Browsing by Author "Pereira, Paulo"
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- 4º Congresso Ibérico de Cianotoxinas − Lisboa, 8-10 julho 2015Publication . Churro, Catarina; Pereira, Paulo
- Antibiotic resistance in freshwater cyanobacteria and associated bacteriaPublication . Dias, Elsa; Dias, Daniela; Ferreira, Eugénia; Manageiro, Vera; Vasconcelos, Vitor; Pereira, Paulo; Caniça, ManuelaObjectives: Cyanobacteria are ubiquitous prokaryotes in aquatic ecosystems and although they can be exposed to antibiotics, their role on water resistome was never investigated. Thus, this work aimed to evaluate the antibiotic susceptibility patterns and resistance mechanisms of cyanobacteria and co-occurring bacteria in order to assess their contribution to the global pool of resistance determinants in freshwater. Methods: We investigated 4 cyanobacterial genera (Microcystis, Aphanizomenon, Anabaena and Planktothrix), previously isolated from freshwater reservoirs, and several bacteria isolated from those cyanobacterial cultures. Antibiotic susceptibility of cyanobacteria was evaluated by microdilution method, under specific culturing conditions, against beta-lactams, aminoglycosides, quinolones, sulfonamides and tetracyclines. Minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined according to cyanobacterial cell dentisty (DO, 450nm) and microscopic examination of cultures integrity. Bacteria were identified by 16S sequencing and their susceptibility patterns were determined by disk diffusion, according to SFM 2012 non-specific breakpoints, against the same antibiotics. All strains were subjected to the search of class 1, 2 and 3 integrons and antibiotic resistance genes according to the phenotype. Results: Overall, we observed a great diversity of susceptibility to the tested antibiotics, among the distinct strains. Microcystis showed the lowest susceptibility regarding beta-lactams. Conversely, Microcystis was more susceptible to quinolones, while Planktothrix showed higher MIC values. Bacteria from cyanobacterial cultures were identified as Hydrogenophaga atypica, Limnobacter thioxidans, Rhizobium radiobacter, Sphingobium sp. and Brevundimonas lenta. Even though no known antibiotic resistance genes were yet identified, bacteria from different species and showing distinct phenotypes exhibited class 1 and 2 integrons. L. thioxidans, for example, revealed to be resistant to aminoglycosides and harbored a class 2 integron. Conclusions: Although no known antibiotic resistance genes were found in cyanobacteria and co-occurring bacteria, the presence of integrons and the susceptibility to antibiotics, suggest that they may play a role on freshwater resistome and eventually contribute to the dissemination of antibiotic resistance. These results may also be helpful to define guidelines and breakpoints to access cyanobacteria antibiotic susceptibility.
- Aplicabilidade da PCR em tempo real na amplificação de DNA cianobacteriano em amostras preservadas.Publication . Churro, Catarina; Pereira, Paulo; Valério, Elisabete; Vasconcelos, VitorO estudo e monitorização de florescências de cianobactérias envolve frequentemente o uso de amostras fixadas a fim de evitar a sua degradação. Com o aumento das técnicas moleculares disponiveis, a possibilidade de utilizar este recurso de DNA para explorar informação genética representa uma mais valia na investigação em cianobacterias e toxinas associadas. Neste trabalho, determinou-se a quantidade e qualidade do DNA cianobacteriano recuperado a partir de amostras ambientais e de culturas fixadas com (1) solução de Lugol, (2) formaldeído, (3) gluteraldeído e (4) solução de Transeau. A quantificação e capacidade de amplificação do DNA extraído foi avaliada por PCR em tempo real utilizando como fragmento alvo o gene rpoC1. A extração foi feita com fenol-cloróformio e a pureza do DNA foi determinada espectrofotometricamente pela razão DO260/DO280 e DO260/DO230. As amostras foram analisadas em 5 diluições seriadas de 1:10 para determinar o limite de detecção e a eficiência da reacção. A amplificação das várias diluições por PCR em tempo real foi comparada com a amplificação em PCR convencional. Nas amostras fixadas com solução de Lugol ou formaldeído, a quantidade de DNA obtido foi inferior à quantidade obtida na amostra controlo (sem fixação). Contudo obteve-se DNA de boa qualidade (DO260/DO280> 1,86 e DO260/DO230> 2,22). Na análise por PCR em tempo real o fragmento alvo foi amplificado exponencialmente, com réplicas consistentes e uma eficiência de 0,91 (r2=0,99; m=-3,55) para a solução de Lugol e eficiência de 1.02 (r2=0,98; m=-3,28) para o formaldeído. No entanto a quantificação do gene alvo nestas duas amostras foi significativamente inferior à do controlo o que indica que o gene alvo pode ser quantificado mas a sua concentração não pode ser extrapolada para concentração real da amostra não fixada. Todas as diluições das amostras referidas anteriormente foram amplificadas enquanto que por PCR convencional só se obteve produto nas três primeiras diluições, o que indica maior sensibilidade do PCR em tempo real para a amplificação de amostras fixadas. Para a fixação com a solução de Transeau e gluteraldeído obteve-se DNA de fraca qualidade (DO260/DO280 <1,6) o que influenciou a quantificação espectrofotométrica, assim como a análise do gene rpoC1 por PCR em tempo real, em que a amplificação não ocorreu correctamente e as réplicas foram inconsistentes.
- Applicability of the real-time PCR assay in the amplification of cyanobacterial DNA from preserved samplesPublication . Churro, Catarina; Valério, Elisabete; Pereira, Paulo; Vasconcelos, VitorThe study and monitoring of cyanobacterial blooms often involves the use of preserved samples to avoid cellular degradation. However, preserved samples may not be suitable for molecular biology studies because preservation methods can interfere with DNA quality/quantity. Real-time quantitative PCR analysis (qPCR) has been widely applied in molecular analysis and is considered a promising method for monitoring purposes. This study intended to evaluate the applicability of the real-time qPCR technique in samples that were subjected to different methods of preservation: (1) 15% Lugol’s iodine solution (2) 4% formaldehyde and (3) 25% glutaraldehyde. The ability to amplify and quantify DNA extracted from Planktothrix agardhii was assessed using the rpoC1 gene as the target fragment in both raw water samples and in vitro cultures. No reliable DNA amplification was obtained from glutaraldehyde-preserved samples. Successful amplification was obtained from Lugol’s and formaldehyde-preserved samples. In this case, however, the quantification that was achieved by real-time PCR cannot be used to infer cell numbers, because the Ct values that were obtained from the Lugol’s and formaldehydepreserved samples were significantly higher than the Ct values that were obtained from the unpreserved samples. Therefore real-time PCR can be used for the detection and identification of cyanobacteria in preserved samples but no reliable cell quantification can be performed using this method.
- Avaliação do efeito da microcistina-LR no crescimento, sistema antioxidante e indução de apoptose em Saccharomyces cerevisiaePublication . Valério, Elisabete; Vilares, Arminda; Campos, Alexandre; Pereira, Paulo; Vasconcelos, VitorNeste trabalho pretendeu-se usar a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo para compreender melhor os mecanismos de toxicidade induzidos pela microcistina-LR. Este é o organismo eucariótico mais simples e estudado que tem sido amplamente utilizado como modelo no estudo de mecanismos de toxicidade, devido à facilidade de acesso à informação sobre o seu genoma (totalmente sequenciado e anotado), proteoma e processos bioquímicos correspondentes.
- Avaliação do efeito da microcistina-LR no crescimento, sistema antioxidante e indução de apoptose em Saccharomyces cerevisiaePublication . Valério, Elisabete; Vilares, Arminda; Campos, Alexandre; Pereira, Paulo; Vasconcelos, VitorAs hepatotoxinas microcistinas são mundialmente frequentemente encontradas em corpos de água doce. Estas são conhecidas por causar hepatotoxicidade aguda em humanos / animais, promoção de tumores em animais e ao seu potencial carcinogénico. Em células de mamíferos, o mecanismo de toxicidade das microcistinas é atribuída a um processo que envolve várias vias, um deles relacionado com a inibição das fosfatases proteicas PP1 / PP2A e a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). No entanto, uma vez que ainda não estão completamente caracterizados os mecanismos moleculares de ação das microcistinas e os efeitos correspondentes, não é possível ainda fazer a identificação completa destes compostos tóxicos. Neste estudo foram avaliados os efeitos de várias concentrações de microcistina-LR no crescimento, níveis de ROS, resposta do sistema antioxidante e indução de apoptose da levedura Saccharomyces cerevisiae. Verificou-se que o crescimento microbiano não foi inibido na presença das várias concentrações de toxina. Contudo, após coloração das células com fluorocromos, verificou-se que a exposição das células à toxina induziu um aumento dos níveis intracelulares dos ROS. Este aumento provocou uma ativação do sistema antioxidante, especialmente na resposta da catalase. Além disso, observou-se uma inibição da SOD1, o que em conjunto com o tipo de ROS possivelmente presente, sugere que a espécie reativa de oxigénio maioritariamente induzida é peróxido de hidrogénio (H2O2). Observaram-se ainda sinais de apoptose após coloração das células com DAPI e após avaliação por citometria de fluxo, usando um kit de Anexina V-FITC. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que a levedura Saccharomyces cerevisiae VL3 apresenta alguns dos principais efeitos tóxicos induzidos pela microcistina-LR em eucariotas superiores. Esta levedura, comprovou assim ser um simples e bom modelo eucariótico para estudar em mais detalhe os mecanismos moleculares de toxicidade induzidos pela microcistina-LR.
- Cianobactérias e Saúde: um problema ou uma oportunidade?Publication . Dias, Elsa; Paulino, Sérgio; Pereira, PauloMuito se tem escrito e discutido sobre o impacto negativo das toxinas produzidas por cianobactérias na saúde humana. No entanto, muitas dúvidas persistem sobre os efeitos reais destes compostos nas populações. A comunidade científica depara-se com dificuldades na avaliação do risco de exposição humana a cianotoxinas, o que dificulta a regulamentação dos níveis de toxinas no ambiente, bem como a gestão do risco associado às ocorrências de cianobactérias tóxicas. Em países com Portugal e Espanha o risco de intoxicação aguda por cianotoxinas será provavelmente reduzido. Nestes países, os sistemas de tratamento de água e os programas de vigilância em águas de consumo e recreativas garantem que as populações não serão expostas a níveis elevados de toxinas. No entanto, desconhecemos quais os riscos de exposição humana prologada a baixas doses decorrente da utilização de reservatórios frequentemente contaminados com cianobactérias tóxicas, onde eventualmente persistem níveis residuais de cianotoxinas, inferiores ao limite legal e até ao limite de deteção analítico. O potencial cancerígeno de algumas cianotoxinas tem vindo a ser discutido. É amplamente aceite que as microcistinas induzem hepatotoxicidade aguda, que actuam pela inibição das fosfatases proteicas PP1 e PP2A e do stress oxidativo, que são promotores tumorais. São toxinas classificadas pela IARC como “possivelmente cancerigenicas para os humanos (classe 2B)”. No entanto, a evidência epidemiológica não é suficientemente sustentada, especula-se que as microcistinas sejam agentes genotóxicos e que, portanto, possam ser também iniciadores tumorais. Mas ainda não sabemos se as microcistinas são cancerígenas. Ultimamente tem sido dada maior atenção à cilindrospermopsina, descrita como genotóxica e cuja ocorrência em países não tropicais tem vindo a ser descrita, embora muito se desconheça sobre a sua toxicocinética e os seus efeitos no Homem, em particular os efeitos a longo termo. Outro exemplo é o do BMAA, conhecido há várias décadas e “re-descoberto” recentemente na Europa e na Península Ibérica, que ilustra bem o paradigma da incerteza toxicológica. Assumimos, portanto, que as cianotoxinas são prejudiciais à saúde humana, mas ainda não sabemos como avaliar e gerir os seus riscos. Por outro lado, a ligação das cianobactérias à saúde humana não se resume à toxicidade e efeitos nocivos. Nos últimos anos temos vindo a assistir a um crescente interesse na actividade antibiótica, antiviral, anti-inflamatória e enzimática de bioprodutos cianobacterianos com potencial aplicação médica e biotecnológica, nomeadamente, na terapia de patologias tão diversas como o cancro, a dor crónica, a acalásia e a doença de Alzheimer, entre outras. Podemos, ainda, encontrar referências à aplicação de metabolitos cianobacterianos no combate a agentes infeciosos ou sobre o envolvimento das cianobactérias no fenómeno de disseminação de resistência a antibióticos no ambiente. Estas são novas áreas de intersecção cianobactérias-saúde, nas quais Portugal e Espanha começam já a dar o seu importante contributo.
- Coleção de culturas de algas Estela Sousa e SilvaPublication . Menezes, Carina; Churro, Catarina; Paulino, Sérgio; Sam-Bento, Filomena; Alverca, Elsa; Dias, Elsa; Pereira, PauloA coleção de culturas de algas Estela Sousa e Silva (ESSACC) foi criada em 1956 e reside atualmente no Laboratório de Biologia e Ecotoxicologia no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. A ESSACC foi implementada em resposta à necessidade de um repositório de material biológico para investigação na área do fitoplâncton. Este importante recurso biológico contém culturas monoclonais de algas eucarióticas e cianobactérias provenientes de águas costeiras e albufeiras portuguesas. Atualmente, a coleção mantém acima de 176 isolados vivos, dos quais 151 são cianobactérias de água doce e 25 são dinoflagelados marinhos. Adicionalmente são também mantidos alguns isolados pertencentes a outros grupos de fitoflagelados. Esta coleção permitiu até agora a identificação e caracterização de espécies assim como a produção e purificação de toxinas para aplicação em estudos toxicológicos entre outras diversas áreas de investigação. Deste modo, a ESSACC constitui uma ferramenta importante no fornecimento de culturas de algas a investigadores na área do fitoplâncton, particularmente no estudo de espécies nocivas.
- Contaminantes da água com potencial genotóxico: cianotoxinas e subprodutos de desinfeção da águaPublication . Dias, Elsa; Cardoso, Ana Sofia; Louro, Henriqueta; Santos, Telma; Rebola, Marlene; Pinto, Miguel; Santos, Sílvia; Antunes, Alexandra; Pereira, Paulo; Silva, Maria JoãoA garantia da qualidade da água destinada ao consumo humano é, atualmente, uma preocupação universal, em termos de saúde pública. Assim, a presença de contaminantes de natureza microbiológica ou química, pode constituir um perigo para a saúde humana que importa avaliar, particularmente no que diz respeito a efeitos carcinogénicos. O presente trabalho representa uma abordagem multidisciplinar, abrangendo a caracterização de efeitos citotóxicos, genotóxicos e potencialmente carcinogénicos de toxinas cianobacterianas (microcistinas) e de subprodutos de desinfeção da água (derivados clorados de benzo[a] pireno e fluoranteno). As microcistinas têm sido detetadas em reservatórios de água doce, sendo sobretudo conhecidas pela sua hepatotoxicidade aguda. O nosso trabalho tem vindo a demonstrar que, por um lado, estas toxinas possuem também atividade citotóxica e genotóxica e que, por outro, essa atividade pode ser extensiva a células de outros órgãos, para além do fígado. Estes resultados suportam a hipótese, ainda alvo de alguma controvérsia científica, de que as microcistinas são agentes genotóxicos e potencialmente carcinogénicos. Os derivados clorados de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) podem formar-se pela reação do cloro, usado na desinfeção da água, com resíduos de HAP presentes na água, sendo que os seus efeitos biológicos são praticamente desconhecidos. O nosso trabalho compreendeu a preparação de três derivados clorados a partir do benzo[a]pireno (BaP) e fluoranteno (Fluo), a saber: 6-Cl-BaP, 3-Cl-Fluo e 1,3-Cl2-Fluo, tendo-se confirmado a sua formação em condições semelhantes às utilizadas em Estações de Tratamento de Águas. Mostrámos ainda que o 6-Cl-BaP apresenta um efeito genotóxico superior ao do BaP, o que veio justificar o alargamento deste estudo a novos subprodutos de desinfeção da água. No seu conjunto, os dados de ambos os estudos contribuíram para gerar evidência científica relativamente ao potencial impacto de contaminantes da água na saúde humana, com importantes implicações para a avaliação de risco e implementação de medidas preventivas, com vista a uma maior segurança na utilização dos recursos hídricos nacionais.
- Cyanobacterial blooms in natural waters in southern Portugal: a water management perspectivePublication . Galvão, Helena M.; Reis, Margarida P.; Valério, Elisabete; Domingues, Rita B.; Costa, Cristina; Lourenço, Dulce; Condinho, Sílvia; Miguel, Rute; Barbosa, Ana; Gago, Conceição; Faria, Natália; Paulino, Sérgio; Pereira, PauloThis synthesis of 3 studies from 2 regions of southern Portugal (Alentejo and Algarve) was part of a workshop focusing on cyanobacteria held at the SAME 10. The first study monitored impacts of the large Alqueva dam on the Guadiana estuary since 1996, revealing changes in sediment load, nutrient regime and phytoplankton succession. Prior to dam construction, dense cyanobacterial blooms occurred in the upper estuary during summer and fall. After dam construction, chlorophyll concentration, phytoplankton diversity and abundances of cyanobacteria decreased, contrary to predictions. Mycrocystins remained at low levels in the seston and undetectable in water samples, except during summer 2003 when the particulate fraction contained 1 µg l–1, while chlorophyll concentrations and abundances of potentially toxic cyanobacteria remained low. Algarve reservoirs studied since 2001 revealed differences in phytoplankton dynamics. In the western mesotrophic reservoirs (Bravura and Funcho), 40 to 50% of surface samples contained cyanobacterial concentrations of ≥2000 cells ml–1, while over 80% of samples from the eastern oligotrophic reservoirs (Odeleite and Beliche) exceeded this value. Spring blooms were dominated by Oscillatoriales in Odeleite and Beliche and by Chroococcales in Bravura and Funcho. Bloom composition seemed to depend on water temperature and management strategies, while toxin concentrations reflected the increased biomass of toxic species. Finally, phytoplankton communities and microcystin production in 5 Alentejo freshwater reservoirs were studied from May to December 2005 and April to July 2006. Cyanobacterial blooms occurred, with varying intensities, not only during summer but also occasionally in winter. Microcystins were detected in 23% of the samples (n = 51), but without correlation with cyanobacterial biomass. Although Microcystis aeruginosa seemed to be the major producer of microcystins, other potentially toxic species were found. In summary, the varying pattern of cyanobacterial bloom occurrence and toxicity requires a systematic approach to monitoring programs for adequate risk assessment.