dissertações de mestrado
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Recent Submissions
- Harmonização dos valores de anticorpos IgG contra a proteína Spike do vírus SARS-CoV-2Publication . Saraiva, Ana Leonor Fonseca; Afreixo, Vera; Gaio, VâniaO surgimento da COVID-19 conduziu ao rápido desenvolvimento de vacinas e testes de diagnóstico. Para avaliar a resposta de anticorpos IgG contra a proteína Spike do vírus SARS-CoV-2 (IgG anti-S SARS-CoV-2) em profissionais de saúde do meio hospitalar, foi realizado um estudo de coorte entre 2020 e 2022 em três centros hospitalares portugueses: Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO), Centro Hospitalar Tondela-Viseu (CHTV) e Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC). Os níveis de anticorpos foram medidos em seis momentos: antes da vacinação, após vacinação completa, aos 3, 6 e 12 meses após a segunda dose, e após a dose de reforço. Cada hospital utilizou um método analítico distinto: CMIA da Abbott, ECLIA Elecsys® da Roche e ADVIA Centaur® da Siemens, o que gerou desafios na comparabilidade dos dados. O presente estudo teve como objetivo harmonizar os anticorpos IgG anti-S SARS-CoV-2 entre os hospitais para permitir uma análise conjunta e uma melhor compreensão da dinâmica da imunidade nos profissionais de saúde em Portugal. Para assegurar uma conversão adequada dos títulos de anticorpos obtidos por métodos laboratoriais diferentes, foram aplicadas e comparadas várias estratégias de harmonização, nomeadamente a conversão internacional proposta pela Organização Mundial da Saúde (WHO) e a interpolação de quantis, seguida da aplicação de regressão de Deming. A interpolação de quantis seguida de regressão revelou-se mais eficaz do que a conversão recomendada pela OMS, ao preservar as características individuais de distribuição dos dados de cada hospital e ao permitir que os valores harmonizados refletissem a escala e a magnitude do método usado como referência (CMIA da Abbott). Após a harmonização, observou-se o padrão esperado de tendência temporal do título de anticorpos, com um aumento acentuado após a vacinação, seguido de um declínio ao longo dos meses e, por fim, um novo aumento mais pronunciado após a dose de reforço. Embora não tenha sido realizada uma validação laboratorial através da análise cruzada das amostras, uma limitação importante para a confirmação definitiva da abordagem, a metodologia demonstrou ser prática, reprodutível e com elevado potencial de aplicação em estudos multicêntricos e multinacionais que requerem a integração de dados serológicos obtidos por diferentes plataformas, nomeadamente no âmbito de colaborações europeias e internacionais. Após a harmonização, a análise estatística recorreu a modelos mistos para avaliar a evolução do título de anticorpos ao longo do tempo e a regressões lineares para analisar separadamente cada fase. Os modelos mistos evidenciaram aumentos significativos após a vacinação e o reforço, destacando diferenças entre os centros hospitalares. Nas análises por fase, além das variações entre os centros hospitalares no período pós-reforço, observou-se que indivíduos acima dos 50 anos apresentaram uma resposta imunitária superior. Estes resultados sugerem que tanto as características individuais como as diferenças institucionais influenciaram a resposta imunitária dos profissionais de saúde.
- Pesquisa de bactérias entéricas multirresistentes em perus produzidos para consumo humano - Existe risco para a Saúde Pública?Publication . Martins, Margarida Isidro; Pista, Ângela; Pina, FranciscoAs doenças de origem alimentar constituem um grave problema de saúde pública, e os produtos alimentares de origem animal são uma das principais fontes de contaminação. Igualmente preocupante é o aumento de estirpes multirresistentes. Este estudo teve como objetivo analisar o papel dos perus enquanto reservatórios e potenciais fontes de transmissão de Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp. e Shigella spp. ao Homem, através do isolamento e caracterização fenotípica e genotípica destas bactérias de fezes (n = 108) e carnes cruas de peru (n = 33), em Portugal. Em nenhuma das matrizes foi isolada Shigella spp., enquanto Salmonella spp. foi apenas isolada numa amostra de fezes (0,9%). Isolou-se E. coli em todas as amostras de fezes e em 90,9% das amostras de carne. E. coli enteropatogénica foi identificada em 0,9% dos isolados de fezes. Os 138 isolados de E. coli sequenciados apresentaram genes de virulência de E. coli patogénica extraintestinal e 31,2% foram classificados como E. coli patogénica aviária. Foi observada uma grande diversidade de serotipos e sequências tipo. Salmonella Newport foi suscetível aos antibióticos testados. Em E. coli, foram observadas resistências em 74,1% dos isolados de fezes e 90,0% dos de carne, e, respetivamente, 52,8% e 70,0% foram multirresistentes. No geral, as resistências mais frequentes foram à ampicilina, tetraciclina e ciprofloxacina, e foram identificados cinco isolados produtores de beta-lactamases de espetro alargado. Oito isolados de E. coli apresentaram genes de resistência para a colistina (mcr-1.1). A análise filogenética dos isolados de E. coli permitiu identificar 13 clusters. Foi identificado um cluster entre o isolado de Salmonella Newport e outro isolado nacional. Os resultados deste estudo realçam o papel dos perus como uma potencial fonte de doenças zoonóticas para o Homem e a importância da abordagem One Health, de forma a garantir a segurança alimentar e promover a saúde pública.
- Prediction of Genes Associated With Autism Spectrum Disorder Using Sequence and Graph Embedding MethodsPublication . Inácio, João Pedro da Silva; Martiniano, Hugo; Vicente, AstridNeurodevelopmental disorders impose a significant social and economic burden on individuals with these conditions and their families. Given that all neurodevelopmental disorders have a genetic component, identifying the risk genes for these disorders enhances our understanding of their etiology and can aid in the development of future screening methods and targeted therapies. Autism Spectrum Disorder (ASD) is a prototypical complex neurodevelopmental disorder characterized by high heritability and a heterogeneous genetic architecture and phenotypic presentation. This thesis presents a Machine Learning (ML) approach that improves upon state-of-the-art methods for ASD risk gene prediction, this thesis presents a Machine Learning (ML) approach capable of improving state-of-the-art methods for ASD risk gene prediction. To achieve this goal, a novel approach is created using publicly available ASD-associated genes and graph and sequence gene embeddings with supervised ML classifiers. Using a 5-fold nested stratified cross-validation, the pipeline achieved an AUC of 0.90, F1 of 0.82, and MCC of 0.77. Additionally, the top decile of the ranked list of predicted risk genes generated by the model was significantly enriched for ASD phenotypes but not other brain-specific disorders. The proposed pipeline improved state-of-the-art approaches in predicting genes targeted by LOF mutations in the MSSNG and SCC studies. A functional network characterization of the top decile identified four distinct communities significantly enriched for biological pathways associated with ASD. Of the 50 top predicted genes by the pipeline, 37 were already present in ASD risk gene databases, while 13 were not yet linked to ASD. The 13 genes were significantly enriched in the cerebral cortex, and the telencephalon cell migration processes critical for brain development and linked to neurodevelopmental disorders. This thesis provides an accurate comparison of embedding methods for risk gene discovery and improves existing ASD risk gene predictions, taking a step closer to a better understanding of this complex genetic disorder.
- Estudos Funcionais de Variantes no Gene APOB em Doentes com Diagnóstico Clínico de Hipercolesterolemia FamiliarPublication . Ramos, Diana Catarina Fernandes; Bourbon, Mafalda; Alves, Ana CatarinaA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma doença caracterizada por níveis elevados de colesterol LDL, que se acumulam nas artérias, promovendo o desenvolvimento precoce de eventos cardiovasculares. Geneticamente, a FH é transmitida de forma autossómica semi-dominante, sendo causada por variantes nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As variantes no gene APOB afetam a ligação do colesterol LDL ao seu recetor, representando 5 a 10% dos casos de FH. No entanto, para a maioria das variantes identificadas, o efeito funcional na proteína ainda não está determinado. Esta dissertação teve como objetivo principal investigar a correlação entre fenótipo e genótipo, além de caracterizar funcionalmente variantes identificadas no gene APOB em indivíduos com diagnóstico clínico de FH na população portuguesa. Como objetivo secundário, foi desenvolvida uma base de dados que reúne todas as variantes deste gene com estudos funcionais realizados até ao momento. A identificação das variantes foi realizada por sequenciação de nova geração (NGS) e confirmada por PCR e sequenciação de Sanger, seguida da pesquisa da variante nos familiares dos casos index. As variantes em estudo foram identificadas no âmbito do projeto EPHF. O LDL dos participantes foi isolado por ultracentrifugação a partir do soro de casos index e familiares com variantes no gene APOB, bem como de indivíduos normolipidémicos. Este LDL foi marcado com fluorescência e incubado em células CHO-ldlΔ7 para avaliar a capacidade de ligação e internalização do LDL. A caracterização funcional, realizada por citometria de fluxo com LDL fluorescente, revelou que as variantes p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu) e p.(Arg4519Thr) apresentavam ligação e internalização normais do LDL, indicando que estas variantes não comprometem a função da proteína. Este trabalho destaca a importância de caracterizar funcionalmente as variantes no gene APOB para melhorar o diagnóstico dos indivíduos com FH, possibilitando tratamentos mais adequados a cada caso e contribuindo para a redução do risco cardiovascular.
- Pesquisa de Deleções/Duplicações em Genes Associados a Cancro Hereditário por MLPA DigitalPublication . Alves, Beatriz Correia; Gonçalves, João; Melo, Maria Joana Lima BarbosaA presença, na linha germinativa, de Variações do Número de Cópias (CNV) em genes de predisposição para cancro hereditário pode aumentar a suscetibilidade a esta doença. A identificação de uma CNV patogénica ou provavelmente patogénica num doente oncológico tem um impacto significativo na gestão clínica do indivíduo afetado e dos seus familiares. Tradicionalmente, a pesquisa de CNV no diagnóstico molecular de cancro hereditário é realizada apenas para alguns genes através do MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) convencional. Nos últimos anos, o desenvolvimento de softwares de análise in silico de CNV com base em dados de NGS (Next-Generation Sequencing) representou um avanço significativo, ao possibilitar a pesquisa de deleções e duplicações em múltiplos genes em simultâneo. No entanto, estas ferramentas apresentam ainda limitações. Dada a relevância de uma análise abrangente que integre o maior número possível de genes relevantes no âmbito da patologia em causa, este trabalho teve como principal objetivo implementar uma nova metodologia de pesquisa de CNV em genes associados a cancro hereditário, que combina os princípios do MLPA convencional com a capacidade da NGS de analisar vários genes em simultâneo: o MLPA digital. Neste estudo, foi realizada a pesquisa de CNV por MLPA digital em amostras de doentes com história clínica e familiar de cancro, seguida de validação dos resultados utilizando outras metodologias de genética molecular e classificação das variantes identificadas segundo as recomendações da CanVIG-UK. O MLPA digital demonstrou ser eficaz na deteção de deleções e duplicações em genes associados a cancro hereditário, apresentando um desempenho adequado para a utilização em laboratórios clínicos, com sensibilidade de 100% e especificidade de 98%. A eficácia dos softwares de pesquisa in silico panelcn.MOPS e DRAGEN Enrichment foi confirmada através da concordância entre os resultados destas ferramentas e do MLPA digital. Foram identificadas cinco variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas nos genes APC, BRCA1, BRCA2 e CHEK2, que justificam os fenótipos dos doentes. Este estudo demonstra que o MLPA digital é uma alternativa ao MLPA convencional na primeira fase de pesquisa molecular de CNV germinativas em genes associados a cancro hereditário, permitindo a análise de múltiplos genes em várias amostras em simultâneo.
- The mechanism of nonsense-mediated mRNA decay and its playersPublication . Subtil, Catarina; Loison, Luísa; Santos, Rafaela LacerdaNonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a post-transcriptional surveillance mechanism harbouring two functions: identification and degradation of transcripts containing premature translation-termination codons (PTC), preventing deleterious effects in the cell; and downregulation of mRNAs in response to cellular needs, maintaining the quality of gene expression. One-third of gene mutations in human genetic diseases, including cancer, are due to nonsense mutations or frameshift that result in transcripts harbouring nonsense codons and can be eliminated by NMD. The several factors involved in this mechanism may act in diverse ways depending on the set of transcripts to be regulated, contributing to the branching of this pathway. Cytoplasmic DIS3 exosome independent 3′-5′ exoribonuclease 2 (DIS3L2) has been reported as one of the factors to induce NMD targets decay. Therefore, this study aims to enlighten how DIS3L2 functions in NMD: i) analyse the correlation between the distinct branches of NMD and cervical and uterus cancer; ii) investigate which branch guides DIS3L2-mediated degradation; and iii) test which region of the NMD/DIS3L2-targets mediate DIS3L2 degradation through a system of hybrid-genes. For our first aim, we detected no correlation between any of the branches of NMD and uterus and cervical cancer. Each factor acts independently. In our second objective, we analysed the mRNA expression of five transcripts, but none displayed a significant alteration in their expression to infer a correlation between DIS3L2 and a particular NMD branch. Relatively to the last aim, we successfully cloned three out of the four constructs but due to time constrictions we could not continue. Nonetheless, further testing is needed to better understand this mechanism and how transcript degradation is mediated, including the diverse factors needed for its activation, which might be the key to future advanced therapeutic strategies.