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Publicação
Regulation of PERK gene expression by its upstream open reading frames
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Resumo(s)
Upstream open reading frames (uORFs) are cis-acting elements located within the 5’ untranslated region (5’UTR) of transcripts, which can regulate the translation of the corresponding main open reading frame (mORF). In normal conditions, uORFs are typically repressors of downstream translation, as they can block ribosomal access to the mORF or even induce mRNA degradation through the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. However, in stress conditions, phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) allows the expression of several stress-responsive proteins via uORF-mediated mechanisms, while global mRNA translation is inhibited. During endoplasmic reticulum (ER) stress, the accumulation of unfolded proteins leads to activation of the ER-resident PKR-like ER kinase (PERK), which will phosphorylate the α-subunit of eIF2 as part of the stress-protective mechanisms of the unfolded protein response (UPR) and integrated stress response (ISR). This results in selective uORF-mediated translation of downstream effectors, which will drive stress resolution or cell death in case of prolonged stress. The dual role of PERK in regulating cell fate is implicated in a growing list of pathophysiological conditions, including neurological and cardiovascular diseases, ophthalmological disorders, viral infections, cancer, and diabetes. Moreover, mutations in the EIF2AK3 gene encoding PERK are implicated in a rare autosomal recessive disorder, the Wolcott-Rallison Syndrome (WRS). Data from ribosome-profiling (Ribo-seq) studies indicate the existence of uORFs within PERK 5’UTR which could be involved in regulating PERK expression.
This work aims to study the translational regulatory role of the uORFs identified in PERK’s 5’UTR and estimate its impact on cell homeostasis and human disease. We wish to highlight the importance of including 5’UTRs in the screening of disease-related mutations, as well as the necessity of functional studies to assess their relevance in the pathogenesis of human diseases, as it may provide vital information for developing new therapeutic strategies.
A expressão génica eucariótica é um processo complexo que compreende vários passos altamente regulados. Em particular, a tradução do RNA mensageiro (mRNA) representa um passo chave da expressão génica, cuja regulação permite à célula rapidamente alterar a síntese proteica de uma forma espacial e temporal em resposta a diferentes estímulos. O processo de tradução divide-se em quatro etapas: iniciação, alongamento, terminação e reciclagem de ribossomas. A etapa de iniciação representa o passo limitante e, como tal, é o mais regulado. Essa regulação ocorre com o envolvimento de múltiplos fatores e elementos em cis. De entre os múltiplos elementos que podem regular esta etapa, encontram-se as pequenas grelhas de leitura a montante da grelha principal (do inglês, upstream open reading frames, uORFs), que correspondem a pequenas regiões potencialmente traduzidas definidas por um codão de iniciação na região 5’ não traduzida (do inglês, 5’ untranslated region, 5’UTR) dos mRNAs, em fase com um codão de terminação a montante ou sobreposto com a grelha de leitura principal (do inglês, main open reading frame, mORF) que codifica a proteína. As uORFs são tipicamente consideradas repressoras da tradução em condições fisiológicas normais, uma vez que funcionam como “barreiras” aos ribossomas que, ao traduzirem-nas, podem não chegar a traduzir a mORF. Outra característica reguladora importante das uORFs é a possibilidade de induzirem a degradação do mRNA pelo processo de decaimento do RNA mensageiro mediado por mutações “nonsense” (do inglês, nonsense-mediated mRNA decay, NMD), uma vez que os seus codões de terminação podem ser reconhecidos como prematuros aquando da terminação da tradução. Contudo, em condições de stress, as uORFs são muitas vezes responsáveis por permitir a tradução de determinadas mORFs. Isto acontece porque nestas condições ocorre a fosforilação do fator eucariótico de iniciação da tradução 2α (do inglês, eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α), o que favorece o não reconhecimento de codões de iniciação de algumas uORFs normalmente com contextos Kozak fracos (do inglês, leaky scanning ou ribossome bypass). A proteína cinase tipo PKR residente no retículo endoplasmático (do inglês, PKR-like ER kinase, PERK) é uma das responsáveis por fosforilar o eIF2α em condições de stress. Estruturalmente, a PERK é uma proteína transmembranar do retículo endoplasmático (ER) que possui três domínios: (i) um domínio lumenal regulatório; (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio catalítico citoplasmático. Em condições de homeostasia, a PERK encontra-se num estado monomérico inativo promovido por chaperonas. No entanto, quando ocorre stress do ER, a acumulação de proteínas mal enroladas promove a oligomerização de domínios lumenais da PERK, causando uma aproximação dos respetivos domínios citoplasmáticos de forma a promover a sua auto fosforilação e consequente ativação. Uma vez ativada, a PERK fosforila o eIF2α de forma a inibir globalmente a tradução do mRNA como mecanismo de proteção, enquanto favorece a tradução mediada por uORFs de proteínas responsáveis por aumentar a capacidade processadora do ER como parte dos mecanismos da resposta a proteínas mal enroladas (do inglês, unfolded protein response, UPR) e da resposta integrada ao stress (do inglês, integrated stress response, ISR). Dentro destas proteínas encontra-se a ATF4 (do inglês, activating transcription factor 4), a CHOP (do inglês, CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein) e a GADD34 (do inglês, growth arrest and DNA damage inducible protein 34) que, no caso de um estímulo prolongado ou intenso, podem também desencadear vias pró-apoptóticas. O papel da PERK na regulação da homeostasia da célula e da sua sobrevivência tem sido implicado em várias doenças, incluindo doenças neurológicas, cardiovasculares e oftalmológicas, bem como infeções virais, cancro e diabetes mellitus. Além disso, mutações no gene que codifica a PERK (o gene EIF2AK3) foram associadas ao desenvolvimento de uma doença rara autossómica recessiva, síndrome de Wolcott-Rallison (do inglês, Wolcott Rallison syndrome, WRS), caracterizada por diabetes mellitus neonatal permanente e displasia epifisária múltipla. Isto sugere que a expressão e a atividade da PERK são essenciais para o normal funcionamento da célula, devendo ser corretamente reguladas. Curiosamente, dados de perfil ribossomal (do inglês, ribosome profiling) mostram a existência de vários eventos de iniciação de tradução na 5’UTR do mRNA da PERK, incluindo em codões de iniciação de tradução não canónicos, o que sugere a existência de uORFs com potencial regulatório. Tendo em conta a escassez de estudos sobre as uORFs do mRNA da PERK e os seus efeitos nesta mesma proteína, o objetivo do presente trabalho focou-se na complementaridade de estudos realizados em laboratório sobre este mesmo tema. Resumidamente, neste estudo é apresentado um exemplo de um transcrito cuja tradução da mORF é regulada por uORFs. Adicionalmente, destaca-se a importância de se incluírem as 5’UTRs de genes como a PERK, no rastreio de mutações que possam estar associadas ao desenvolvimento de doenças genéticas, bem como o estudo detalhado das suas consequências biológicas. Este tipo de informações é imprescindível para o desenvolvimento de novas terapias ou para a aplicação adequada das já existentes.
A expressão génica eucariótica é um processo complexo que compreende vários passos altamente regulados. Em particular, a tradução do RNA mensageiro (mRNA) representa um passo chave da expressão génica, cuja regulação permite à célula rapidamente alterar a síntese proteica de uma forma espacial e temporal em resposta a diferentes estímulos. O processo de tradução divide-se em quatro etapas: iniciação, alongamento, terminação e reciclagem de ribossomas. A etapa de iniciação representa o passo limitante e, como tal, é o mais regulado. Essa regulação ocorre com o envolvimento de múltiplos fatores e elementos em cis. De entre os múltiplos elementos que podem regular esta etapa, encontram-se as pequenas grelhas de leitura a montante da grelha principal (do inglês, upstream open reading frames, uORFs), que correspondem a pequenas regiões potencialmente traduzidas definidas por um codão de iniciação na região 5’ não traduzida (do inglês, 5’ untranslated region, 5’UTR) dos mRNAs, em fase com um codão de terminação a montante ou sobreposto com a grelha de leitura principal (do inglês, main open reading frame, mORF) que codifica a proteína. As uORFs são tipicamente consideradas repressoras da tradução em condições fisiológicas normais, uma vez que funcionam como “barreiras” aos ribossomas que, ao traduzirem-nas, podem não chegar a traduzir a mORF. Outra característica reguladora importante das uORFs é a possibilidade de induzirem a degradação do mRNA pelo processo de decaimento do RNA mensageiro mediado por mutações “nonsense” (do inglês, nonsense-mediated mRNA decay, NMD), uma vez que os seus codões de terminação podem ser reconhecidos como prematuros aquando da terminação da tradução. Contudo, em condições de stress, as uORFs são muitas vezes responsáveis por permitir a tradução de determinadas mORFs. Isto acontece porque nestas condições ocorre a fosforilação do fator eucariótico de iniciação da tradução 2α (do inglês, eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α), o que favorece o não reconhecimento de codões de iniciação de algumas uORFs normalmente com contextos Kozak fracos (do inglês, leaky scanning ou ribossome bypass). A proteína cinase tipo PKR residente no retículo endoplasmático (do inglês, PKR-like ER kinase, PERK) é uma das responsáveis por fosforilar o eIF2α em condições de stress. Estruturalmente, a PERK é uma proteína transmembranar do retículo endoplasmático (ER) que possui três domínios: (i) um domínio lumenal regulatório; (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio catalítico citoplasmático. Em condições de homeostasia, a PERK encontra-se num estado monomérico inativo promovido por chaperonas. No entanto, quando ocorre stress do ER, a acumulação de proteínas mal enroladas promove a oligomerização de domínios lumenais da PERK, causando uma aproximação dos respetivos domínios citoplasmáticos de forma a promover a sua auto fosforilação e consequente ativação. Uma vez ativada, a PERK fosforila o eIF2α de forma a inibir globalmente a tradução do mRNA como mecanismo de proteção, enquanto favorece a tradução mediada por uORFs de proteínas responsáveis por aumentar a capacidade processadora do ER como parte dos mecanismos da resposta a proteínas mal enroladas (do inglês, unfolded protein response, UPR) e da resposta integrada ao stress (do inglês, integrated stress response, ISR). Dentro destas proteínas encontra-se a ATF4 (do inglês, activating transcription factor 4), a CHOP (do inglês, CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein) e a GADD34 (do inglês, growth arrest and DNA damage inducible protein 34) que, no caso de um estímulo prolongado ou intenso, podem também desencadear vias pró-apoptóticas. O papel da PERK na regulação da homeostasia da célula e da sua sobrevivência tem sido implicado em várias doenças, incluindo doenças neurológicas, cardiovasculares e oftalmológicas, bem como infeções virais, cancro e diabetes mellitus. Além disso, mutações no gene que codifica a PERK (o gene EIF2AK3) foram associadas ao desenvolvimento de uma doença rara autossómica recessiva, síndrome de Wolcott-Rallison (do inglês, Wolcott Rallison syndrome, WRS), caracterizada por diabetes mellitus neonatal permanente e displasia epifisária múltipla. Isto sugere que a expressão e a atividade da PERK são essenciais para o normal funcionamento da célula, devendo ser corretamente reguladas. Curiosamente, dados de perfil ribossomal (do inglês, ribosome profiling) mostram a existência de vários eventos de iniciação de tradução na 5’UTR do mRNA da PERK, incluindo em codões de iniciação de tradução não canónicos, o que sugere a existência de uORFs com potencial regulatório. Tendo em conta a escassez de estudos sobre as uORFs do mRNA da PERK e os seus efeitos nesta mesma proteína, o objetivo do presente trabalho focou-se na complementaridade de estudos realizados em laboratório sobre este mesmo tema. Resumidamente, neste estudo é apresentado um exemplo de um transcrito cuja tradução da mORF é regulada por uORFs. Adicionalmente, destaca-se a importância de se incluírem as 5’UTRs de genes como a PERK, no rastreio de mutações que possam estar associadas ao desenvolvimento de doenças genéticas, bem como o estudo detalhado das suas consequências biológicas. Este tipo de informações é imprescindível para o desenvolvimento de novas terapias ou para a aplicação adequada das já existentes.
Descrição
Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2025. http://hdl.handle.net/10400.5/100871
Investigação desenvolvida no Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge.
Investigação desenvolvida no Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge.
Palavras-chave
ER Stress PERK uORF UPR Wolcott-Rallison Syndrome Síndrome de Wolcott-Rallison Stress do Retículo Endoplasmático Genómica Funcional Genómica Funcional e Estrutural
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