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- Aplicabilidade da PCR em tempo real na amplificação de DNA cianobacteriano em amostras preservadas.Publication . Churro, Catarina; Pereira, Paulo; Valério, Elisabete; Vasconcelos, VitorO estudo e monitorização de florescências de cianobactérias envolve frequentemente o uso de amostras fixadas a fim de evitar a sua degradação. Com o aumento das técnicas moleculares disponiveis, a possibilidade de utilizar este recurso de DNA para explorar informação genética representa uma mais valia na investigação em cianobacterias e toxinas associadas. Neste trabalho, determinou-se a quantidade e qualidade do DNA cianobacteriano recuperado a partir de amostras ambientais e de culturas fixadas com (1) solução de Lugol, (2) formaldeído, (3) gluteraldeído e (4) solução de Transeau. A quantificação e capacidade de amplificação do DNA extraído foi avaliada por PCR em tempo real utilizando como fragmento alvo o gene rpoC1. A extração foi feita com fenol-cloróformio e a pureza do DNA foi determinada espectrofotometricamente pela razão DO260/DO280 e DO260/DO230. As amostras foram analisadas em 5 diluições seriadas de 1:10 para determinar o limite de detecção e a eficiência da reacção. A amplificação das várias diluições por PCR em tempo real foi comparada com a amplificação em PCR convencional. Nas amostras fixadas com solução de Lugol ou formaldeído, a quantidade de DNA obtido foi inferior à quantidade obtida na amostra controlo (sem fixação). Contudo obteve-se DNA de boa qualidade (DO260/DO280> 1,86 e DO260/DO230> 2,22). Na análise por PCR em tempo real o fragmento alvo foi amplificado exponencialmente, com réplicas consistentes e uma eficiência de 0,91 (r2=0,99; m=-3,55) para a solução de Lugol e eficiência de 1.02 (r2=0,98; m=-3,28) para o formaldeído. No entanto a quantificação do gene alvo nestas duas amostras foi significativamente inferior à do controlo o que indica que o gene alvo pode ser quantificado mas a sua concentração não pode ser extrapolada para concentração real da amostra não fixada. Todas as diluições das amostras referidas anteriormente foram amplificadas enquanto que por PCR convencional só se obteve produto nas três primeiras diluições, o que indica maior sensibilidade do PCR em tempo real para a amplificação de amostras fixadas. Para a fixação com a solução de Transeau e gluteraldeído obteve-se DNA de fraca qualidade (DO260/DO280 <1,6) o que influenciou a quantificação espectrofotométrica, assim como a análise do gene rpoC1 por PCR em tempo real, em que a amplificação não ocorreu correctamente e as réplicas foram inconsistentes.
- Impacto das microcistinas no crescimento de bactérias aquáticasPublication . Miguéns, Diana; Valério, ElisabeteAs microcistinas (MC) são o tipo de hepatotoxinas mais abundantemente produzido pelas cianobactérias. Estudos revelaram que estas toxinas afectam diversos organismos multicelulares que habitam ecossistemas aquáticos, no entanto o seu impacto em bactérias, que co-existem com cianobactérias de água doce encontra-se ainda por esclarecer. O objectivo deste trabalho foi avaliar a impacto de três variantes da MC (-LR, -RR, -YR) no crescimento de bactérias isoladas de três albufeiras portuguesas, onde frequentemente se observam "blooms" de cianobacterias produtoras de MC. Para tal, procedeu-se à identificação molecular de cada colónia isolada, através da amplificação por PCR do gene 16S rRNA, posterior sequenciação e posicionamento filogenético. As curvas de crescimento bacteriano foram determinadas através da leitura da densidade óptica celular (DO600nm), realizada de 30 em 30 minutos, dos isolados cultivados em meio rico Nutrient Broth incubados a 20ºC com agitação. Foram assim representadas as curvas de crescimento dos isolados expostos a diferentes concentrações de cada uma das três variantes da microcistina. Verificou-se que as microcistinas podem inibir ou estimular o crescimento das bactérias testadas e que este efeito pode ser diferente de variante para variante no mesmo isolado, contudo algumas variantes não induziram nenhum efeito. 0 trabalho realizado permitiu alargar a conhecimento do impacto das MC em procariotas expostos a estes compostos e demonstrou-se que existem diferenças nos efeitos consoante a concentração e variante de MC utilizada, assim como da especie bacteriana em causa.