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- Actividade antibacteriana de extractos de Planktothrix agardhii contra Staphylococcus aureusPublication . Menezes, Carina; Dias, ElsaA resistência de bactérias patogénicas à antibioterapia é um dos principais problemas de saúde pública, face à crescente ineficácia dos antibióticos no tratamento de doenças infeciosas. Assim, a pesquisa de novos antibióticos é um importante desafio da investigação em saúde. O potencial farmacológico de cianobactérias tem sido avaliado e descrito, mas, no entanto, ainda não há nenhum composto cianobacteriano que tenha sido aprovado pelas autoridades do medicamento como agente antibacteriano. Neste trabalho avaliámos a atividade de extratos de 40 estirpes de Planktothrix agardhii contra duas bactérias patogénicas: Klebsiella pneumonia e Staphylococus aureus. Para cada espécie bacteriana alvo usou-se uma estirpe de referência (ATCC) e uma estirpe clínica, isolada a partir de amostras de pacientes e estudadas no Laboratório de Resistência aos Antibióticos e Infeções Associadas aos Cuidados de Saúde. As estirpes de P. agardhii foram isoladas de albufeiras portuguesas e têm sido mantidas na coleção “Estela Sousa e Silva Algae Culture Collection” do Laboratório de Biologia e Ecotoxicologia. A biomassa de P. agardhii (200mg) foi extraída com metanol (70%, 10mL/100mg) overnight e sujeita a ciclos de sonicação. O metanol dos extratos foi evaporado e os extratos aquosos resultantes foram purificados em cartuchos C18. A atividade dos extratos contra as bactérias K. pneumonia e S.aureus foi avaliada através do método da Difusão em Disco (EUCAST), usando discos impregnados com 2, 4, 6, 8 e 10 mg de cada extrato. De acordo com os resultados preliminares, nenhum dos extratos apresenta atividade contra K. pneumonia, mas o extrato de P. agardhii LMECYA 256 apresenta um ligeiro halo de inibição relativamente às estirpes de S. aureus, de uma forma aparentemente dependente da dose de extrato aplicada. O S. aureus é uma bacteria Gram-positiva, frequentemente associada a uma vasta gama de patologias, desde simples infeções na pele, até infeções graves como pneumonia e meningite. Assim, revela-se do maior interesse explorar as propriedades antibacterianas de cianobactérias, designadamente do género Planktothrix, contribuindo, desta forma, para um dos desafios atuais da ciência: a identificação de novos antibióticos de origem natural.
- Antibiotic resistance in freshwater cyanobacteria and associated bacteriaPublication . Dias, Elsa; Dias, Daniela; Ferreira, Eugénia; Manageiro, Vera; Vasconcelos, Vitor; Pereira, Paulo; Caniça, ManuelaObjectives: Cyanobacteria are ubiquitous prokaryotes in aquatic ecosystems and although they can be exposed to antibiotics, their role on water resistome was never investigated. Thus, this work aimed to evaluate the antibiotic susceptibility patterns and resistance mechanisms of cyanobacteria and co-occurring bacteria in order to assess their contribution to the global pool of resistance determinants in freshwater. Methods: We investigated 4 cyanobacterial genera (Microcystis, Aphanizomenon, Anabaena and Planktothrix), previously isolated from freshwater reservoirs, and several bacteria isolated from those cyanobacterial cultures. Antibiotic susceptibility of cyanobacteria was evaluated by microdilution method, under specific culturing conditions, against beta-lactams, aminoglycosides, quinolones, sulfonamides and tetracyclines. Minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined according to cyanobacterial cell dentisty (DO, 450nm) and microscopic examination of cultures integrity. Bacteria were identified by 16S sequencing and their susceptibility patterns were determined by disk diffusion, according to SFM 2012 non-specific breakpoints, against the same antibiotics. All strains were subjected to the search of class 1, 2 and 3 integrons and antibiotic resistance genes according to the phenotype. Results: Overall, we observed a great diversity of susceptibility to the tested antibiotics, among the distinct strains. Microcystis showed the lowest susceptibility regarding beta-lactams. Conversely, Microcystis was more susceptible to quinolones, while Planktothrix showed higher MIC values. Bacteria from cyanobacterial cultures were identified as Hydrogenophaga atypica, Limnobacter thioxidans, Rhizobium radiobacter, Sphingobium sp. and Brevundimonas lenta. Even though no known antibiotic resistance genes were yet identified, bacteria from different species and showing distinct phenotypes exhibited class 1 and 2 integrons. L. thioxidans, for example, revealed to be resistant to aminoglycosides and harbored a class 2 integron. Conclusions: Although no known antibiotic resistance genes were found in cyanobacteria and co-occurring bacteria, the presence of integrons and the susceptibility to antibiotics, suggest that they may play a role on freshwater resistome and eventually contribute to the dissemination of antibiotic resistance. These results may also be helpful to define guidelines and breakpoints to access cyanobacteria antibiotic susceptibility.
- Antioxidant and Cytoprotective Properties of Cyanobacteria: Potential for Biotechnological ApplicationsPublication . Guerreiro, Adriana; Andrade, Mariana; Menezes, Carina; Vilarinho, Fernanda; Dias, ElsaAntioxidant compounds from cyanobacteria may constitute a natural alternative to current synthetic antioxidants, which contain preservatives and suspected toxicity. In this work, we evaluate the antioxidant potential of cyanobacterial strains of distinct species/genus isolated from freshwater (n = 6), soil (n = 1) and wastewater (n = 1) environments. Lyophilized biomass obtained from in-vitro cultures of those strains was extracted with ethanol and methanol. The antioxidant potential was evaluated by chemical (DPPH scavenging method, β-carotene bleaching assay, determination of total phenolic and total flavonoid compounds) and biological (H2O2-exposed HEK293T cell line model) approach. Some strains showed high yields of antioxidant activity by the DPPH assay (up to 10.7% IP/20.7 TE µg/mL) and by the β-carotene bleaching assay (up to 828.94 AAC), as well as significant content in phenolic (123.16 mg EAG/g DW) and flavonoid (900.60 mg EQR/g DW) compounds. Normalization of data in a “per cell” or “per cell volume” base might facilitate the comparison between strains. Additionally, most of the cyanobacterial extracts conferred some degree of protection to HEK293T cells against the H2O2-induced cytotoxicity. Freshwater Aphanizomenon gracile (LMECYA 009) and Aphanizomenon flos-aquae (LMECYA 088), terrestrial Nostoc (LMECYA 291) and wastewater Planktothrix mougeotii (LEGE 06224) seem to be promising strains for further investigation on cyanobacteria antioxidant potential.
- Assessing the antibiotic susceptibility of freshwater Cyanobacteria spp.Publication . Dias, Elsa; Oliveira, Micaela; Jones-Dias, Daniela; Vasconcelos, Vitor; Ferreira, Eugénia; Manageiro, Vera; Caniça, ManuelaFreshwater is a vehicle for the emergence and dissemination of Antibiotic resistance. Cyanobacteria are ubiquitous in freshwater, where they are exposed to antibiotics and resistant organisms, but their role on water resistome was never evaluated. Data concerning the effects of antibiotics on cyanobacteria, obtained by distinct methodologies, is often contradictory. This emphasizes the importance of developing procedures to understand the trends of antibiotic susceptibility in cyanobacteria. In this study we aimed to evaluate the susceptibility of four cyanobacterial isolates from different genera (Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon gracile, Chrisosporum bergii, Planktothix agradhii), and among them nine isolates from the same specie (M.aeruginosa) to distinct antibiotics (amoxicillin, ceftazidime, ceftriaxone, kanamycine, gentamicine, tetracycline, trimethoprim, nalidixicacid, norfloxacin). We used a method adapted from the bacteria standard broth microdilution. Cyanobacteria were exposed to serial dilution of each antibiotic (0.0015–1.6mg/L) in Z8 medium (20±1◦C; 14/10hL/D cycle; light intensity 16±421μEm−s−). Cell growth was followed overtime (OD450nm/microscopic examination) and the minimum inhibitory concentrations (MICs) were calculated for each antibiotic/ isolate. We found that β-lactams exhibited the lower MICs, aminoglycosides, tetracycline and norfloxacine presented intermediate MICs; none of the isolates were susceptible to trimethoprim and nalidixic acid. The reduced susceptibility of all tested cyanobacteria to some antibiotics suggests that they might be naturally non-susceptible to these compounds, or that they might became non-susceptible due to antibiotic contamination pressure, or to the transfer of genes from resistant bacteria present in the environment.
- Avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas (cianotoxinas)Publication . Dias, Elsa; Batoréu, Maria Camila Canteiro; Jordan, Peter; Silva, Maria JoãoAs microcistinas são metabolitos secundários produzidos por cianobactérias de água doce e constituem um risco para a saúde pública uma vez que a ingestão de água contaminada com microcistinas tem sido associada a episódios de hepatotoxicidade humana aguda e crónica. As cianobactérias são constituintes naturais do fitoplâncton de água doce e proliferam massivamente em condições ambientais favoráveis. Porém, a pressão antropogénica sobre os recursos hídricos tem contribuído para o aumento deste fenómeno a nível global, designadamente através da contaminação das massas de água com resíduos urbanos, industriais e agrícolas, cujo conteúdo enriquecido em azoto e fosfatos constitui um estímulo para o crescimento cianobacteriano. A proliferação intensa de cianobactérias (florescência) tem como consequência a acumulação de densidades elevadas de biomassa que, após a fase de senescência, liberta para a água níveis potencialmente nocivos de cianotoxinas. Uma proporção elevada das florescências é composta por cianobacterianas tóxicas e as cianotoxinas mais frequentes são as microcistinas. As microcistinas são um conjunto de aproximadamente 60 variantes estruturais partilhando a estrutura heptapeptídica cíclica comum ciclo(-D-alanina1-L-x2-D-eriro- - iso-aspartato3-L-z4-Adda5-D-glutamato6-N-metil-desidroalanina7) em que x e z são aminoácidos-L variáveis e Adda é o ácido (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8- trimetil-10-decafenil-4,6-dienóico. A MCLR (com leucina e arginina nas posições variáveis) é a variante mais tóxica e mais comum. O órgão-alvo principal das microcistinas é o fígado uma vez que os hepatócitos expressam ao nível da membrana citoplasmática polipéptidos transportadores dos aniões orgânicos, através dos quais as microcistinas entram na célula. Assim, a maioria dos estudos toxicológicos com microcistinas tem sido conduzida no fígado in vivo e em células hepáticas in vitro. Com base em estudos de toxicidade aguda em animais, foi estabelecido em 1998 pela Organização Mundial de Saúde o valor-guia de 1 nM para a MCLR em água de consumo. Porém, este valor constitui uma medida preventiva parcial, uma vez que não contempla efeitos noutros órgãos nem efeitos crónicos, nomeadamente efeitos cancerigénicos. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a MCLR apresenta toxicidade noutros órgãos tais como os intestinos, os rins, o cérebro, pulmões e sistema reprodutor. Por outro lado, e embora a informação disponível sobre a toxicidade crónica ii não permita ainda a revisão daquele valor, a MCLR está actualmente classificada pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como um composto potencialmente cancerigénico (classe 2B). Alguns estudos epidemiológicos associaram o aumento da incidência de hepatocarcinoma e cancro do cólon em populações humanas ao consumo de água contaminada regularmente com microcistinas. Por outro lado, estudos de carcinogenicidade em ratinhos revelaram que a MCLR é um promotor tumoral no fígado, pele e cólon. Recentemente tem sido descrita a actividade genotóxica da MCLR em diferentes tipos celulares. Contudo este é ainda um assunto alvo de alguma controvérsia na comunidade científica e não é ainda claro que a MCLR tenha, per si, capacidade de iniciação tumoral. Portanto, o conhecimento dos mecanismos subjacentes a uma eventual acção cancerigénica das microcistinas apresenta imensas lacunas. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi a avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas. Numa fase inicial seleccionou-se um modelo experimental in vitro (trabalho apresentado no capítulo 2). Para tal avaliou-se o efeito de extractos semi-purificados de duas estirpes de Microcystis aeruginosa, uma produtora de MCLR e outra não produtora de cianotoxinas, no crescimento e viabilidade de linhas celulares de hepatócitos humanos (HepG2) e de ratinho (AML12) e numa linha celular de rim de macaco (Vero-E6), através de testes de citotoxicidade (MTT e LDH). A escolha dos hepatócitos é óbvia, uma vez que o fígado é o órgão-alvo das microcistinas. Usaram-se hepatócitos humanos e de ratinho porque a sensibilidade à MCLR pode depender da espécie. Usou-se também uma linha celular de rim, com o intuito, à data do planeamento do trabalho, de incluir nos ensaios um modelo celular não hepático como controlo negativo. As estirpes de M. aeruginosa foram isoladas de florescências naturais colhidas na albufeira de Montargil e são actualmente mantidas na colecção de algas “Estela Sousa e Silva” do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA). A caracterização da produção de cianotoxinas pelas estirpes usadas neste trabalho foi elaborada previamente no âmbito de outros trabalhos de investigação decorridos no Departamento de Saúde Ambiental do INSA. A utilização da estirpe de M. aeruginosa não tóxica teve como finalidade assegurar que os efeitos observados se deviam à MCLR e não a qualquer efeito da matriz do extracto cianobacteriano. Contrariamente ao esperado, a linha celular de rim Vero-E6 apresentou uma sensibilidade similar ou até ligeiramente superior à dos hepatócitos (HepG2 e AML12). Por outro lado, o extracto da estirpe produtora de MCLR induziu um efeito genotóxico (aumento da frequência de iii micronucleos) nas células Vero-E6. Perante estes resultados inesperados e considerando o desconhecimento ainda existente acerca da toxicidade das microcistinas em células não hepáticas, seleccionou-se este modelo celular para a avaliação dos potenciais efeitos genotóxicos da MCLR. Para tal, a citotoxicidade da MCLR nas células Vero-E6 foi confirmada através da comparação dos efeitos de extractos de M. aeruginosa e MCLR pura (capítulo 3) e o limiar de citotoxicidade (25 μM) foi determinado, usando os testes MTT, LDH e Neutral Red. Os resultados deste trabalho demonstraram que a citotoxicidade da MCLR apresenta uma forte dependência do binómio dose/tempo de exposição e indiciaram que poderá manifestar-se primeiramente ao nível lisossomal e, sequencialmente, ao nível da mitocôndria e da membrana citoplasmática. Essa hipótese foi comprovada pelas metodologias de microscopia electrónica de transmissão e de imunofluorescência (capítulo 4). Estas metodologias permitiram identificar os alvos intracelulares da MCLR (retículo endoplasmático, lisosomas, citosqueleto, mitocôndria e membrana citoplasmática) e concluir que, de acordo com a dose e tempo de exposição, a MCLR desencadeia uma resposta autofágica nas células Vero, seguida da morte celular por apotose e necrose à medida que a dose e o tempo de exposição aumentam. Muitos destes resultados haviam sido já descritos para hepatócitos, mas apenas muito pontualmente para outros tipos celulares. Caracterizados os efeitos citotóxicos da MCLR, foram avaliados os efeitos genotóxicos nas células Vero e nas células HepG2 (capítulo 5) através do teste do Cometa e do ensaio dos micronúcleos (MN). O primeiro permite detectar quebras na cadeia de ADN, enquanto que o segundo avalia efeitos ao nível cromossómico, designadamente efeitos resultantes da quebra de cromossomas (clastogénese) ou da perda de cromossomas (aneugénese). Os resultados obtidos comprovaram que a MCLR (em doses subcitotóxicas, 5-20 μM) induz o aumento da frequência de micronúcleos em ambas as linhas celulares, mas não induz danos na molécula de ADN. A semelhança dos resultados obtidos com as células Vero e HepG2 sugerem que a MCLR actua através de um mecanismo genotóxico comum nas células hepáticas e renais, muito possivelmente através de um mecanismo aneugénico. A distinção entre actividade clastogénica e aneugénica poderá ser importante para a avaliação do risco, uma vez que para os agentes aneugénicos pode ser possível estabelecer um limiar de exposição abaixo do qual não decorrem riscos de efeitos genotóxicos, o que não é aplicável aos agentes clastogénicos. A identificação do tipo de micronúcleos pela técnica de FISH iv recorrendo a uma sonda pancentromérica permitirá esclarecer qual o mecanismo associado a este efeito genotóxico da MCLR. Com o intuito de avaliar o efeito da MCLR na proliferação da linha celular Vero-E6, utilizou-se o teste de incorporação de BrdU, que avalia a transição G1/S do ciclo celular (capítulo 6). Os resultados permitem concluir que a exposição a doses muito baixas (1-10 nM) de MCLR estimula a proliferação das células Vero-E6. Note-se que a dose de 1nM correspondente ao valor-guia da MCLR em água de consumo definido pela OMS e está contemplado na legislação portuguesa (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto) como valor paramétrico de referência. A análise por Western-blot da expressão de cinases proteicas activadas por mitogénicos (ERK1/2, JNK, p38) revelou que a MCLR estimula a proliferação da linha celular Vero-E6 através da activação da via de sinalização ERK1/2. Integrando os resultados apresentados nesta dissertação, poder-se-à concluir que a MCLR desencadeia uma multiplicidade de efeitos nas células Vero, sugerindo que estas poderão constituir um modelo celular adequado para o estudo dos efeitos nefrotóxicos das microcistinas. Embora o fígado seja o principal órgão de acumulação e eliminação da MCLR, cerca de 10% é excretada pela urina, pelo que os rins poderão também estar expostos a esta toxina. É de particular importância a avaliação dos efeitos decorrentes da exposição continuada a baixas doses, atendendo ao potencial cancerigénico da MCLR. Os resultados aqui apresentados acerca do efeito genotóxico e da capacidade da MCLR estimular a proliferação nas células Vero contribuem para o conhecimento dos efeitos e mecanismos subjacentes à eventual acção cancerigénica das microcistinas, sobretudo porque os estudos nesta área têm sido conduzidos maioritariamente em modelos hepáticos. Os resultados salientam, também, a necessidade de rever o valor-guia estabelecido para as microcistinas.
- Avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas (cianotoxinas)Publication . Dias, Elsa; Batoréu, Maria Camila Canteiro; Jordan, Peter; Silva, Maria JoãoAs microcistinas são metabolitos secundários produzidos por cianobactérias de água doce e constituem um risco para a saúde pública uma vez que a ingestão de água contaminada com microcistinas tem sido associada a episódios de hepatotoxicidade humana aguda e crónica. As cianobactérias são constituintes naturais do fitoplâncton de água doce e proliferam massivamente em condições ambientais favoráveis. Porém, a pressão antropogénica sobre os recursos hídricos tem contribuído para o aumento deste fenómeno a nível global, designadamente através da contaminação das massas de água com resíduos urbanos, industriais e agrícolas, cujo conteúdo enriquecido em azoto e fosfatos constitui um estímulo para o crescimento cianobacteriano. A proliferação intensa de cianobactérias (florescência) tem como consequência a acumulação de densidades elevadas de biomassa que, após a fase de senescência, liberta para a água níveis potencialmente nocivos de cianotoxinas. Uma proporção elevada das florescências é composta por cianobacterianas tóxicas e as cianotoxinas mais frequentes são as microcistinas. As microcistinas são um conjunto de aproximadamente 60 variantes estruturais partilhando a estrutura heptapeptídica cíclica comum ciclo(-D-alanina1-L-x2-D-eriro- -iso-aspartato3-L-z4-Adda5-D-glutamato6-N-metil-desidroalanina7) em que x e z são aminoácidos-L variáveis e Adda é o ácido (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-decafenil-4,6-dienóico. A MCLR (com leucina e arginina nas posições variáveis) é a variante mais tóxica e mais comum. O órgão-alvo principal das microcistinas é o fígado uma vez que os hepatócitos expressam ao nível da membrana citoplasmática polipéptidos transportadores dos aniões orgânicos, através dos quais as microcistinas entram na célula. Assim, a maioria dos estudos toxicológicos com microcistinas tem sido conduzida no fígado in vivo e em células hepáticas in vitro. Com base em estudos de toxicidade aguda em animais, foi estabelecido em 1998 pela Organização Mundial de Saúde o valor-guia de 1 nM para a MCLR em água de consumo. Porém, este valor constitui uma medida preventiva parcial, uma vez que não contempla efeitos noutros órgãos nem efeitos crónicos, nomeadamente efeitos cancerigénicos. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a MCLR apresenta toxicidade noutros órgãos tais como os intestinos, os rins, o cérebro, pulmões e sistema reprodutor. Por outro lado, e embora a informação disponível sobre a toxicidade crónica não permita ainda a revisão daquele valor, a MCLR está actualmente classificada pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como um composto potencialmente cancerigénico (classe 2B). Alguns estudos epidemiológicos associaram o aumento da incidência de hepatocarcinoma e cancro do cólon em populações humanas ao consumo de água contaminada regularmente com microcistinas. Por outro lado, estudos de carcinogenicidade em ratinhos revelaram que a MCLR é um promotor tumoral no fígado, pele e cólon. Recentemente tem sido descrita a actividade genotóxica da MCLR em diferentes tipos celulares. Contudo este é ainda um assunto alvo de alguma controvérsia na comunidade científica e não é ainda claro que a MCLR tenha, per si, capacidade de iniciação tumoral. Portanto, o conhecimento dos mecanismos subjacentes a uma eventual acção cancerigénica das microcistinas apresenta imensas lacunas. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi a avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas. Numa fase inicial seleccionou-se um modelo experimental in vitro (trabalho apresentado no capítulo 2). Para tal avaliou-se o efeito de extractos semi-purificados de duas estirpes de Microcystis aeruginosa, uma produtora de MCLR e outra não produtora de cianotoxinas, no crescimento e viabilidade de linhas celulares de hepatócitos humanos (HepG2) e de ratinho (AML12) e numa linha celular de rim de macaco (Vero-E6), através de testes de citotoxicidade (MTT e LDH). A escolha dos hepatócitos é óbvia, uma vez que o fígado é o órgão-alvo das microcistinas. Usaram-se hepatócitos humanos e de ratinho porque a sensibilidade à MCLR pode depender da espécie. Usou-se também uma linha celular de rim, com o intuito, à data do planeamento do trabalho, de incluir nos ensaios um modelo celular não hepático como controlo negativo. As estirpes de M. aeruginosa foram isoladas de florescências naturais colhidas na albufeira de Montargil e são actualmente mantidas na colecção de algas “Estela Sousa e Silva” do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA). A caracterização da produção de cianotoxinas pelas estirpes usadas neste trabalho foi elaborada previamente no âmbito de outros trabalhos de investigação decorridos no Departamento de Saúde Ambiental do INSA. A utilização da estirpe de M. aeruginosa não tóxica teve como finalidade assegurar que os efeitos observados se deviam à MCLR e não a qualquer efeito da matriz do extracto cianobacteriano. Contrariamente ao esperado, a linha celular de rim Vero-E6 apresentou uma sensibilidade similar ou até ligeiramente superior à dos hepatócitos (HepG2 e AML12). Por outro lado, o extracto da estirpe produtora de MCLR induziu um efeito genotóxico (aumento da frequência de micronucleos) nas células Vero-E6. Perante estes resultados inesperados e considerando o desconhecimento ainda existente acerca da toxicidade das microcistinas em células não hepáticas, seleccionou-se este modelo celular para a avaliação dos potenciais efeitos genotóxicos da MCLR. Para tal, a citotoxicidade da MCLR nas células Vero-E6 foi confirmada através da comparação dos efeitos de extractos de M. aeruginosa e MCLR pura (capítulo 3) e o limiar de citotoxicidade (25 μM) foi determinado, usando os testes MTT, LDH e Neutral Red. Os resultados deste trabalho demonstraram que a citotoxicidade da MCLR apresenta uma forte dependência do binómio dose/tempo de exposição e indiciaram que poderá manifestar-se primeiramente ao nível lisossomal e, sequencialmente, ao nível da mitocôndria e da membrana citoplasmática. Essa hipótese foi comprovada pelas metodologias de microscopia electrónica de transmissão e de imunofluorescência (capítulo 4). Estas metodologias permitiram identificar os alvos intracelulares da MCLR (retículo endoplasmático, lisosomas, citosqueleto, mitocôndria e membrana citoplasmática) e concluir que, de acordo com a dose e tempo de exposição, a MCLR desencadeia uma resposta autofágica nas células Vero, seguida da morte celular por apotose e necrose à medida que a dose e o tempo de exposição aumentam. Muitos destes resultados haviam sido já descritos para hepatócitos, mas apenas muito pontualmente para outros tipos celulares. Caracterizados os efeitos citotóxicos da MCLR, foram avaliados os efeitos genotóxicos nas células Vero e nas células HepG2 (capítulo 5) através do teste do Cometa e do ensaio dos micronúcleos (MN). O primeiro permite detectar quebras na cadeia de ADN, enquanto que o segundo avalia efeitos ao nível cromossómico, designadamente efeitos resultantes da quebra de cromossomas (clastogénese) ou da perda de cromossomas (aneugénese). Os resultados obtidos comprovaram que a MCLR (em doses subcitotóxicas, 5-20 μM) induz o aumento da frequência de micronúcleos em ambas as linhas celulares, mas não induz danos na molécula de ADN. A semelhança dos resultados obtidos com as células Vero e HepG2 sugerem que a MCLR actua através de um mecanismo genotóxico comum nas células hepáticas e renais, muito possivelmente através de um mecanismo aneugénico. A distinção entre actividade clastogénica e aneugénica poderá ser importante para a avaliação do risco, uma vez que para os agentes aneugénicos pode ser possível estabelecer um limiar de exposição abaixo do qual não decorrem riscos de efeitos genotóxicos, o que não é aplicável aos agentes clastogénicos. A identificação do tipo de micronúcleos pela técnica de FISH recorrendo a uma sonda pancentromérica permitirá esclarecer qual o mecanismo associado a este efeito genotóxico da MCLR. Com o intuito de avaliar o efeito da MCLR na proliferação da linha celular Vero-E6, utilizou-se o teste de incorporação de BrdU, que avalia a transição G1/S do ciclo celular (capítulo 6). Os resultados permitem concluir que a exposição a doses muito baixas (1-10 nM) de MCLR estimula a proliferação das células Vero-E6. Note-se que a dose de 1nM correspondente ao valor-guia da MCLR em água de consumo definido pela OMS e está contemplado na legislação portuguesa (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto) como valor paramétrico de referência. A análise por Western-blot da expressão de cinases proteicas activadas por mitogénicos (ERK1/2, JNK, p38) revelou que a MCLR estimula a proliferação da linha celular Vero-E6 através da activação da via de sinalização ERK1/2. Integrando os resultados apresentados nesta dissertação, poder-se-à concluir que a MCLR desencadeia uma multiplicidade de efeitos nas células Vero, sugerindo que estas poderão constituir um modelo celular adequado para o estudo dos efeitos nefrotóxicos das microcistinas. Embora o fígado seja o principal órgão de acumulação e eliminação da MCLR, cerca de 10% é excretada pela urina, pelo que os rins poderão também estar expostos a esta toxina. É de particular importância a avaliação dos efeitos decorrentes da exposição continuada a baixas doses, atendendo ao potencial cancerigénico da MCLR. Os resultados aqui apresentados acerca do efeito genotóxico e da capacidade da MCLR estimular a proliferação nas células Vero contribuem para o conhecimento dos efeitos e mecanismos subjacentes à eventual acção cancerigénica das microcistinas, sobretudo porque os estudos nesta área têm sido conduzidos maioritariamente em modelos hepáticos. Os resultados salientam, também, a necessidade de rever o valor-guia estabelecido para as microcistinas.
- Cianobactérias e cianotoxinas em água tratada: conhecer para prevenirPublication . Dias, Elsa; Sarioglou, Konstantina; Ortiz, Miriam; Menezes, CarinaA monitorização da qualidade da água para consumo humano relativamente à presença de cianobactérias é uma das atribuições do Departamento de Saúde Ambiental do Instituto Nacional de Saúde. A proliferação massiva de cianobactérias (bloom) em reservatórios de água doce superficial tem impactos no ecossistema aquático, nos procedimentos operativos das estações de tratamento de água e acarreta riscos para a saúde humana e animal devido à capacidade toxigénica de algumas espécies cianobacterianas. Neste trabalho descreve-se a deteção de uma densidade elevada da espécie Dolichospermum planctonicum numa amostra de água tratada, bem como a presença de anatoxina-a (neurotoxina). A legislação portuguesa apenas contempla um valor paramétrico de referência para microcistinas (hepatotoxinas). Porém, de acordo com os valores-guia da Organização Mundial da Saúde, a anatoxina-a foi detetada numa concentração abaixo do valor recomendado para água de consumo humano. Os resultados alertam para a importância da monitorização regular de cianobactérias em água bruta e tratada e da adequação da monitorização de cianotoxinas em função do potencial tóxico das espécies presentes. Por outro lado, salienta-se a necessidade de integrar os dados de monitorização a nível do país, pois só assim será possível conhecer o cenário real de ocorrência de blooms tóxicos em Portugal, e, em conformidade, adequar a legislação nacional.
- Cianobactérias e Saúde: um problema ou uma oportunidade?Publication . Dias, Elsa; Paulino, Sérgio; Pereira, PauloMuito se tem escrito e discutido sobre o impacto negativo das toxinas produzidas por cianobactérias na saúde humana. No entanto, muitas dúvidas persistem sobre os efeitos reais destes compostos nas populações. A comunidade científica depara-se com dificuldades na avaliação do risco de exposição humana a cianotoxinas, o que dificulta a regulamentação dos níveis de toxinas no ambiente, bem como a gestão do risco associado às ocorrências de cianobactérias tóxicas. Em países com Portugal e Espanha o risco de intoxicação aguda por cianotoxinas será provavelmente reduzido. Nestes países, os sistemas de tratamento de água e os programas de vigilância em águas de consumo e recreativas garantem que as populações não serão expostas a níveis elevados de toxinas. No entanto, desconhecemos quais os riscos de exposição humana prologada a baixas doses decorrente da utilização de reservatórios frequentemente contaminados com cianobactérias tóxicas, onde eventualmente persistem níveis residuais de cianotoxinas, inferiores ao limite legal e até ao limite de deteção analítico. O potencial cancerígeno de algumas cianotoxinas tem vindo a ser discutido. É amplamente aceite que as microcistinas induzem hepatotoxicidade aguda, que actuam pela inibição das fosfatases proteicas PP1 e PP2A e do stress oxidativo, que são promotores tumorais. São toxinas classificadas pela IARC como “possivelmente cancerigenicas para os humanos (classe 2B)”. No entanto, a evidência epidemiológica não é suficientemente sustentada, especula-se que as microcistinas sejam agentes genotóxicos e que, portanto, possam ser também iniciadores tumorais. Mas ainda não sabemos se as microcistinas são cancerígenas. Ultimamente tem sido dada maior atenção à cilindrospermopsina, descrita como genotóxica e cuja ocorrência em países não tropicais tem vindo a ser descrita, embora muito se desconheça sobre a sua toxicocinética e os seus efeitos no Homem, em particular os efeitos a longo termo. Outro exemplo é o do BMAA, conhecido há várias décadas e “re-descoberto” recentemente na Europa e na Península Ibérica, que ilustra bem o paradigma da incerteza toxicológica. Assumimos, portanto, que as cianotoxinas são prejudiciais à saúde humana, mas ainda não sabemos como avaliar e gerir os seus riscos. Por outro lado, a ligação das cianobactérias à saúde humana não se resume à toxicidade e efeitos nocivos. Nos últimos anos temos vindo a assistir a um crescente interesse na actividade antibiótica, antiviral, anti-inflamatória e enzimática de bioprodutos cianobacterianos com potencial aplicação médica e biotecnológica, nomeadamente, na terapia de patologias tão diversas como o cancro, a dor crónica, a acalásia e a doença de Alzheimer, entre outras. Podemos, ainda, encontrar referências à aplicação de metabolitos cianobacterianos no combate a agentes infeciosos ou sobre o envolvimento das cianobactérias no fenómeno de disseminação de resistência a antibióticos no ambiente. Estas são novas áreas de intersecção cianobactérias-saúde, nas quais Portugal e Espanha começam já a dar o seu importante contributo.
- Coleção de culturas de algas Estela Sousa e SilvaPublication . Menezes, Carina; Churro, Catarina; Paulino, Sérgio; Sam-Bento, Filomena; Alverca, Elsa; Dias, Elsa; Pereira, PauloA coleção de culturas de algas Estela Sousa e Silva (ESSACC) foi criada em 1956 e reside atualmente no Laboratório de Biologia e Ecotoxicologia no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. A ESSACC foi implementada em resposta à necessidade de um repositório de material biológico para investigação na área do fitoplâncton. Este importante recurso biológico contém culturas monoclonais de algas eucarióticas e cianobactérias provenientes de águas costeiras e albufeiras portuguesas. Atualmente, a coleção mantém acima de 176 isolados vivos, dos quais 151 são cianobactérias de água doce e 25 são dinoflagelados marinhos. Adicionalmente são também mantidos alguns isolados pertencentes a outros grupos de fitoflagelados. Esta coleção permitiu até agora a identificação e caracterização de espécies assim como a produção e purificação de toxinas para aplicação em estudos toxicológicos entre outras diversas áreas de investigação. Deste modo, a ESSACC constitui uma ferramenta importante no fornecimento de culturas de algas a investigadores na área do fitoplâncton, particularmente no estudo de espécies nocivas.
- Comparison of saxitoxin-genes expression and production profiles between Aphanizomenon gracile and Cuspidotrix issastchenkoi strains, isolated from freshwater reservoirsPublication . Reis, Marta; Menezes, Carina; Dias, Elsa; Valério, ElisabeteSaxitoxins (STX) are a group of carbamate alkaloids known to inhibit the axons sodium ion channels, thus affecting the nervous system in vertebrates. These neurotoxins cause paralysis and respiratory failure, ultimately ending in death. They are produced by organisms belonging to two different kingdoms: marine eukaryotic dinoflagellates and freshwater prokaryotic cyanobacteria. The unique biosynthetic pathway, which is responsible for encoding proteins that allow synthesizing and exporting STX, is the cluster sxt, already described in several cyanobacterial species. It has been observed that diverse environmental factors affect differently STX production in cyanobacteria. Among those, temperature is the one that aroused greater interest, since it directly affects cyanobacterial growth rates, however controversial results have been reported. Furthermore, studies on the environmental regulation of STX synthesis and transport are quite rare. In this work, we tested the influence of temperature in two STX producers, Aphanizomenon gracile LMECYA40 and Cuspidothrix issatschenkoi LMECYA31, isolated from Portuguese freshwaters and maintained in the ESSACC. Total STX concentration, the expression of genes linked to STX biosynthesis (sxtA) and transport (sxtM and sxtPer) and the percentage of heterocytes per trichome were determined, in four different phases of cyanobacterial growth (lag, early exponential, late exponential and stationary phases). At 20ºC, a higher expression of the sxt genes and higher production of STX in the late exponential and stationary phase was observed in both species. Also, C. issatschenkoi produced more STX throughout the growth cycle than A. gracile. In A. gracile the percentage of heterocytes per trichome was higher in the lag phase, decreasing along the cell cycle. C. issatschenkoi did not form heterocytes throughout the growth cycle. Further experiments are being performed at 10ºC and 30°C in order to understand the effect of temperatures environmentally relevant in STX producers.