DGH - Dissertações de mestrado
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- Pesquisa de Deleções/Duplicações em Genes Associados a Cancro Hereditário por MLPA DigitalPublication . Alves, Beatriz Correia; Gonçalves, João; Melo, Maria Joana Lima BarbosaA presença, na linha germinativa, de Variações do Número de Cópias (CNV) em genes de predisposição para cancro hereditário pode aumentar a suscetibilidade a esta doença. A identificação de uma CNV patogénica ou provavelmente patogénica num doente oncológico tem um impacto significativo na gestão clínica do indivíduo afetado e dos seus familiares. Tradicionalmente, a pesquisa de CNV no diagnóstico molecular de cancro hereditário é realizada apenas para alguns genes através do MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) convencional. Nos últimos anos, o desenvolvimento de softwares de análise in silico de CNV com base em dados de NGS (Next-Generation Sequencing) representou um avanço significativo, ao possibilitar a pesquisa de deleções e duplicações em múltiplos genes em simultâneo. No entanto, estas ferramentas apresentam ainda limitações. Dada a relevância de uma análise abrangente que integre o maior número possível de genes relevantes no âmbito da patologia em causa, este trabalho teve como principal objetivo implementar uma nova metodologia de pesquisa de CNV em genes associados a cancro hereditário, que combina os princípios do MLPA convencional com a capacidade da NGS de analisar vários genes em simultâneo: o MLPA digital. Neste estudo, foi realizada a pesquisa de CNV por MLPA digital em amostras de doentes com história clínica e familiar de cancro, seguida de validação dos resultados utilizando outras metodologias de genética molecular e classificação das variantes identificadas segundo as recomendações da CanVIG-UK. O MLPA digital demonstrou ser eficaz na deteção de deleções e duplicações em genes associados a cancro hereditário, apresentando um desempenho adequado para a utilização em laboratórios clínicos, com sensibilidade de 100% e especificidade de 98%. A eficácia dos softwares de pesquisa in silico panelcn.MOPS e DRAGEN Enrichment foi confirmada através da concordância entre os resultados destas ferramentas e do MLPA digital. Foram identificadas cinco variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas nos genes APC, BRCA1, BRCA2 e CHEK2, que justificam os fenótipos dos doentes. Este estudo demonstra que o MLPA digital é uma alternativa ao MLPA convencional na primeira fase de pesquisa molecular de CNV germinativas em genes associados a cancro hereditário, permitindo a análise de múltiplos genes em várias amostras em simultâneo.
- The mechanism of nonsense-mediated mRNA decay and its playersPublication . Subtil, Catarina; Loison, Luísa; Santos, Rafaela LacerdaNonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a post-transcriptional surveillance mechanism harbouring two functions: identification and degradation of transcripts containing premature translation-termination codons (PTC), preventing deleterious effects in the cell; and downregulation of mRNAs in response to cellular needs, maintaining the quality of gene expression. One-third of gene mutations in human genetic diseases, including cancer, are due to nonsense mutations or frameshift that result in transcripts harbouring nonsense codons and can be eliminated by NMD. The several factors involved in this mechanism may act in diverse ways depending on the set of transcripts to be regulated, contributing to the branching of this pathway. Cytoplasmic DIS3 exosome independent 3′-5′ exoribonuclease 2 (DIS3L2) has been reported as one of the factors to induce NMD targets decay. Therefore, this study aims to enlighten how DIS3L2 functions in NMD: i) analyse the correlation between the distinct branches of NMD and cervical and uterus cancer; ii) investigate which branch guides DIS3L2-mediated degradation; and iii) test which region of the NMD/DIS3L2-targets mediate DIS3L2 degradation through a system of hybrid-genes. For our first aim, we detected no correlation between any of the branches of NMD and uterus and cervical cancer. Each factor acts independently. In our second objective, we analysed the mRNA expression of five transcripts, but none displayed a significant alteration in their expression to infer a correlation between DIS3L2 and a particular NMD branch. Relatively to the last aim, we successfully cloned three out of the four constructs but due to time constrictions we could not continue. Nonetheless, further testing is needed to better understand this mechanism and how transcript degradation is mediated, including the diverse factors needed for its activation, which might be the key to future advanced therapeutic strategies.
- Regulation of the alternative splicing of RAC1B in tumor cellsPublication . Bizarro, Inês; Gonçalves, Vânia; Jordan, PeterCancer is a molecularly heterogeneous disease that presents genetic modifications in different alternative pathways. Namely, a subgroup of colorectal cancer (CRC) is characterized by the simultaneous presence of an oncogenic mutation in BRAF and overexpression of RAC1B, an alternative splicing variant of the small GTPase RAC1. Together, these two changes stimulate signalling pathways that induce the proliferation and survival of CRC cells. Previously, the splicing factors (SFs) ESRP1 and SRSF1 were reported to promote RAC1B overexpression in this type of tumor, while SRSF3 inhibited it. However, the overexpression of RAC1B has also been identified in breast and lung tumors. As such, this work aimed to study the modulatory role of ESRP1, SRSF1 and SRSF3 on RAC1B alternative splicing in breast and lung cancer cells, using CRC cells as an experimental control since the role of these SFs has already been documented in these types of tumor. The SFs were overexpressed in the cells by co-transfection with a RAC1 minigene and the expression levels of the minigene-derived transcripts were analysed by RT-PCR. Next, the SFs endogenous expression was depleted by siRNA transfection and the endogenous levels of RAC1B transcript and protein were assessed through RT-PCR and Western blot, respectively. The obtained results indicate a role for SRSF1 and SRSF3 in positively and negatively modulating RAC1B alternative splicing, respectively, in both breast and lung cancer cells, as previously described for CRC. Intriguingly, ESRP1 inhibited RAC1B alternative splicing in these cells, revealing an opposite role to what was previously observed for CRC. Although future studies should be performed to confirm these results, ESRP1 and SRSF3 act as inhibitors of RAC1B alternative splicing whereas SRSF1 acts as an enhancer, in both breast and lung cancer cells.
- A tradução não-canónica da proteína UPF1 (up-frameshift 1) e a sua relevância na tumorigénese do cancro colorretalPublication . Antunes Elias, Adriana; Santos, Rafaela; Romão, LuísaA iniciação da tradução é o passo limitante da síntese proteica. Em condições de stresse, a tradução canónica é inibida e a tradução de transcritos específicos é mantida por mecanismos alternativos, como os que envolvem IRES (internal ribosome entry site). A UPF1 (up-frameshift 1) contribui para a tumorigénese no cancro colorretal (CRC, colorectal cancer). Anteriormente neste laboratório verificouse que a região 5'UTR (5’untranslated region) do transcrito de UPF1 apresenta atividade IRES e que esta é mantida em condições de stresse. Assim, esta tese teve como objetivo aferir como a tradução da UPF1 mediada por IRES pode contribuir para a progressão do CRC. As análises in silico realizadas através da plataforma Xena, para medir a variação dos níveis de expressão do transcrito e da proteína entre diferentes tipos de cancro e entre tecidos normais e cancerígenos do cólon, mostraram que a expressão de mRNA e proteína é superior nos tecidos de CRC do que noutros tipos de cancro e também em comparação com os tecidos normais do cólon, sugerindo que a expressão da UPF1 é superior quando esta contribui para a tumorigénese. Adicionalmente, a análise da expressão endógena da UPF1 em células epiteliais cultivadas da mucosa normal do cólon humano (NCM460) e em linhas celulares correspondentes a diferentes estádios de desenvolvimento de CRC (HT29, HCT116 e SW480), expostas a 1 μM de tapsigargina (que induz o stresse do retículo endoplasmático e, portanto, inibe a tradução canónica), revelou que a expressão da UPF1 é mantida em condições nas quais a tradução canónica é inibida, sugerindo que ocorre tradução mediada por IRES e que esta permite a manutenção dos níveis de UPF1 nessas condições. Concluindo, a tradução mediada por IRES contribui para a síntese da UPF1 em tecidos de CRC, o que, por sua vez, contribui para a progressão deste tipo de cancro.
- Contribution to the knowledge of Iron Deficiency and Iron Overload through the study of TMPRSS6 and SLC40A1 genesPublication . Pessoa, Vera; Faustino, Paula; Dias, Deodália Maria AntunesO metabolismo do ferro centra-se no controlo rigoroso da absorção e manutenção do ferro. É através da disrupção da sua homeostasia que surgem doenças associadas à carência ou ao excesso de ferro. No caso da carência de ferro, pode desenvolver-se anemia microcítica e hipocrómica, enquanto uma absorção excessiva de ferro pode conduzir à hemocromatose, com consequente deposição de ferro em alguns tecidos e perda de função de certos órgãos. Tanto na anemia ferropénica como na hemocromatose, pode haver contribuição genética para o seu desenvolvimento. Neste trabalho pretendeu-se compreender o papel dos genes TMPRSS6 e SLC40A1 para o desenvolvimento de patologias associadas ao défice de ferro (Anemia microcítica e hipocrómica) e excesso de ferro (Hemocromatose Hereditária do tipo IV ou Doença da Ferroportina). Pretendeu-se também estudar a patogenicidade das variantes encontradas nestes genes, estabelecer relações genótipo-fenótipo, e compreender a contribuição genética para o desenvolvimento destas doenças. Para o défice de ferro, estudámos 100 participantes do Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico (INSEF), estudo realizado anteriormente no INSA, cujos hemogramas revelavam microcitose e/ou hipocromia. Nos DNAs correspondentes, foi realizada uma pesquisa de variantes no gene TMPRSS por Next-generation sequencing (NGS) e confirmação por sequenciação Sanger. No caso do excesso de ferro, analisámos do ponto de vista estatístico e bioinformático os resultados de NGS do gene SLC40A1, previamente obtidos no nosso laboratório, referentes ao estudo de 110 casos clínicos cujos fenótipos sugeriam a presença de Hemocromatose Hereditária. Realizámos estudos in silico para averiguar a patogenicidade das variantes encontradas no referido gene responsáveis pela Doença da Ferroportina ou da Hemocromatose Hereditária de tipo IV. Na população com microcitose e/ou hipocromia foram identificadas 36 variantes no gene TMPRSS6. Entre elas destacam-se três nunca descritas: duas missense que vieram a demonstrar-se patogénicas, c.1580T>G (p.Phe527Cys) e c.1585T>C (p.Cys529Arg), e uma benigna, de localização intrónica (c.836+27G>C) sem influência no splicing. Quanto aos estudos de associação genótipo-fenótipo, foram encontradas diferenças significativas para a dispersão do volume eritrocitário na presença da Lys244Glu (p=0.028), e para a concentração média de hemoglobina corpuscular na presença da Pro24= (p=0.009). Nesta população, as mutações patogénicas foram encontradas sobre-representadas, assim como os polimorfismos descritos como de risco para o desenvolvimento da patologia, quando comparado com o descrito na literatura para a população em geral. Na população com excesso de ferro foram estudadas sete alterações no gene SLC40A1. Salientando-se três variantes patogénicas raras associadas à Doença da Ferroportina (p.Gly80Ser, p.Val162del, e p.Gly204Ser). Apenas a variante intrónica SLC40A1:c.44-21A>C apresentou associações significativas entre os níveis de Ferro Sérico e Saturação de Transferrina (p<0.001), pois os indivíduos com esta variante apresentavam valores inferiores nestes biomarcadores, indicando um efeito protetor. Em ambas as populações foi possível verificar que os fenótipos mais graves se encontravam associados a variantes patogénicas dos genes TMPRSS6 e SLC40A1. Apesar destas variantes poderem afetar a expressão do gene e poderem causar alterações nas suas respetivas proteínas, dada a complexidade do metabolismo do ferro, é preciso sempre ter uma perspetiva integrada para compreender as implicações que cada uma pode causar.
- Avaliação da Citotoxicidade e Genotoxicidade de Nanomateriais de Celulose em Células do Trato RespiratórioPublication . Cadete, João; Silva, Maria João; Louro, HenriquetaOs nanomateriais (NM) possuem diversas propriedades físico-químicas únicas para utilização em diferentes áreas e aplicações. O desenvolvimento da nanotecnologia tem levado à produção de um número crescente de NM, por exemplo, nanomateriais de celulose (CNM). Com o aumento da sua utilização em diversas indústrias e produtos, a exposição humana a estes CNM irá acentuar-se, ocorrendo a necessidade da avaliação da sua segurança. A literatura já existente tem reportado resultados de toxicidade incoerentes, tanto positivos como negativos, justificando a necessidade de mais investigação nesta área. O trabalho desenvolvido teve o objetivo de avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade de CNM, mais especificamente, microfibrilas de celulose (CMF) e nanocristais de celulose (CNC), em células do trato respiratório, nomeadamente, células do epitélio alveolar humano (células A549) e fibroblastos pulmonares de hamster chinês (células V79). Avaliou-se a citotoxicidade através dos ensaios do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólio (MTT) e clonogénico e a genotoxicidade pelos ensaios do cometa e do micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN). A análise dos resultados mostrou que a exposição de células A549 a 7,2 - 240 μg/mL (1,5 - 50 μg/cm2) de CNC não induziu qualquer efeito citotóxico ou genotóxico. No entanto, após exposição às mesmas concentrações de CMF já se observaram efeitos citotóxicos em células V79, uma vez que se verificou uma diminuição estatisticamente significativa da capacidade de formação de colónias, após 4 dias de tratamento com as duas concentrações mais elevadas (120 e 240 μg/mL). Contudo, a CMF não provocou qualquer citotoxicidade em células A549. No que diz respeito à genotoxicidade, os CNM não induziram quebras significativas no DNA, observando-se, no entanto, danos oxidativos. A segurança de utilização dos CNM ainda não é completamente conhecida, pelo que mais estudos serão necessários para se avaliar a segurança deste tipo de NM. O trabalho aqui desenvolvido contribui para o conhecimento do potencial citotóxico e genotóxico dos CNM.
- Avaliação de efeitos genotóxicos dos nanomateriais de dióxido de titânio em células intestinaisPublication . Roque, Rossana Miriam Goulão; Louro, Henriqueta; Dias, Deodália Maria AntunesOs nanomateriais (NMs) de dióxido de titânio (TiO2) podem ser aplicados em diversas áreas, nomeadamente na indústria alimentar, o que torna a via oral uma das mais importantes vias de exposição a estes NMs. Após a ingestão, o trato gastrointestinal pode ser o primeiro local de contato com os NMs de TiO2. Vários estudos têm investigado se a exposição oral pode causar efeitos adversos locais ou sistémicos, tendo sido obtidos resultados contraditórios que poderão ser explicados através das alterações das propriedades físico-químicas que estes NMs sofrem durante o processo da digestão. O presente estudo tinha por objetivo contribuir para a avaliação do impacto celular dos NMs de TiO2, identificando perigos decorrentes da sua utilização no contexto gastrointestinal, e considerando o efeito do processo da digestão humana nas propriedades físico-químicas destes NMs. Para tal, foi avaliada a genotoxicidade de três NMs de TiO2 -o NM-102, NM-103 e o NM-105- em duas linhas celulares epiteliais intestinais, a Caco-2 e a HT29-MTX-E12, utilizando um modelo de digestão estática in vitro para simular a digestão humana destes NMs e ter em consideração eventuais modificações das características dos NMs que pudessem ocorrer durante este processo. Os resultados do ensaio do cometa convencional com uma exposição de 3h aos NMs de TiO2 (digeridos e não digeridos), realizado para a deteção de danos no DNA, revelaram que, no geral, não ocorreu um aumento relevante de quebras do DNA, embora anteriormente tenham sido observados efeitos genotóxicos com um tempo de exposição de 24h. Conclui-se, assim, que embora num período de exposição curta não ocorram efeitos genotóxicos, um período de exposição mais prolongado aos NMs de TiO2 ingeridos pode constituir um risco para a saúde humana. Relativamente ao ensaio do micronúcleo, realizado com os controlos negativos não digeridos e digeridos, verificou-se que a maior concentração do controlo negativo digerido induziu um aumento na frequência de micronúcleos, comparativamente ao controlo negativo não digerido, em ambas as linhas celulares, o que revela a influência do produto da digestão, mesmo sem NM, sugerindo a necessidade de otimizar o procedimento de digestão para futuras aplicações.
- RAC1B alternative splicing regulation in colorectal cancer cellsPublication . Rosado, Telma; Gonçalves, Vânia; Jordan, PeterColorectal cancer (CRC) is a common malignancy with significant mortality, which presents different subtypes due to genetic heterogeneity. The focus of this work was on a subtype that is characterized by microsatellite instability and mutations in the BRAF gene, being associated, in most cases, with RAC1B overexpression. RAC1B is a splicing variant of the RAC1 gene and is characterized by the inclusion of an additional exon through alternative splicing, designated as exon 3b, presenting some regulation and signalling differences when compared to RAC1. RAC1B has been described as a promoter of tumour progression, therefore, it is considered as a potential therapeutic target, as it may allow the design of targeted therapies for patients with this subtype of CRC, but for this, understanding in more detail the mechanisms of RAC1B regulation is extremely important. Previous research projects in the host lab had already identified SRSF1 and SRSF3 as two splicing factors involved in the regulation of RAC1B splicing in CRC, so the first goal of this thesis work was to determine the effect of other selected proteins on the expression of RAC1B in colorectal cell lines. The proteins of interest are a nucleoporin, RANBP2, and four splicing factors, PTBP1, ESRP1, DIS3L2 and hnRNP U, which were previously described as upregulated in CRC or involved in the RAC1B splicing process in other cell lines. The effect of these proteins on RAC1B alternative splicing was assessed through their overexpression and depletion in two colorectal cell lines, NCM460 and HT29, and the analysis of RAC1 exon 3b inclusion was made at the transcript level by RT-PCR, and at the protein level through SDS-PAGE and Western blot. The obtained results provided strong evidence that, in fact, these proteins influence RAC1B expression, both at the transcript and protein level. Although the overexpression experiments performed in this work did not lead to many clear conclusions about the effect of the proteins of interest on the RAC1B expression, the siRNA assays were rather conclusive. Taking into account the results obtained through depletion experiments, RANBP2 seems to act as a RAC1B inhibitor in NCM460 cells, while PTBP1, ESRP1, DIS3L2 and hnRNP U are probably enhancers of that RAC1 isoform. In the HT29 cell line, RANBP2 and DIS3L2 were pointed as inhibitors of exon 3b inclusion, while PTBP1, ESRP1 and hnRNP U are most likely enhancers of that alternative splicing event. The second goal of this work was to identify PTBP1 and ESRP1 RNA-binding motifs in the RAC1 transcript sequence. Here, two predicted ESRP1 binding motifs in the RAC1 transcript were identified and mutated in a RAC1 minigene, in order to verify if any of these changes could avoid ESRP1 binding and consequently affect the splicing process. The presence of the mutations was confirmed through DNA sequencing, however, it was not possible in the remaining time to reclone the mutant fragments into the original minigene vector, to assure they did not have undesired mutations, allowing to proceed to the planned experiments. Future studies should be performed in order to confirm the obtained results, as not all of them resulted in statistically significant variations on RAC1B expression levels, and it is also imperative to clarify how the nucleoporin RANBP2 affects RAC1B expression and what binding sites are recognized by the studied splicing factors in the RAC1 pre-mRNA.
- Anemia das Células Falciformes - influência de fatores genéticos na gravidade da doença em idade pediátricaPublication . Germano, Isabel; Faustino, Paula; Pina Martins, FranciscoA anemia das células falciformes (SCA) é uma doença genética recessiva causada pela mutação c.20A> T no gene HBB. É caracterizada por eritrócitos falciformes, anemia hemolítica crónica e eventos vaso-oclusivos. Estas manifestações são muito heterogéneas devido a agentes modificadores ambientais e genéticos. O objetivo deste estudo foi investigar modificadores genéticos da SCA numa população pediátrica do continente africano, onde a doença é um grave problema de saúde pública. O estudo incidiu sobre 200 crianças angolanas, entre os 3 e 12 anos, com SCA. Foram estudadas treze regiões polimórficas em genes associados à adesão celular (VCAM1 e CD36), tónus vascular (NOS3) e hemoglobinização dos eritrócitos (HBA), através de PCR, RFLP, Gap-PCR e sequenciação de Sanger. Todas as crianças que participaram neste estudo beneficiaram de uma caracterização em termos clínicos, hematológicos e bioquímicos. Os resultados demonstraram uma elevada prevalência (67,5%) de α-talassemia (deleção 3,7 kb em HBA), que melhorou a saúde dos doentes, retardando o início da doença, diminuindo a anemia e o número de transfusões sanguíneas. Dois SNP em CD36 (rs1984112 e rs1413661) mostraram ter influência na gravidade da anemia. Os genótipos contendo o alelo C do rs1413661 revelaram ser fatores de risco para a anemia grave, pois foram associados a menores níveis de hemoglobina e mais hospitalizações e transfusões sanguíneas. Este é o primeiro estudo onde o rs1413661 é associado à patologia da SCA. O alelo C do rs1041163 de VCAM1 foi associado a menores níveis de LDH e, inversamente, o alelo C do rs2070744 em NOS3 foi associado a elevados níveis de LDH e a um maior número de hospitalizações, sendo um possível fator de risco para a hemólise. Este estudo contribuiu para aprofundar o conhecimento da fisiopatologia da SCA, confirmando o benefício da co-herança da α-talassémia e reforçando a importância da adesão celular na variabilidade da anemia hemolítica.
- Classification of microcytic anaemias using machine learning methodsPublication . Leitão, Beatriz; Vinga, Susana; Faustino, PaulaThe prevalence of anaemia in the world population is 24.8%. Proper discrimination between microcytic anaemias is essential to provide the right treatment and genetic counselling.A s the most reliable methods to diagnose thalassemias and IDA (iron deficiency anaemia), some of the most common microcytic anaemias are expensive and time-consuming, many indexes have been developed through the years. These indexes, however, have not been revealed to be 100% accurate. In this thesis, haematological data from a sample of the Portuguese population constituted by 390 individuals and their diagnosis was used to train and test different machine learning algorithms. The objective was to develop a binary classifier, specifically adapted to the Portuguese population, to dis criminate β-thalassemia carriers from IDA patients. Beyond that, a multi-class classifier capable of dis tinguishing between β-thalassemia carriers, α-thalassemia carriers, IDA patients, and healthy subjects was also developed. In order not to compromise the main objective, to obtain a quick and accessible diagnosis, the classifiers developed were only based on information obtained through a complete blood count test, one of the most common laboratory tests in medicine. Although it was not possible to surpass the performance with the binary classifiers created of the most reliable index for the Portuguese population, RDWI (red cell distribution width index), which presented a median accuracy of 95.4%, it was possible to match it with the random forest algorithm. This algorithm showed an excellent performance in the binary and in the multi-class classification, where it achieved promising results, revelling a median accuracy of 93.0%.