DGH - Dissertações de mestrado
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- Caracterização genotípica de doentes portugueses com patologias associadas ao complexo multienzimático lisossomal: sialidose e galactosialidosePublication . Coutinho, Maria Francisca; Alves, Sandra; Prata, Maria JoãoIntrodução: Na célula, a actividade funcional das enzimas lisossomais sialidase, beta-galactosidase e N-acetilaminogalacto-6-sulfatase, depende da sua associação com a catepsina A para formar o complexo multienzimático lisossomal. Mutações genéticas em qualquer um dos componentes deste complexo levam a uma deficiência funcional que pode estar na base do aparecimento de uma doença de sobrecarga lisossomal. Neste trabalho estudaram-se os defeitos moleculares causais das doenças sialidose (mutações no gene que codifica a sialidase, NEU1) e galactosialidose (mutações no gene que codifica a catepsina A, PPGB) na população portuguesa. Métodos: A amostra analisada incluiu sete doentes portugueses, três com sialidose e quatro com galactosialidose cujo diagnóstico clínico tinha sido bioquimicamente confirmado. Utilizando DNA genómico, extraído de fibroblastos dos doentes, efectuou-se o estudo molecular dos genes PPGB e NEU1. Em alguns doentes foi também efectuada uma análise ao cDNA. Em todos os doentes analisados os níveis de mRNA foram determinadas por qtRT-PCR a tempo real. O impacto das novas mutações missense foi avaliado ao nível da função e da estrutura tridimensional de cada uma das proteínas através de programas bioinformáticos apropriados (Polyphen, SIFT, PyMOL e Swiss-pdbViewer). Resultados: No gene NEU1, foram identificadas quatro novas mutações, três delas missense (p.P153L, p.D187N, p.Q235H) e uma nonsense (p.R341X). Nos três doentes com galactosialidose, foram detectados quatro alelos diferentes no gene PPGB: duas mutações missense, uma nova (p.G57V) e uma já descrita (p.V104M) e duas novas delecções (c.228-229delC e c.991-992delT). Os estudos de expressão dos genes PPGB e NEU1 por qRT-PCR mostraram a ocorrência de uma diminuição dos níveis de mRNA na presença de algumas mutações (mRNA PPGB: p.G57V e c.991-992delT; mRNA NEU1: p.Q235H). No que se refere às novas mutações, as previsões do potencial deletério apresentadas pelos softwares Polyphen e SIFT foram unânimes a indicar um carácter patogénico para cada uma delas. De igual modo, quando as consequências das mesmas alterações foram avaliadas através de estudos tridimensionais, obtiveram-se dados que vieram confirmar e reforçar as previsões dos meios bioinformáticos, sobre o seu carácter deletério. Essas previsões foram, então, confrontadas com o fenótipo clínico de todos os doentes a que tivemos acesso. Foi possível, mais uma vez confirmar todas as previsões, estabelecendo uma correlação genótipo-fenótipo bastante coesa, uma vez que, as mutações que se previam mais deletérias, foram detectadas nos doentes com as formas mais graves de cada uma das patologias. Conclusões: Neste estudo foram caracterizados três casos de sialidose e quatro casos de galactosialidose. Como resultado, identificaram-se oito mutações diferentes. Dessas mutações, 7 foram descritas pela primeira vez: P153L, D187N e Q235H no gene NEU1 e G57V, V104M, c.228-229delC e c.991.992delT no gene PPGB. Foram efectuados estudos tridimensionais para todas as novas mutações e os resultados obtidos vieram confirmar e reforçar as previsões que já haviam sido obtidas utilizando os softwares Polyphen e SIFT, sobre o potencial efeito de cada uma delas. Finalmente, as estratégias desenvolvidas para análise mutacional são importantes ferramentas que permitirão a detecção de portadores e o diagnóstico molecular pré-natal, levando a uma melhoria do aconselhamento genético, o que traz grandes benefícios para as famílias afectadas. Estes conhecimentos são ainda importantes para uma melhor compreensão da genética do complexo multienzimático lisossomal.
- Detecção e caracterização molecular de defeitos no ciclo da carnitinaPublication . Sousa, Carmen; Mendo, Sónia; Vilarinho, LauraO ciclo da carnitina é uma etapa fundamental da oxidação mitocondrial dos ácidos gordos de cadeia longa, porque catalisa o seu transporte até à matriz mitocondrial para serem oxidados. Este transporte requer quatro proteínas. O transportador de carnitina orgânico (OCTN2), a carnitina palmitoiltransferase 1 (CPT1), a carnitina acilcarnitina translocase (CACT) e a carnitina palmitoiltransferase 2 (CPT2). As alterações nos genes que codificam estas proteínas causam doenças da oxidação mitocondrial dos ácidos gordos, com uma apresentação clínica metabólica, miopática ou cardíaca, que estão associadas à morte súbita infantil. A espectrometria de massa em tandem veio possibilitar o rastreio destas patologias através da avaliação do perfil de acilcarnitinas. Este estudo baseia-se na sua detecção e caracterização molecular. Foram estudados 15 casos e 30 familiares; 11 casos do rastreio neonatal, 2 provenientes de centros estrangeiros e 2 casos com fenótipo clínico. Foram caracterizados molecularmente 13 casos, detectadas 14 mutações causais, cinco das quais não estavam descritas na literatura ou na base de dados HGMD e 8 variantes polimórficas descritas no NCBI. Foram encontradas 5 mutações missense, 4 mutações frameshift (pequenas delecções e inserções), 1 mutação nonsense, 2 delecções e 2 mutações splicing. Este estudo permitiu a confirmação de diagnóstico em nove casos com deficiência no transportador de carnitina, três casos com deficiência em carnitina palmitoiltransferase 2 e um caso com deficiência em carnitina palmitoiltransferase 1. Tornou disponível a caracterização molecular de doentes futuros com diagnóstico clínico, ou bioquímico, deste tipo de patologias.
- 3-Metilcrotonilglcinuria: identificação e caracterização molecularPublication . Fonseca, Helena Susana Rodrigues Almeida; Mendo, Sónia; Vilarinho, LauraO rastreio neonatal é um programa sistemático destinado a todos os recémnascidos, tendo como objectivo evitar a evolução da patologia rastreada através do diagnóstico pré-sintomático e da instituição precoce de terapia adequada. A 3-metilcrotonilglicinúria (MCG) é uma doença incluída no rastreio que até recentemente era considerada uma doença hereditária do metabolismo rara. Na MCG o catabolismo da leucina é bloqueado no quarto passo devido a deficiência da enzima 3-metilcrotonil-CoA carboxilase (3-MCC). A 3-MCC catalisa a conversão do 3-metilcrotonil-CoA a 3-metilglutaconil-CoA, uma reacção reversível dependente de ATP e utilizando o bicarbonato como fonte de grupos carboxílo. O diagnóstico bioquímico da deficiência em 3-MCC é caracterizado pelo aumento marcado dos ácidos 3-hidroxisovalérico (3-HIVA) e 3-metilcrotonilglicina (3-MCG) na urina e concentrações elevadas de 3- hidroxisovalerilcarnitina (C5-OH) no sangue. A caracterização molecular reside no estudo dos genes MCCA e MCCB que codificam a enzima 3-MCC. O objectivo deste trabalho foi estabelecer um diagnóstico etiológico em doentes com MCG detectados pelo Programa Nacional de Diagnóstico Precoce e que possuíam um valor de C5-OH, marcador bioquímico primário de rastreio para esta patologia, superiores ao cut-off estabelecido. Numa amostra de 20 doentes pretende-se identificar e caracterizar as mutações mais frequentes na nossa população recorrendo a análise de 19 exões no gene MCCA e 17 exões no gene MCCB. Destes casos seleccionados para estudo, foram detectadas 26 mutações das quais 16 não se encontram ainda descritas na literatura nem na base de dados Human Gene Mutation Database, o que corresponde a uma percentagem de novas mutações de 61.5%. Os resultados obtidos permitiram concluir que o génotipo não consegue predizer o fenótipo ou o risco metabólico destes casos, mas permite confirmar o diagnóstico nos casos duvidosos. A deficiência em 3-MCC ainda não é uma patologia completamente conhecida e a sua apresentação clínica é bastante heterogénea, sendo a maioria dos doentes portadores de mutações próprias não sendo visível uma correlação genótipo – fenótipo. A continuação deste estudo é necessária para encontrar marcadores genéticos e/ou bioquímicos que expliquem a razão pela qual um número relativamente reduzido de indivíduos apresenta risco de desenvolver um fenótipo severo da doença. Verificou-se também que o estudo molecular é importante no diagnóstico de portadores sintomáticos ou assintomáticos (diagnóstico preditivo), no diagnóstico pré-natal, aconselhamento genético e com indicação para suplementação com biotina para os pacientes que tem a mutação que responde à biotina.
- Estudo molecular de Epilepsia Mioclónica Progressiva de Unverritch -LundborgPublication . Pinto, Eugénia; Amaral, Olga; Santos, ManuelThe Progressive Myoclonus Epilepsies (PME) are associated to an heterogeneous group of rare metabolic diseases. They are clinically marked by myoclonic, tonic-clonic episodes and progressive neurological decline, with ataxia and dementia. One of the major causes of PME is the Unverricht- Lundborg disease (EPM1, MIM 254800), an autosomal recessive disorder, caused by loss of function mutations in the cystatin B gene (CSTB). The onset of the symptoms is around the age of 10 yr. and is marked by convulsions. The EPM1 diagnostic is done through a differential diagnostic, first at a clinical level, and being confirmed at a genetic level. The main objective of this work is the implementation of the genetic study and applied research in EPM1. Since EPM1 is a rare disease without laboratory diagnostic in Portugal its real impact at the level of public health is unknown, the methods developed in this thesis will give the possibility of confirming/excluding clinical suspicion of EPM1, and allow the characterization of the patients. The results obtained have permitted the initiation of the study of CSTB, in instances where there was a suspicion of EPM1. It became possible to confirm a case of a patient suspect of having the EPM1, as well as making the evaluation of some polymorphisms present in our population. The new mutation, found and characterized in this work, is a point mutation, apparently silent (p.Q22Q), which alters the normal splicing pattern resulting in partial retention of the intronic sequence and subsequently leading to loss of function. These results show the need for making a non directional approach, doing a comprehensive study of the CSTB gene and complementing the gDNA study with the cDNA one. The study of this disease at the molecular biology level, may contribute to the evaluation and characterization of this pathology as far as its mutations and, at same time, it may contribute for a better understanding of its pathophysiology.
- Characterization of cytotoxicity and genotoxicity of sediments from a potentially contaminated estuaryPublication . Pinto, Miguel; Dias, Deodália Maria Antunes; Silva, Maria JoãoThe Sado Estuary (W Portugal) is affected by various sources of pollution, associated with the existence of an urban center, heavy-industry, mining activities and agriculture. It also remains a privileged site for fishing activities that are responsible for the supplying of consumable resources either locally or externally. Previous studies revealed sizable amounts of contaminants in the estuary sediments, namely metals, pesticides and polycyclic aromatic hydrocarbons. These compounds can be absorbed and accumulated in the edible parts of estuarine species and in local agricultural products, thus entering the human food chain and posing a public health problem. This study aims to assess the cytotoxic and genotoxic effects of sediments from the Sado Estuary in a human cell line, in order to contribute to hazard identification. Sediments were collected in 4 distinct fishing sites (P, E, A, C) of the Sado Estuary; a reference (Mf) and a potentially contaminated sample (M) from a different estuary (Mira Estuary, W Portugal) were also included. Total organic and inorganic contaminants were extracted with a mixture of methanol:dicholomethane and recovered in DMSO. HepG2 cells were exposed for 48h to several concentrations of each extract. Cytotoxicity was measured by the neutral red assay and genotoxicity by the comet assay. A dose-related decrease in cell viability was observed for extracts P, E and M, indicating sediment contaminant-driven cytotoxicity, whereas no significant cytotoxicity was observed for extracts A, C and Mf. A significant increase in the level of DNA damage was observed following cells exposure to extracts P, E, A and M. Also, increased genotoxicity was observed following treatment with the endonuclease FPG, suggesting the induction of oxidative DNA damage. No significant genotoxicity was induced by extracts C and Mf. The differential cytotoxicity and genotoxicity observed in samples from the northern and southern areas of the Sado Estuary probably reflects the pollution from heavy-industrial and urban area vs. intense agricultural area, respectively. Thus, the data suggest the existence of an inherent environmental, ecological and human health, risk associated with the Sado Estuary sediment contamination that must be further assessed.
- Factores genéticos moduladores do fenótipo da drepanocitosePublication . Ferreira, Emanuel; Faustino, Paula; Dias, DeodáliaA hemoglobina é uma proteína essencial, constituinte maioritário dos eritrócitos, cuja principal função é o transporte de oxigénio no organismo. Esta é constituída por quatro cadeias globínicas, cada uma ligada a um grupo heme, que contém um ião Fe2+ ao qual se liga uma molécula de O2. As patologias associadas à hemoglobina (Hb) têm o nome genérico de hemoglobinopatias. Estas poderão ser do tipo quantitativo (as talassémias) ou qualitativo (as variantes da hemoglobina). De entre estas últimas salienta-se a mais comum, denominada Drepanocitose ou Anemia das células falciformes. A Drepanocitose é uma doença autossómica recessiva, que se caracteriza pela presença em homozigotia de uma mutação de A > T no codão 6 de gene da beta-globina (HBB). Os doentes drepanocíticos são incapazes de sintetizar a hemoglobina predominante no adulto normal, a HbA. Pelo contrário, é sintetizada uma variante de hemoglobina, a HbS, que tem propriedades de falciformização no eritrócito e origina, consequentemente, eventos de vaso-oclusão e anemia hemolítica crónica. Embora a Drepanocitose seja uma doença monogénica, os seus fenótipos (hematológico e clínico) têm gravidade variável pois são modificados por vários factores ambientais e genéticos. Este trabalho tinha como objectivos caracterizar uma população de 108 indivíduos para a presença da mutação drepanocítica, da deleção α-talassémica de 3,7 kb, quanto ao haplótipo no agrupamento génico β-globina e para uma série de polimorfismos em BCL11A e HBS1L-MYB. Seguidamente, pretendeu-se verificar se os genótipos caracterizados nestes loci seriam moduladores do nível de Hb Fetal (HbF; um parâmetro já aceite como sendo benéfico nesta patologia) e/ou do curso clínico da doença (medido através do número de crises de dor aguda que levaram a internamento dos doentes devidas, na sua maioria, à vaso-oclusão). Verificou-se que a população drepanocítica analisada apresenta 29% de frequência alélica para a deleção α-talassémia de 3,7 kb. Observou-se que os indivíduos drepanocíticos que co-herdaram α-talassémia apresentam microcitose, hipocromia e níveis baixos de Hb total. Não foi encontrada associação entre presença da deleção de 3,7kb e o nível de HbF. No entanto, relativamente à relação entre a presença desta deleção e a gravidade da doença, observaram-se melhorias significativas nos heterozigóticos. Observou-se que os heterozigóticos para esta deleção tinham 29% menos risco de terem crises com internamento do que os homozigóticos e os que não co-herdaram α-talassémia apresentam apenas menos 12% de risco. Concluimos, portanto, que a co-herança da delecção α-talassémica de 3,7 kb confere um efeito benéfico quando em heterozigotia e um efeito nefasto quando em homozigotia. Concluiu-se que a maior parte dos indivíduos apresentava o haplótipo Bantu no agrupamento génico da β-globina, seguido do Benim. Embora não se tendo observado associação entre o haplótipo e o nível de HbF, observou-se que, tendencialmente, a homozigotia para o haplótipo Bantu corresponde a níveis mais baixos de HbF e a homozigotia para o haplótipo Senegal encontra-se, tendencialmente, associado a níveis elevados de HbF. Não se verificou associação entre os polimorfismos globínicos, estudados na região promotora do gene Gγ-globina (rs112215533, rs112075505 e rs112479156) e o nível de HbF. No que diz respeito aos polimorfismos em BCL11A (rs11886868, rs4671393, rs10189857 e rs45506594) verificaram-se associações estatisticamente significativas entre a presença dos alelos menos frequentes para os dois primeiros polimorfismos e o nível de HbF (respectivamente, p = 0,001 e p < 0,001). Observaram-se também melhorias do curso clínico da doença aquando da presença destes alelos. Relativamente ao SNP rs11886868, concluiu-se que os indivíduos heterozigóticos para o alelo mais raro (TC) tinham 36% menos risco de terem crises com internamento que os TT, enquanto que nos homozigóticos para esse alelo (CC) a melhoria ascendia a 62% menos de risco que os TT. Relativamente ao polimorfismo rs4671393 pôde constatar-se que a presença do alelo menos frequente em heterozigotia (AG) conferia a esses doentes 38% menos risco de terem crises com internamento que os GG, e que esse valor era de menos 60% para os AA, também relativamente aos GG. No que se refere ao outro polimorfismo não globínico estudado, SNP rs9402686 em HBS1L-MYB, não se verificou associação com o nível de HbF. Em conclusão, com este estudo conseguiram-se identificar dois polimorfismos (em BCL11A, SNP rs11886868 e rs4671393) associados a níveis de HbF mais elevados e a um curso clínico mais suave da drepanocitose, podendo assim ser utilizados como preditores precoces da gravidade da doença e para adequar a terapêutica às necessidades de cada doente.
- Envolvimento da ribonuclease humana Dis3L1 em processos de controlo de qualidade da expressão génicaPublication . Cruz, David; Loison, Luísa Romão; Dias, Deodália Maria Antunes[PT] A expressão génica nos eucariotas envolve um número de etapas interligadas desde a transcrição do material genético até à tradução em proteína, sendo os RNAs mensageiros (mRNAs) os intermediários chave ao longo deste processo. Embora a complexidade da expressão génica dos eucariotas permita um controlo da produção proteica a vários níveis, também torna este processo vulnerável a erros. As células eucariotas desenvolveram mecanismos elaborados de controlo de qualidade do mRNA que asseguram a fidelidade da expressão génica através da detecção e degradação de transcritos anómalos. Como exemplo destes mecanismos de controlo de qualidade temos: o NMD (Nonsense-mediated mRNA Decay), que reconhece e elimina mRNAs que contenham codões prematuros de terminação da tradução, e o NSD (Nonstop mRNA Decay) que elimina mRNAs que não possuem codões de terminação em fase na grelha de leitura. O exossoma é um complexo proteico evolutivamente conservado que possui actividade ribonucleolítica e que se encontra presente tanto no núcleo como no citoplasma das células eucariotas. Uma das várias funções do exossoma é participar na degradação de mRNAs anómalos portadores de mutações nonsense ou de mutações nonstop. Como consequência da recente identificação de uma nova ribonuclease, a hDis3L1, como parte integrante do exossoma, este trabalho teve como objectivo avaliar o envolvimento desta subunidade do exossoma humano na degradação inerente ao NMD e ao NSD. Para tal, usaram-se variantes do gene da β-globina humana: um gene portador de mutação nonsense e sensível ao mecanismo de NMD (β39, com uma mutação nonsense no codão 39), um gene sem qualquer codão de terminação em fase (βnonstop) e o correspondente gene normal (βn), como genes modelo. Estes genes clonados em vectores de expressão foram usados para transfectar transitoriamente células HeLa em cultura. Simultaneamente, foram realizados testes de RNA interference (RNAi) através da transfecção de small interference RNAs (siRNAs) específicos para o transcrito que codifica hDis3L1 e, como controlo, siRNAs para um transcrito não específico (luciferase). Nestas condições de inibição da expressão da hDis3L1 ou em condições normais, as células em cultura foram colhidas para extracção do RNA total. O nível de mRNA das globinas foi quantificado por RT-qPCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction), enquanto que o nível de inibição da expressão de cada transcrito sujeito a RNAi foi avaliado por RT-PCR (semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction). Em condições de baixa expressão de hDis3L1 na célula, pretendeu-se verificar se os transcritos β39 e βnonstop aumentam de expressão, o que indicaria que o mecanismo de NMD e/ou o mecanismo de NSD ficariam inibidos, sugerindo que a ribonuclease hDis3L1 estaria envolvida no processo de degradação de transcritos com mutações nonsense ou non-stop, respectivamente. De facto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que a hDis3L1 participa no mecanismo de NMD, uma vez que se verificou um aumento dos níveis de transcritos nonsense aquando da inibição da hDis3L1. Por outro lado, sugerem também que a hDis3L1 não participa no mecanismo de NSD, uma vez que não se verificaram alterações nos níveis dos transcritos nonstop em condições de inibição desta subunidade do exossoma. Estes resultados contribuem assim para melhor compreender estes processos de degradação envolvidos no controlo de qualidade da expressão génica e podem contribuir para um possível desenvolvimento de ferramentas específicas para a manipulação do processo de NMD, o qual pode levar ao estabelecimento de terapias específicas direccionadas a patologias, como cancro e muitas doenças genéticas, associadas a este tipo de mutações nonsense.
- Molecular Assessment of X-Linked Intellectual Disability: A Gene Cluster Based ApproachPublication . Oliveira, Bárbara; Jorge, Paula; Criado, Maria BegoñaIntellectual disability (ID) is a common form of cognitive impairment, responsible by a significant number of limitations in intellectual function and adaptive behavior. X-linked intellectual disability represents a common cause of monogenic mental retardation affecting mostly males. Among the genetic causes involved, mutations in FMR1, AFF2 and ARX genes emerge as the major causes. FMR1 and AFF2 genes contain polymorphic repetitive regions susceptible to suffer dynamic mutations, a process that may give rise to pathogenic expansions. In ARX gene, the second exon represents a mutational hot spot as holds repetitive regions that codify to alanines. Among the mutations described, variations in polyalanine tracts, namely the c.429_452dup24, are among the most frequent. Aiming the characterization of a population at risk for ID, a multiplex molecular screening was performed regarding mutational hotspots in FMR1, AFF2 and ARX genes in intellectually-disabled individuals and in a control population. A Triplet-primed PCR technique was optimized to evaluate [AGG] interspersion pattern in FMR1 repetitive regions to assess allele stability. Furthermore, ARX exon 2 size variations were characterized by sequencing analysis. Allelic frequencies of FMR1 and AFF2 genes in the Portuguese population are similar to other Caucasian populations. The present work shows that the increase of triplet content in FMR1 gene is independent of variations in AFF2 triplet content (Pearson’s R: ρ >0,05), although, the occurrence of 30 repeat-sized alleles (for FMR1) and 14 repeat-sized alleles (for AFF2) is the most frequent combination (13,4%) (X2: ρ<0,05). FMR1 alleles with the first interruption after nine or ten [CGG] triplets demonstrated to have different origins (X2: ρ <0,05; Pearson’s R: ρ <0,05). A strong correlation among the 29 repeat-sized alleles and the CTC SNP haplotype and between the 30 repeat-sized alleles and the TTT lineage (X2: ρ <0,05) was observed. In ARX analysis the c.429_452dup24 mutation was identified in three individuals from two different families and the polymorphic variant c.441_464del24 in other three patients. Small insertions codifying for alanines were also detected (c.304GCG[11] and c.304GCG[13]) with a pathogenic effect yet to be determined. The importance of studying FMR1 alleles in terms of [AGG] interruption and genetic background is evident for an accurate clinical diagnosis. ARX mutations of known pathogenicity, although few frequent, are a strong indication that this genes should be included in routine screening of ID.
- Efeito do oncogene BRAF e da GTPase Rac1b sobre a expressão de genes envolvidos no estado de senescência de células do cólon humanoPublication . Henriques, Andreia; Gomes, Rui; Jordan, PeterO cancro colo-rectal é uma das principais causas de morte no mundo ocidental. Trata-se de uma doença heterogénea com diferentes vias de desenvolvimento, uma das quais é a Via Serreada caracterizada pela ocorrência de mutações no gene BRAF nomeadamente a mutação BRAF V600E. No entanto ensaios feitos com a mutação BRAF V600E mostraram que esta não é suficiente para induzir a transformação maligna e provoca em vários tipos celulares Oncogene Induced Senescence – OIS. O facto de ter sido encontrada sobre expressão de Rac1b em amostras de tumores e ter sido demonstrada uma cooperação entre BRaf-V600E e Rac1b para a sobrevivência celular em células HT29 sugeriu esta GTPase como interveniente na transformação maligna quando a mutação BRAF V600E está presente. Estudos preliminares sugeriram então a hipótese de haver comunicação celular por via de citocinas, nomeadamente, PDGF-BB e IL-8 entre a célula tumoral e células do estroma durante o processo de progressão tumoral envolvendo a expressão do receptor CXCR4. Foi então criado um novo modelo celular de células normais de cólon, NCM460, transformadas com o sistema indutível (ProteoTuner – Clontech) para estudar os efeitos da expressão de Rac1b e BRaf-V600E. Os níveis de expressão dos inibidores de proliferação p14ARF e p15INK4b aumentaram nas células NCM460 transfectadas com pPTuner BRaf-V600E indicando indução de OIS. Já a expressão de Rac1b apresenta efeito antagónico, inibindo a expressão de marcadores de senescência e ainda um aumento da expressão de IL-8. Sendo o IL-8 um estímulo para a produção de SDF1 pelo estroma o efeito da activação do receptor de SDF1, o CXCR4, na expressão de Rac1b foi mimetizado pela sua sobre-expressão nas NCM460. Os resultados sugerem que CXCR4 provoca um aumento da expressão de Rac1b para níveis semelhantes aos encontrados em células tumorais. Os resultados deste trabalho sustentam o modelo de OIS induzido pela mutação BRaf-V600E numa célula de cólon normal e que Rac1b tem um efeito contrário. Posteriormente, por um processo que ainda é necessário definir ocorre na célula aumento da expressão de Rac1b criando um ciclo de retro alimentação entre a célula tumoral e as células envolventes do estroma pelo eixo IL-8- SDF-1- CXCR4 que sustenta a expressão de Rac1b e conduz a progressão tumoral.
- Nova abordagem no estudo da Distrofia Muscular das Cinturas tipo 2APublication . Maia, Nuno; Oliveira, Márcia E.; Almeida, AdelaideMuscular dystrophies comprise a group of heterogeneous genetic diseases characterized by progressive muscle weakness. Until now, eighteen genes have been associated to a specific subgroup of muscular dystrophies called limb-girdle muscular dystrophies (LGMD). Mutations in the CAPN3 gene are responsible for calpainopathy or limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A), one of the most frequent form of LGMD. The gene CAPN3 codes for calpain 3 (or CAPN3), a muscle-specific calcium-dependent cysteine protease functionally regulated via its autolytic activity. The pathogenesis mechanism of LGMD2A still continues to be unresolved, however functional defects of CAPN3 seem to be the major cause of the pathology. With the present work, it is proposed a new approach for the LGMD2A diagnostic analysis, combining molecular genetics and protein analysis methodologies in order to contribute to a differential diagnostic essential for global characterization of patients, specifically among patients with non-specific muscular dystrophy symptoms. Muscle biopsy samples of 9 LGMD2A patients, already studied at the molecular genetics level, were subjected to protein analysis and functional tests by western blotting and densitometry analyses. Additionally, gene expression studies were performed using real-time quantitative PCR. A global analysis of the data obtained allowed us: (a) to complement the previous molecular genetics study in patients 2-7, including the identification of a CAPN3 functional defect in patient 3; (b) to confirm the clinical diagnostic in patient 8 (with only one mutation in heterozygous state) also caused by a protein functional defect; and (c) to exclude the CAPN3 implication in the other two patients which presented one mutated allele in heterozygous state, because of the detection of an overexpression of the CAPN3 gene in comparison to control samples.