INSA - Dissertações de mestrado
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- Conhecer a epidemiologia da infeção por vírus da imunodeficiência humana tipo 2 (VIH-2) em indivíduos residentes em Portugal: o que mudou nas últimas décadas?Publication . Mendes, Inês Filipa Santos; Pádua, Elizabeth; Piedade, JoãoThe main objectives of this study were to analyse the epidemiological evolution of HIV-2 infection in Portugal using demographic, clinical and laboratory data corresponding to samples from HIV-2-infected parturients received at INSA, and to conduct the molecular characterisation of HIV-2 in a convenience sample, focusing on the phylogenetic classification of viruses and identification of resistance mutations. The analysis of the overall sample received at the laboratory between 2006 and 2023 was based on known demographic and clinical data. The molecular analysis of HIV-2 was performed on selected samples, subjected to DNA extraction, nested-PCR amplification of the PR-RT and IN regions of the pol gene and the amplified samples sequenced by the Sanger method. The results obtained were discovered with several bioinformatics programs, the respective phylogenetic trees were constructed and the search for resistance mutations was carried out with available international databases. An analysis of data from samples of the total population (n=183) revealed that 16.6% of the parturients infected with HIV-2 were Portuguese, but there was a clear predominance of women born in Africa (83.4%), mostly in Guinea-Bissau and in the age group of 30-39 years. Between 2006 and 2023, an apparent general improvement in the immunological situation was observed, with an increase in the proportion of women with CD4+ T cells above 500 cells/μL and an increase in the rate of adherence to ART during pregnancy (56.2% to 64.0%), which was higher among African women (69.6%) compared to Portuguese women (66.7%). Over time, a transition from ART regimens containing only NRTI to NRTI regimens combined with INSTI was achieved, and between 2018 and 2023, this regimen was prescribed to 56.5% of parturients. The analysis of the selected convenience sample (n=99) proved to be representative of the total samples received in the laboratory between 2011 and 2023, for the demographic and clinical variations analysed. Amplification was successful in 48.5% of the samples for PR-RT and 46.5% of the samples for IN, with all sequences phylogenetically in HIV-2 group A and excluded of cluster A2. It was observed that 12 sequences derived from samples of 12 women presented mutations of interest, namely, in 7 of 45 sequences of the RT group and in 5 of 35 sequences of the IN group. Three sequences from each group presented accessory mutations associated with a possible reduction in susceptibility to antiretrovirals (I75V, V111I and F214L in RT and I84V, A153S in IN). However, resistance mutations were identified in 4 RT sequences and 2 IN sequences (K70R, Q151M, M184V and S215Y in RT and R263K and N155H in IN). This study revealed the need for greater efforts to implement measures to increase adherence to ART, as well as screening for HIV-2 infection, to prevent transmission and improve clinical outcomes in patients. The results produced in this study may contribute to updating knowledge about the epidemiological and molecular characteristics of HIV-2 in Portugal, as well as evidence of the existence of resistance mutations with an impact on the treatment of the infection.
- Bioinformatics toolbox for comparative clustering evaluation of Whole-Genome Sequencing (WGS) pipelines for bacteria routine surveillancePublication . Pereira, Joana Vanessa Gomes; Mixão, Verónica de Pinho; Couto, Francisco José MoreiraWhole-Genome Sequencing (WGS) provides higher resolution than traditional typing to distinguish closely related isolates. As result, disease surveillance increasingly adopts WGS, with international agencies recommending its use in reference laboratories. However, the heterogeneity of workflows and unequal resources raise concerns about inter-laboratory result comparability and, consequently, data sharing and communication. To address these issues, this thesis project developed EvalTree, a Python-based command-line tool to compare clustering results from two typing solutions, including traditional and genome-scale approaches, assessing their congruence at all possible resolution levels. EvalTree accepts two input folders or clustering files, processes them, and produces multiple outputs, including an user-friendly HTML report. When a folder generated by ReporTree, a tool to identify genetic clusters at all possible distance thresholds, is provided as input, EvalTree enables not only the inter-pipeline clustering comparison, but also detection of stable clustering regions, cluster characterization using metadata, and assessment of outbreak signal overlap. EvalTree was validated and benchmarked using a large (2946 isolates) and diverse dataset of Salmonella enterica, showing it accurately reproduces a recently published large-scale evaluation of inter-pipeline congruence at the European level. Its running time was mainly affected by dataset diversity rather than size. To further demonstrate its applicability, EvalTree supported the implementation of the S. enterica genomic surveillance pipeline at the Portuguese National Institute of Health (INSA), by comparing its performance with that of the European Food Safety Authority (EFSA), revealing high cluster congruence and similar resolution power. In summary, EvalTree is a novel bioinformatics tool (available through conda installation) that offers a practical, flexible solution to evaluate cluster congruence between the pipelines of different laboratories, supporting inter-laboratory communication in a One Health framework. It also promotes the long-term sustainability of any pipeline by enabling informed decision-making throughout its life-cycle (e.g., evaluating software updates).
- Development of Cellular and Animal Models for Mucopolysaccharidosis Type IIIPublication . Gonçalves, Francisca; Alves, Sandra; Coutinho, Maria FranciscaA mucopolissacaridose tipo III (MPS IIIA, B, C e D), ou Síndrome de Sanfilippo, é um subgrupo de doenças lisossomais de sobrecarga (DLS). São doenças raras, monogénicas e neurodegenerativas causadas por mutações nos genes que codificam as enzimas responsáveis pela degradação intralisossomal do sulfato de heparano (HS). Os doentes apresentam um fenótipo clínico grave, caracterizado por demência infantil de início precoce e por morte prematura. Embora tenham sido alcançados progressos significativos no seu conhecimento e algumas novas terapias tenham avançado até à fase de ensaios clínicos, ainda existem muitos aspetos dos mecanismos patofisiológicos inerentes a esta síndrome por desvendar, não estando atualmente disponível um tratamento eficaz. Modelos celulares e animais que reproduzam o fenótipo da doença, constituem recursos de grande valor, possibilitando estudos mais aprofundados e incisivos e, a identificação de novos alvos terapêuticos, além de uma triagem mais eficiente de novos fármacos. Neste trabalho procurámos responder a essa necessidade através de: (i) uma caracterização aprofundada de duas linhas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs, do inglês: induced pluripotent stem cells), obtidas por reprogramação de fibroblastos de doentes MPS IIIC e IIID, previamente desenvolvidas no nosso grupo; e (ii) do estabelecimento de duas novas linhas de células estaminais de dentes decíduos esfoliados (SHEDs, do inglês: stem cells from human exfoliated deciduous teeth) derivadas de doentes com MPS IIIB e IIIC. Paralelamente, desenvolvemos um novo modelo animal para MPS IIIB, através da geração de um mutante nulo funcional na geração F0 de peixe-zebra (Danio rerio) através da tecnologia de CRISPR-Cas9.
- Implementation of a data analysis pipeline for the genetic characterization of non-seasonal influenza A WGS samples in the context of laboratory surveillance of viral outbreaksPublication . Pereira, João Luís Gomes; Sobral, Daniel Vieira Noro e Silva; Couto, Francisco José MoreiraBackground: Influenza A viruses (IAV) are rapidly evolving pathogens with high zoonotic and pandemic potential. Their segmented genome allows antigenic drift and reassortment, key drivers of adaptation and cross-species transmission. The ongoing H5Nx panzootic underscores the need for timely genomic surveillance to detect adaptive mutations, reassortments, and antiviral resistance. Existing frameworks such as the INSaFLU-TELEVIR platform, work well for seasonal strains but face challenges with non-seasonal IAV due to reference selection, representation bias, and database redundancies. Objectives: This project aimed to develop an automated pipeline for the genetic characterization of non-seasonal IAV whole-genome sequencing (WGS) samples. Goals were: (1) accurate identification of genomic segments, subtypes/genotypes, host origins and closely-related reference sequences per segment; (2) characterization of mutations of biological relevance, including host adaptation and antiviral resistance; (3) integration of results into user-friendly and machine-readable outputs. Methods: The pipeline, named AFluID (Automatic Influenza Identification pipeline), was implemented in Python and combined clustering (cd-hit), similarity search (BLAST), clade assignment (Nextclade), and mutation screening (FluMut). It was validated on curated datasets from NCBI, GISAID, EQA panels, and Portuguese outbreak samples resulting from an INSA-INIAV-IP cooperation. Results: AFluID rapidly identified IAV segments and subtypes across datasets, while its multi-feature design further streamlined the identification of closely-related references (and detection of reassortment events), along with clade classification, host/geographic inference, and identification of mutations potentially linked to adaptation, virulence, and resistance. Proof-of-concept analysis of outbreak samples confirmed applicability in real surveillance scenarios. Conclusions: AFluID addresses major limitations of current pipelines by offering an automated, scalable, and reproducible framework tailored for non-seasonal IAV. Although reassortment detection requires further refinement, the pipeline strengthens laboratory surveillance capacity and represents a step toward integration with global frameworks such as INSaFLU.
- Associação entre o Índice de Vulnerabilidade à Pobreza Energética e os Níveis de Tensão Arterial na População PortuguesaPublication . Rodrigues, Madalena; Gouveia, João Pedro; Sousa-Uva, MafaldaEm Portugal, estima-se que entre 1,8 e 3 milhões de pessoas vivam em situação de pobreza energética, estando entre 609 mil e 660 mil em condição severa. A exposição a temperaturas extremas dentro das habitações pode agravar problemas de saúde existentes e aumentar o risco de doenças cardiovasculares, como a hipertensão arterial, que afeta cerca de 36% da população portuguesa entre 25 e 74 anos. A pobreza energética resulta da combinação de baixos rendimentos, má eficiência energética das habitações e dificuldades no pagamento das faturas de energia. Este problema é intensificado pelas alterações climáticas, que elevam a frequência de eventos extremos. Apesar das preocupações expressas em políticas europeias, poucos estudos populacionais avaliaram a associação entre pobreza energética e saúde utilizando medidas objetivas. Este trabalho tem como objetivo estimar a associação entre o Índice de Vulnerabilidade à Pobreza Energética (IVPE) desenvolvido ao nível da freguesia (#3092) e os níveis de tensão arterial na população adulta portuguesa. Trata-se de um estudo epidemiológico, observacional, transversal e analítico, com dados do Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico 2015 (INSEF), abrangendo 4911 indivíduos de 25 a 74 anos. O IVPE foi categorizado em tercis (baixo, médio e alto) e as associações foram analisadas por regressão linear, ajustada para fatores sociodemográficos e económicos. Os resultados evidenciam que viver em áreas com elevada vulnerabilidade à pobreza energética está associado a um aumento significativo da tensão arterial. No contexto do arrefecimento, observou-se um acréscimo de 2,28% na Tensão Arterial Sistólica (TAS) e de 2,08% na Tensão Arterial Diastólica (TAD), enquanto para o aquecimento verificou-se um aumento significativo na TAS, mas sem relevância na TAD. Estes reforçam a pobreza energética como um fator de risco relevante para a saúde, sublinhando a necessidade de políticas públicas eficazes para mitigar os seus impactos. Num contexto de alterações climáticas e envelhecimento da população portuguesa, garantir condições habitacionais adequadas pode ser uma estratégia essencial para reduzir desigualdades sociais, promover a saúde e o bem-estar, bem como aliviar a pressão sobre os sistemas de saúde pública.
- Desenvolvimento de uma metodologia para sequenciação de regiões altamente polimórficas de HCMV para avaliação dos perfis mutacionais da população viralPublication . Carrasqueira, Patrícia Isabel Barreiros; Ferreira, Rita; Paixão, Paulo; Chasqueira, Maria de JesusO citomegalovírus humano (HCMV, do inglês human cytomegalovirus) possui um genoma de ~236 kb sendo o herpesvírus que causa infeções no Homem com maior diversidade genética conhecida. Apesar dos inúmeros esforços para associar os polimorfismos virais e a diversidade da população intra- paciente com o aumento da aptidão viral, com os resultados clínicos e com a latência, as correlações permanecem inconclusivas. Neste estudo, foi desenvolvido um ensaio de tilling PCR multiplex para a sequenciação simultânea de múltiplas regiões genómicas hipervariáveis do HCMV, com o objetivo de caracterizar o polimorfismo deste vírus. Para tirar partido do potencial da sequenciação direcionada de última geração (tNGS, do inglês targeted next-generation sequencing), foi concebida uma tilling PCR multiplex para amplificação de ~ 8% do genoma de HCMV em 7 regiões discretas abrangendo 14 loci polimórficos de interesse (UL33, UL55, UL73, UL74, UL75, UL100, UL115, UL128, UL130, UL131A, UL144, UL146, UL147 e UL147A). Esta abordagem teve por base o desenho de 145 primers diferentes que em conjunto originam 51 amplicões. A otimização de todo o workflow foi realizada tanto ao nível técnico como ao nível da análise bioinformática, com resultados muito promissores. A metodologia foi aplicada a um conjunto de 30 amostras clínicas, tendo-se verificado que cinco apresentavam resultados compatíveis com infeções mistas, sendo que nenhuma destas provinha de infeções congénitas. Da sequenciação das 7 regiões das restantes 25 amostras resultaram sequências consensus de elevada qualidade para a maior parte delas correspondendo a uma elevada taxa de sucesso de 92.6% (162/175). De notar que embora o sucesso da metodologia tenda a diminuir com menores cargas virais foi total mesmo para amostras clínicas com carga viral mais baixa (Ct>25). Verificou-se ainda que, tanto ao nível das sequências concatenadas como gene-a-gene, as amostras clínicas portuguesas não só apresentavam variabilidade genética idêntica à já identificada no conjunto global das sequências retiradas do NCBI (n = 344) como apresentavam diferentes níveis de diversidade entre si. Por fim, focando a análise de polimorfismo em pares de amostras de 3 hospedeiros diferentes verificou-se que estas não apresentavam quaisquer diferenças entre si. Em conclusão a metodologia desenvolvida abre perspetivas promissoras para investigações futuras, que permitam estudar a relação entre polimorfismos do HCMV, a sua aptidão viral e correlacioná-los com os desfechos clínicos.
- Investigação laboratorial do vírus monkeypox e avaliação das medidas de biossegurança nos laboratórios em PortugalPublication . Francisco, Rafaela Maria da Costa Godinho Dias; Cordeiro, Rita; Barroso, Maria HelenaO vírus monkeypox (MPXV), pertencente ao género Orthopoxvirus (OPXV), emergiu como um agente patogénico de relevância crescente devido à sua capacidade de transmissão sustentada fora das regiões endémicas e ao declínio da imunidade populacional após a interrupção da vacinação contra a varíola. Na sequência do surto multinacional de 2022 e da continuidade de novas cadeias de transmissão nos anos seguintes, tornou-se essencial reforçar a investigação virológica, epidemiológica e serológica, bem como avaliar de forma sistemática as condições de biossegurança e bioproteção nos laboratórios de referência. Este trabalho teve como objetivos: analisar os aspetos epidemiológicos, virológicos e genómicos dos casos suspeitos e confirmados durante o terceiro surto de mpox registado em Portugal; avaliar o potencial de diagnóstico clínico incorreto com varicela durante o primeiro surto; determinar a resposta serológica IgG anti-OPXV em indivíduos com e sem confirmação laboratorial de mpox; e caracterizar as práticas de biossegurança e bioprotecção em laboratórios portugueses, incluindo laboratórios BSL-3. Os resultados revelaram a circulação de múltiplas sublinhagens do clade IIb, demonstrando que o surto resultou de várias introduções independentes. Verificou-se um predomínio de casos em homens adultos jovens e maior positividade em exsudados de lesão. A investigação do diagnóstico diferencial mostrou que uma proporção significativa das amostras inicialmente suspeitas correspondia a infeções por VZV. A análise serológica evidenciou variação dos títulos de IgG entre grupos etários e clínicos, destacando a influência da imunidade prévia à varíola nos indivíduos mais velhos. A avaliação da biossegurança e bioproteção identificou níveis heterogéneos de maturidade e áreas prioritárias de melhoria, especialmente nos sistemas de gestão e nas práticas de resposta a emergências. Globalmente, este estudo contribui para o reforço da vigilância laboratorial e epidemiológica da mpox em Portugal, fornecendo evidência científica crucial para a preparação e resposta a futuras emergências biológicas. Os resultados sublinham ainda a importância estratégica da biossegurança e bioproteção na manipulação de agentes emergentes e na mitigação dos riscos associados.
- Variantes no gene APOB associadas a hipobetalipoproteinemia e hipercolesterolemia familiar: estudos funcionais e relação genótipo/fenótipoPublication . Rato, Inês de Carvalho Santos; Alves, Ana Catarina; Bourbon, MafaldaAs dislipidemias são um grupo de patologias caracterizadas por alterações no perfil lipídico, podendo incluir fenótipos de hiperlipidemia ou hipolipidemia. A apolipoproteína B (apoB), principal componente proteico do colesterol LDL (c-LDL), desempenha um papel essencial na regulação dos níveis de colesterol no sangue. Variantes no gene APOB estão associadas a condições distintas como a hipercolesterolemia familiar (FH) e a hipobetalipoproteinemia familiar (FHBL). A FH caracteriza-se por níveis elevados de c-LDL, que podem levar ao desenvolvimento de aterosclerose e doença coronária prematura. Por outro lado, a FHBL apresenta níveis reduzidos de c-LDL e está associada a complicações hepáticas, nutricionais e neurológicas. A compreensão dos efeitos das variantes no gene APOB é fundamental, sendo os estudos funcionais uma ferramenta indispensável, especialmente com o avanço da sequenciação de nova geração (NGS), que permite a análise completa do gene. O presente trabalho visou realizar estudos funcionais de variantes no gene APOB associadas a estas duas patologias, com o objetivo de aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos moleculares subjacentes. A análise de variantes descritas na base de dados ClinVar revelou um elevado número associado tanto à FH como à FHBL, com muitas classificadas como variantes de significado clínico incerto (VUS). Foram realizados ensaios funcionais utilizando citometria de fluxo a partir de LDL de indivíduos com variantes no gene APOB associadas à hipercolesterolemia. Os resultados não identificaram nenhuma das variantes analisadas como causadora do fenótipo observado nos indivíduos. Consequentemente, não foi possível alterar a classificação destas variantes, que permanecem de significado incerto. Adicionalmente, foram analisados casos de FHBL e discutidas possíveis abordagens para estudos funcionais futuros. Este trabalho reforça a relevância de estudos funcionais para esclarecer o papel das variantes no gene APOB nas dislipidemias, contribuindo para um melhor diagnóstico e caracterização destas condições.
- Regulation of PERK gene expression by its upstream open reading framesPublication . Ponte, João Gonçalves da; Zilhão, Rita; Romão, LuísaUpstream open reading frames (uORFs) are cis-acting elements located within the 5’ untranslated region (5’UTR) of transcripts, which can regulate the translation of the corresponding main open reading frame (mORF). In normal conditions, uORFs are typically repressors of downstream translation, as they can block ribosomal access to the mORF or even induce mRNA degradation through the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. However, in stress conditions, phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) allows the expression of several stress-responsive proteins via uORF-mediated mechanisms, while global mRNA translation is inhibited. During endoplasmic reticulum (ER) stress, the accumulation of unfolded proteins leads to activation of the ER-resident PKR-like ER kinase (PERK), which will phosphorylate the α-subunit of eIF2 as part of the stress-protective mechanisms of the unfolded protein response (UPR) and integrated stress response (ISR). This results in selective uORF-mediated translation of downstream effectors, which will drive stress resolution or cell death in case of prolonged stress. The dual role of PERK in regulating cell fate is implicated in a growing list of pathophysiological conditions, including neurological and cardiovascular diseases, ophthalmological disorders, viral infections, cancer, and diabetes. Moreover, mutations in the EIF2AK3 gene encoding PERK are implicated in a rare autosomal recessive disorder, the Wolcott-Rallison Syndrome (WRS). Data from ribosome-profiling (Ribo-seq) studies indicate the existence of uORFs within PERK 5’UTR which could be involved in regulating PERK expression. This work aims to study the translational regulatory role of the uORFs identified in PERK’s 5’UTR and estimate its impact on cell homeostasis and human disease. We wish to highlight the importance of including 5’UTRs in the screening of disease-related mutations, as well as the necessity of functional studies to assess their relevance in the pathogenesis of human diseases, as it may provide vital information for developing new therapeutic strategies.
- Hazard characterisation of bisphenol A alternatives to improve risk assessment for human health: genotoxic and carcinogenic effects in mammalian cellsPublication . Pereira, Maria João Rodrigues; Silva, Maria João; Farinha, CarlosBisphenol A (BPA) is a compound used in the production of epoxy resins, polycarbonate plastics and as an additive (e.g. in thermal paper). It is present in several different products and has been detected both in the environment and in human matrices. BPA is a known endocrine disruptor, with several studies linking it to multiple harmful health effects. Therefore, there is an effort to phase out its use, but also to replace it with alternative substances. Various alternatives are already being used and have been detected in the environment and human matrices. Furthermore, some harmful health effects have also been reported for those substances (albeit not as many as BPA), justifying the need for more research on these alternatives. This thesis is part of the Partnership for the Assessment of Risks from Chemicals (PARC), that prioritized alternatives based on the lack of data on their effects on human health and due to human exposure to them occurring or being likely to occur. This thesis focused on BPS-MAE and BPAP, aiming to contribute to their hazard assessment, through the characterisation of their in vitro genotoxic and carcinogenic potential. The former was assessed for BPS-MAE and BPAP with the Cytokinesis-Block Micronucleus assay, in human peripheral blood lymphocytes. The results suggest that BPS-MAE and BPAP do not have a genotoxic effect at the concentrations and exposure times tested. Genotoxic and non-genotoxic carcinogenicity of BPAP and BPA was ascertained with the Cell Transformation assay, in Bhas 42 cells. BPA was tested to allow inter-laboratory comparison of results and assay optimisation. The results indicate that neither BPAP nor BPA have potential carcinogenic activity at the concentrations and treatment durations tested. The data obtained will help eliminating existing data gaps, aid to improve these alternatives’ risk assessment and contribute to the formulation of legislation, if necessary.
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