INSA - Dissertações de mestrado
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- Assessing the pro inflammatory effects of bisphenol compounds using exposure relevant in vitro co culture modelsPublication . Pereira, Gonçalo Alexandre Candeia; Jordan, Peter; Rodrigues, CecíliaInflammation has reached epidemic proportions in industrialized countries, mainly due to unhealthy habits, poor diet, environmental pollution and other factors not yet understood. If uncontrolled or prolonged, inflammation can become chronic and contribute to the development of a number of human diseases, including autoimmune diseases, intestinal diseases and, in the worst cases, tumorigenesis and tumor progression. Exposure to endocrine disrupting chemicals (EDCs) is one environmental factor contributing to inflammation, and recent studies have brought the bisphenol (BP) group of EDCs into the scientific spotlight. They have been strongly linked to various pathologies, including chronic inflammation, and their effect on human gut health is a hot topic in the scientific community. With this in mind, the aim of this work was proposed to analyze the effects of four bisphenols, BPA, BPS-MAE, BPAP and BPP, on intestinal barrier stress and associated pro-inflammatory effects. To achieve this, a co-culture system was optimized and established, consisting of an improved protocol of polarized Caco-2 epithelial cells seeded on PET insert filters in an apical compartment, together with THP-1 derived macrophages in a basolateral compartment. Subsequently, the effects of BPs exposure on barrier integrity, cellular stress and pro-inflammatory cytokine were tested in a wide range of concentrations (from 100 μM to 0.1 μM). Experimentally, we found that the model was capable of delivering BP-specific data on potential health effects. In terms of transepithelial resistance and epithelial stress, we were able to identify some clear trends that need to be consolidated with more independent experimental replicates. In particular, BPA was the least potent inducer of cellular stress responses and changes in epithelial polarization, whereas the BP analogues tested proved to be more disruptive than BPA, with BPP appearing to be the most potentially hazardous, followed by BPAP and then BPS-MAE. To access the inflammation-modulating effects of these compounds, we tested macrophages, either directly or as co-cultured cells, for expression of the pro-inflammatory marker IL-1β using a semiquantitative RT-PCR approach. An important optimization was their priming with IFN-γ to increase the sensitivity of the model and allow for more physiological relevance. Our observations showed that, once again, the BP analogues induced greater effects compared to BPA. BPP appeared to be the more potent inducer of inflammation, followed by BPS-MAE. Both showed elevated levels of the IL-1β marker at all concentrations tested. BPAP and BPA produced more attenuated effects, although significant at higher concentrations. In conclusion, this work has provided us with landmark results on these BPA analogues and their effects on gut health, adding new insights into the 'new generation' of emerging BPs and their potential adverse health effects.
- Assessment of genotoxicity biomarkers in the scope of a human biomonitoring study in workers from E-waste management industriesPublication . Lopes Rosário, Rita Isabel; Silva, Maria João; Pina Martins, FranciscoElectrical and electronic waste (e-waste) represents a pressing global challenge with its rapid growth and hazardous composition. This recycling sector often involves inadequate worker safety, exposing e-workers to harmful substances like heavy metals and flame retardants via several routes, causing significant short- and long-term health risks. Human Biomonitoring (HBM) is a useful tool in assessing exposure and associated health outcomes through biomarkers like micronucleus (MN) in blood or epithelial cells, enabling the identification of early biological changes and linking exposure to disease. This HBM study used two assays,- the Buccal Micronucleus Cytome (BMNCyt) assay and the Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome (CBMNCyt) assay,- to assess potential genotoxic effects from occupational e-waste exposure. The BMNCyt assay, conducted under the HBM4EU initiative, targets buccal mucosa epithelial cells, a primary barrier against hazardous agents, thus assessing local genotoxic effects. The CBMNCyt assay in peripheral blood lymphocytes, conducted under the PARC Project, reliably measures structural and numerical chromosomal changes, reflecting a systemic effect. This research aimed to assess early biological effects from exposure to pollutants from e-waste in in PBL and buccal epithelial cells of European e-waste workers, comparatively with control groups. The BMNCyt assay showed no significant differences in MN frequency between the exposed and control groups, while the CBMNCyt assay detected significantly increased frequencies of MN in exposed compared with non-exposed groups. Factors like small sample sizes, interindividual differences, and the use of protective equipment might have influenced results. Demographic/lifestyle variables showed differing impacts on MN formation between assays, but also potential influence, thus the importance of their consideration. Concluding, expanding e-waste occupational health research to include more workers/activities within the waste management industry and broader biomonitoring efforts is paramount. Boosting the understanding of health risks associated with those activities will help developing protective measures and mitigation strategies to safeguard the exposed workers’ health.
- Associação entre o Índice de Vulnerabilidade à Pobreza Energética e os Níveis de Tensão Arterial na População PortuguesaPublication . Rodrigues, Madalena; Gouveia, João Pedro; Sousa-Uva, MafaldaEm Portugal, estima-se que entre 1,8 e 3 milhões de pessoas vivam em situação de pobreza energética, estando entre 609 mil e 660 mil em condição severa. A exposição a temperaturas extremas dentro das habitações pode agravar problemas de saúde existentes e aumentar o risco de doenças cardiovasculares, como a hipertensão arterial, que afeta cerca de 36% da população portuguesa entre 25 e 74 anos. A pobreza energética resulta da combinação de baixos rendimentos, má eficiência energética das habitações e dificuldades no pagamento das faturas de energia. Este problema é intensificado pelas alterações climáticas, que elevam a frequência de eventos extremos. Apesar das preocupações expressas em políticas europeias, poucos estudos populacionais avaliaram a associação entre pobreza energética e saúde utilizando medidas objetivas. Este trabalho tem como objetivo estimar a associação entre o Índice de Vulnerabilidade à Pobreza Energética (IVPE) desenvolvido ao nível da freguesia (#3092) e os níveis de tensão arterial na população adulta portuguesa. Trata-se de um estudo epidemiológico, observacional, transversal e analítico, com dados do Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico 2015 (INSEF), abrangendo 4911 indivíduos de 25 a 74 anos. O IVPE foi categorizado em tercis (baixo, médio e alto) e as associações foram analisadas por regressão linear, ajustada para fatores sociodemográficos e económicos. Os resultados evidenciam que viver em áreas com elevada vulnerabilidade à pobreza energética está associado a um aumento significativo da tensão arterial. No contexto do arrefecimento, observou-se um acréscimo de 2,28% na Tensão Arterial Sistólica (TAS) e de 2,08% na Tensão Arterial Diastólica (TAD), enquanto para o aquecimento verificou-se um aumento significativo na TAS, mas sem relevância na TAD. Estes reforçam a pobreza energética como um fator de risco relevante para a saúde, sublinhando a necessidade de políticas públicas eficazes para mitigar os seus impactos. Num contexto de alterações climáticas e envelhecimento da população portuguesa, garantir condições habitacionais adequadas pode ser uma estratégia essencial para reduzir desigualdades sociais, promover a saúde e o bem-estar, bem como aliviar a pressão sobre os sistemas de saúde pública.
- Bioinformatics toolbox for comparative clustering evaluation of Whole-Genome Sequencing (WGS) pipelines for bacteria routine surveillancePublication . Pereira, Joana Vanessa Gomes; Mixão, Verónica de Pinho; Couto, Francisco José MoreiraWhole-Genome Sequencing (WGS) provides higher resolution than traditional typing to distinguish closely related isolates. As result, disease surveillance increasingly adopts WGS, with international agencies recommending its use in reference laboratories. However, the heterogeneity of workflows and unequal resources raise concerns about inter-laboratory result comparability and, consequently, data sharing and communication. To address these issues, this thesis project developed EvalTree, a Python-based command-line tool to compare clustering results from two typing solutions, including traditional and genome-scale approaches, assessing their congruence at all possible resolution levels. EvalTree accepts two input folders or clustering files, processes them, and produces multiple outputs, including an user-friendly HTML report. When a folder generated by ReporTree, a tool to identify genetic clusters at all possible distance thresholds, is provided as input, EvalTree enables not only the inter-pipeline clustering comparison, but also detection of stable clustering regions, cluster characterization using metadata, and assessment of outbreak signal overlap. EvalTree was validated and benchmarked using a large (2946 isolates) and diverse dataset of Salmonella enterica, showing it accurately reproduces a recently published large-scale evaluation of inter-pipeline congruence at the European level. Its running time was mainly affected by dataset diversity rather than size. To further demonstrate its applicability, EvalTree supported the implementation of the S. enterica genomic surveillance pipeline at the Portuguese National Institute of Health (INSA), by comparing its performance with that of the European Food Safety Authority (EFSA), revealing high cluster congruence and similar resolution power. In summary, EvalTree is a novel bioinformatics tool (available through conda installation) that offers a practical, flexible solution to evaluate cluster congruence between the pipelines of different laboratories, supporting inter-laboratory communication in a One Health framework. It also promotes the long-term sustainability of any pipeline by enabling informed decision-making throughout its life-cycle (e.g., evaluating software updates).
- Conhecer a epidemiologia da infeção por vírus da imunodeficiência humana tipo 2 (VIH-2) em indivíduos residentes em Portugal: o que mudou nas últimas décadas?Publication . Mendes, Inês Filipa Santos; Pádua, Elizabeth; Piedade, JoãoThe main objectives of this study were to analyse the epidemiological evolution of HIV-2 infection in Portugal using demographic, clinical and laboratory data corresponding to samples from HIV-2-infected parturients received at INSA, and to conduct the molecular characterisation of HIV-2 in a convenience sample, focusing on the phylogenetic classification of viruses and identification of resistance mutations. The analysis of the overall sample received at the laboratory between 2006 and 2023 was based on known demographic and clinical data. The molecular analysis of HIV-2 was performed on selected samples, subjected to DNA extraction, nested-PCR amplification of the PR-RT and IN regions of the pol gene and the amplified samples sequenced by the Sanger method. The results obtained were discovered with several bioinformatics programs, the respective phylogenetic trees were constructed and the search for resistance mutations was carried out with available international databases. An analysis of data from samples of the total population (n=183) revealed that 16.6% of the parturients infected with HIV-2 were Portuguese, but there was a clear predominance of women born in Africa (83.4%), mostly in Guinea-Bissau and in the age group of 30-39 years. Between 2006 and 2023, an apparent general improvement in the immunological situation was observed, with an increase in the proportion of women with CD4+ T cells above 500 cells/μL and an increase in the rate of adherence to ART during pregnancy (56.2% to 64.0%), which was higher among African women (69.6%) compared to Portuguese women (66.7%). Over time, a transition from ART regimens containing only NRTI to NRTI regimens combined with INSTI was achieved, and between 2018 and 2023, this regimen was prescribed to 56.5% of parturients. The analysis of the selected convenience sample (n=99) proved to be representative of the total samples received in the laboratory between 2011 and 2023, for the demographic and clinical variations analysed. Amplification was successful in 48.5% of the samples for PR-RT and 46.5% of the samples for IN, with all sequences phylogenetically in HIV-2 group A and excluded of cluster A2. It was observed that 12 sequences derived from samples of 12 women presented mutations of interest, namely, in 7 of 45 sequences of the RT group and in 5 of 35 sequences of the IN group. Three sequences from each group presented accessory mutations associated with a possible reduction in susceptibility to antiretrovirals (I75V, V111I and F214L in RT and I84V, A153S in IN). However, resistance mutations were identified in 4 RT sequences and 2 IN sequences (K70R, Q151M, M184V and S215Y in RT and R263K and N155H in IN). This study revealed the need for greater efforts to implement measures to increase adherence to ART, as well as screening for HIV-2 infection, to prevent transmission and improve clinical outcomes in patients. The results produced in this study may contribute to updating knowledge about the epidemiological and molecular characteristics of HIV-2 in Portugal, as well as evidence of the existence of resistance mutations with an impact on the treatment of the infection.
- Desenvolvimento de uma metodologia para sequenciação de regiões altamente polimórficas de HCMV para avaliação dos perfis mutacionais da população viralPublication . Carrasqueira, Patrícia Isabel Barreiros; Ferreira, Rita; Paixão, Paulo; Chasqueira, Maria de JesusO citomegalovírus humano (HCMV, do inglês human cytomegalovirus) possui um genoma de ~236 kb sendo o herpesvírus que causa infeções no Homem com maior diversidade genética conhecida. Apesar dos inúmeros esforços para associar os polimorfismos virais e a diversidade da população intra- paciente com o aumento da aptidão viral, com os resultados clínicos e com a latência, as correlações permanecem inconclusivas. Neste estudo, foi desenvolvido um ensaio de tilling PCR multiplex para a sequenciação simultânea de múltiplas regiões genómicas hipervariáveis do HCMV, com o objetivo de caracterizar o polimorfismo deste vírus. Para tirar partido do potencial da sequenciação direcionada de última geração (tNGS, do inglês targeted next-generation sequencing), foi concebida uma tilling PCR multiplex para amplificação de ~ 8% do genoma de HCMV em 7 regiões discretas abrangendo 14 loci polimórficos de interesse (UL33, UL55, UL73, UL74, UL75, UL100, UL115, UL128, UL130, UL131A, UL144, UL146, UL147 e UL147A). Esta abordagem teve por base o desenho de 145 primers diferentes que em conjunto originam 51 amplicões. A otimização de todo o workflow foi realizada tanto ao nível técnico como ao nível da análise bioinformática, com resultados muito promissores. A metodologia foi aplicada a um conjunto de 30 amostras clínicas, tendo-se verificado que cinco apresentavam resultados compatíveis com infeções mistas, sendo que nenhuma destas provinha de infeções congénitas. Da sequenciação das 7 regiões das restantes 25 amostras resultaram sequências consensus de elevada qualidade para a maior parte delas correspondendo a uma elevada taxa de sucesso de 92.6% (162/175). De notar que embora o sucesso da metodologia tenda a diminuir com menores cargas virais foi total mesmo para amostras clínicas com carga viral mais baixa (Ct>25). Verificou-se ainda que, tanto ao nível das sequências concatenadas como gene-a-gene, as amostras clínicas portuguesas não só apresentavam variabilidade genética idêntica à já identificada no conjunto global das sequências retiradas do NCBI (n = 344) como apresentavam diferentes níveis de diversidade entre si. Por fim, focando a análise de polimorfismo em pares de amostras de 3 hospedeiros diferentes verificou-se que estas não apresentavam quaisquer diferenças entre si. Em conclusão a metodologia desenvolvida abre perspetivas promissoras para investigações futuras, que permitam estudar a relação entre polimorfismos do HCMV, a sua aptidão viral e correlacioná-los com os desfechos clínicos.
- Development of Cellular and Animal Models for Mucopolysaccharidosis Type IIIPublication . Gonçalves, Francisca; Alves, Sandra; Coutinho, Maria FranciscaA mucopolissacaridose tipo III (MPS IIIA, B, C e D), ou Síndrome de Sanfilippo, é um subgrupo de doenças lisossomais de sobrecarga (DLS). São doenças raras, monogénicas e neurodegenerativas causadas por mutações nos genes que codificam as enzimas responsáveis pela degradação intralisossomal do sulfato de heparano (HS). Os doentes apresentam um fenótipo clínico grave, caracterizado por demência infantil de início precoce e por morte prematura. Embora tenham sido alcançados progressos significativos no seu conhecimento e algumas novas terapias tenham avançado até à fase de ensaios clínicos, ainda existem muitos aspetos dos mecanismos patofisiológicos inerentes a esta síndrome por desvendar, não estando atualmente disponível um tratamento eficaz. Modelos celulares e animais que reproduzam o fenótipo da doença, constituem recursos de grande valor, possibilitando estudos mais aprofundados e incisivos e, a identificação de novos alvos terapêuticos, além de uma triagem mais eficiente de novos fármacos. Neste trabalho procurámos responder a essa necessidade através de: (i) uma caracterização aprofundada de duas linhas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs, do inglês: induced pluripotent stem cells), obtidas por reprogramação de fibroblastos de doentes MPS IIIC e IIID, previamente desenvolvidas no nosso grupo; e (ii) do estabelecimento de duas novas linhas de células estaminais de dentes decíduos esfoliados (SHEDs, do inglês: stem cells from human exfoliated deciduous teeth) derivadas de doentes com MPS IIIB e IIIC. Paralelamente, desenvolvemos um novo modelo animal para MPS IIIB, através da geração de um mutante nulo funcional na geração F0 de peixe-zebra (Danio rerio) através da tecnologia de CRISPR-Cas9.
- Estudos Funcionais de Variantes no Gene APOB em Doentes com Diagnóstico Clínico de Hipercolesterolemia FamiliarPublication . Ramos, Diana Catarina Fernandes; Bourbon, Mafalda; Alves, Ana CatarinaA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma doença caracterizada por níveis elevados de colesterol LDL, que se acumulam nas artérias, promovendo o desenvolvimento precoce de eventos cardiovasculares. Geneticamente, a FH é transmitida de forma autossómica semi-dominante, sendo causada por variantes nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As variantes no gene APOB afetam a ligação do colesterol LDL ao seu recetor, representando 5 a 10% dos casos de FH. No entanto, para a maioria das variantes identificadas, o efeito funcional na proteína ainda não está determinado. Esta dissertação teve como objetivo principal investigar a correlação entre fenótipo e genótipo, além de caracterizar funcionalmente variantes identificadas no gene APOB em indivíduos com diagnóstico clínico de FH na população portuguesa. Como objetivo secundário, foi desenvolvida uma base de dados que reúne todas as variantes deste gene com estudos funcionais realizados até ao momento. A identificação das variantes foi realizada por sequenciação de nova geração (NGS) e confirmada por PCR e sequenciação de Sanger, seguida da pesquisa da variante nos familiares dos casos index. As variantes em estudo foram identificadas no âmbito do projeto EPHF. O LDL dos participantes foi isolado por ultracentrifugação a partir do soro de casos index e familiares com variantes no gene APOB, bem como de indivíduos normolipidémicos. Este LDL foi marcado com fluorescência e incubado em células CHO-ldlΔ7 para avaliar a capacidade de ligação e internalização do LDL. A caracterização funcional, realizada por citometria de fluxo com LDL fluorescente, revelou que as variantes p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu) e p.(Arg4519Thr) apresentavam ligação e internalização normais do LDL, indicando que estas variantes não comprometem a função da proteína. Este trabalho destaca a importância de caracterizar funcionalmente as variantes no gene APOB para melhorar o diagnóstico dos indivíduos com FH, possibilitando tratamentos mais adequados a cada caso e contribuindo para a redução do risco cardiovascular.
- Harmonização dos valores de anticorpos IgG contra a proteína Spike do vírus SARS-CoV-2Publication . Saraiva, Ana Leonor Fonseca; Afreixo, Vera; Gaio, VâniaO surgimento da COVID-19 conduziu ao rápido desenvolvimento de vacinas e testes de diagnóstico. Para avaliar a resposta de anticorpos IgG contra a proteína Spike do vírus SARS-CoV-2 (IgG anti-S SARS-CoV-2) em profissionais de saúde do meio hospitalar, foi realizado um estudo de coorte entre 2020 e 2022 em três centros hospitalares portugueses: Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO), Centro Hospitalar Tondela-Viseu (CHTV) e Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC). Os níveis de anticorpos foram medidos em seis momentos: antes da vacinação, após vacinação completa, aos 3, 6 e 12 meses após a segunda dose, e após a dose de reforço. Cada hospital utilizou um método analítico distinto: CMIA da Abbott, ECLIA Elecsys® da Roche e ADVIA Centaur® da Siemens, o que gerou desafios na comparabilidade dos dados. O presente estudo teve como objetivo harmonizar os anticorpos IgG anti-S SARS-CoV-2 entre os hospitais para permitir uma análise conjunta e uma melhor compreensão da dinâmica da imunidade nos profissionais de saúde em Portugal. Para assegurar uma conversão adequada dos títulos de anticorpos obtidos por métodos laboratoriais diferentes, foram aplicadas e comparadas várias estratégias de harmonização, nomeadamente a conversão internacional proposta pela Organização Mundial da Saúde (WHO) e a interpolação de quantis, seguida da aplicação de regressão de Deming. A interpolação de quantis seguida de regressão revelou-se mais eficaz do que a conversão recomendada pela OMS, ao preservar as características individuais de distribuição dos dados de cada hospital e ao permitir que os valores harmonizados refletissem a escala e a magnitude do método usado como referência (CMIA da Abbott). Após a harmonização, observou-se o padrão esperado de tendência temporal do título de anticorpos, com um aumento acentuado após a vacinação, seguido de um declínio ao longo dos meses e, por fim, um novo aumento mais pronunciado após a dose de reforço. Embora não tenha sido realizada uma validação laboratorial através da análise cruzada das amostras, uma limitação importante para a confirmação definitiva da abordagem, a metodologia demonstrou ser prática, reprodutível e com elevado potencial de aplicação em estudos multicêntricos e multinacionais que requerem a integração de dados serológicos obtidos por diferentes plataformas, nomeadamente no âmbito de colaborações europeias e internacionais. Após a harmonização, a análise estatística recorreu a modelos mistos para avaliar a evolução do título de anticorpos ao longo do tempo e a regressões lineares para analisar separadamente cada fase. Os modelos mistos evidenciaram aumentos significativos após a vacinação e o reforço, destacando diferenças entre os centros hospitalares. Nas análises por fase, além das variações entre os centros hospitalares no período pós-reforço, observou-se que indivíduos acima dos 50 anos apresentaram uma resposta imunitária superior. Estes resultados sugerem que tanto as características individuais como as diferenças institucionais influenciaram a resposta imunitária dos profissionais de saúde.
- Hazard characterisation of bisphenol A alternatives to improve risk assessment for human health: genotoxic and carcinogenic effects in mammalian cellsPublication . Pereira, Maria João Rodrigues; Silva, Maria João; Farinha, CarlosBisphenol A (BPA) is a compound used in the production of epoxy resins, polycarbonate plastics and as an additive (e.g. in thermal paper). It is present in several different products and has been detected both in the environment and in human matrices. BPA is a known endocrine disruptor, with several studies linking it to multiple harmful health effects. Therefore, there is an effort to phase out its use, but also to replace it with alternative substances. Various alternatives are already being used and have been detected in the environment and human matrices. Furthermore, some harmful health effects have also been reported for those substances (albeit not as many as BPA), justifying the need for more research on these alternatives. This thesis is part of the Partnership for the Assessment of Risks from Chemicals (PARC), that prioritized alternatives based on the lack of data on their effects on human health and due to human exposure to them occurring or being likely to occur. This thesis focused on BPS-MAE and BPAP, aiming to contribute to their hazard assessment, through the characterisation of their in vitro genotoxic and carcinogenic potential. The former was assessed for BPS-MAE and BPAP with the Cytokinesis-Block Micronucleus assay, in human peripheral blood lymphocytes. The results suggest that BPS-MAE and BPAP do not have a genotoxic effect at the concentrations and exposure times tested. Genotoxic and non-genotoxic carcinogenicity of BPAP and BPA was ascertained with the Cell Transformation assay, in Bhas 42 cells. BPA was tested to allow inter-laboratory comparison of results and assay optimisation. The results indicate that neither BPAP nor BPA have potential carcinogenic activity at the concentrations and treatment durations tested. The data obtained will help eliminating existing data gaps, aid to improve these alternatives’ risk assessment and contribute to the formulation of legislation, if necessary.
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