DPSPDNT - Dissertações de mestrado
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- Caracterização Bioquímica e Molecular da Hipercolesterolemia Familiar na Região Norte e Centro de PortugalPublication . Freitas, Ana Isabel da Costa; Bourbon, Mafalda; Sousa, Maria JoãoFamilial Hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant genetic disorder and one of the most common genetic disorders in Europe and often under-diagnosed. The FH phenotype is characterized mainly by increased levels of total cholesterol (TC) and cholesterol in low-density lipoproteins (c-LDL) as well as the development of premature coronary heart disease and atherosclerosis. This condition is often caused by mutations in the Low-Density Lipoproteins Receptor (LDLR) gene however mutations in the Apolipoprotein B (ApoB) gene and Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) gene are also described as disease causing. The biochemical and molecular characterization of FH in patients from northern and central regions of Portugal was the purpose of this work. The study was based on molecular analysis of the LDLR gene and APOB gene by PCR amplification and direct sequencing. Were referred to the Portuguese Familial Hypercholesterolemia Study (EPHF), 34 individuals born in north or central region of Portugal, however 7 (20.6%) had no criteria for clinical diagnosis of FH. 17 (63%) of 27 index cases studied, were children (_ 16 years). The values of TC and c-LDL in the pediatric group were 249.4 ± 25.6 mg /dL and 173.8 ± 28.0 mg /dL, respectively. In the adult population these values were 308.0 ± 21.9 mg /dL and 218.5 ± 15.6 mg /dL. The genetic cause of hypercholesterolemia was determined in 29.6% of individuals. 7 genetic alterations were identified in the LDLR gene and only 1 in the APOB gene. Of the founded mutations, 3 are not yet described. This study highlights the importance of early diagnosis and cardiovascular prevention, enabling the introduction of therapeutic measures earlier and/or aggressive in both index cases and relatives, identified genetically with FH.
- The role of peripheral blood mononuclear cells in atherogenesisPublication . Simões Martins Bispo, Cláudia; Crespo, Ana Maria Viegas; Costa, Luciana Maria Gonçalves daAtherosclerosis (ATH) is recognized as a chronic inflammatory condition and it is the leading cause of cardiovascular disease. Atherogenesis is characterized by the infiltration of low density lipoprotein (LDL) through the endothelial layer, and migration of activated peripheral blood lymphocytes (PBL) and monocytes (PBMN) that contribute to a pro-inflammatory state in specific locations. However, the functional interaction between immunity and LDL metabolism is still not fully understood. One hypothesis for the etiopathogeny of ATH may be associated with an ongoing inflammatory process caused by a pro-oxidant/anti-oxidant imbalance induced by metals such as iron (Fe) or copper (Cu). Interestingly, ceruloplasmin (Cp) is a multicopper oxidase with a relevant role in Fe metabolism and oxidation of LDL, but also an acute-phase protein involved in the inflammatory process. Herein, we intended to study by flow cytometry the effect of putative pro-atherogenic immune stimuli on the expression of Cp at the surface of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and search for a putative association with LDL oxidation. Additionally, a population of Familial Hypercholesterolemia (FH) patients was used as a clinical model of ATH to clarify the physiologic interplay between inflammation, Fe/Cu and lipid metabolism at systemic level in this disease. The obtained results showed that higher cell surface expression of Cp was consistently observed in PBMN compared to PBL, in activated vs non-activated cells and in non-T cells vs T cells. Also, PBMC surface expression of Cp was differently modulated by several tested treatments. In particular, various modulators caused opposite effects on Cp expression of PBMN compared to PBL, suggesting a specific cell-type regulation for this protein. Specifically, it was observed that different sources of Fe might activate specific regulation mechanisms of Cp. Until now, due to technical limitations it was not possible to demonstrate an association between PBMC surface Cp expression and oxidation of LDL, but this issue should be addressed in future experiments. Of notice, IL-1β which was found to significantly increase PBMN surface Cp expression in vitro, was increased in serum from FH patients and positively correlated with total cholesterol and ApoB. However, the fact that no correlation was found between IL-1β and serum Cp (sCp)/oxidated LDL suggest that at systemic level, IL-1β may not be a contributing factor for oxidation of LDL by sCp. However, the role of PBMC surface Cp expression on LDL oxidation, namely in specific inflammatory states, remains to be established. In summary, the results of this study demonstrate that specific pro-atherogenic conditions are involved in the modulation of Cp expression at surface of PBMC and thus, suggest a possible a role of Cp in ATH.
- Estudo Molecular de Dislipidemias FamiliaresPublication . Andreia Paninho Berguete Coelho, Sara; Bourbon, Mafalda; Rebelo, Maria Teresa Ferreira Ramos Nabais de OliveiraA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma dislipidemia de transmissão autossómica dominante que se caracteriza por níveis elevados de colesterol no plasma e aparecimento prematuro de aterosclerose e de doença cardiovascular. Mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9 são causa de FH. A dislipidemia familiar combinada (FCHL) é uma hiperlipidemia poligénica também relacionada com a ocorrência de DCV prematura. O seu fenótipo tem sido associado a alterações nos genes LPL, APOC2, APOC3, APOA4 e APOA5. O objectivo deste trabalho consistiu na caracterização clínica e molecular de indivíduos com suspeita clínica de dislipidemia familiar, nomeadamente FH. Foi também objectivo do estudo a avaliação dos critérios clínicos da FH. A amostra de estudo consistiu em 40 casos-índex (crianças e adultos de ambos os sexos) referenciados ao INSA por suspeita clínica de FH. A caracterização bioquímica permitiu avaliar o fenótipo do doente e inferir sobre a aplicação de critérios de diagnóstico clínico de FH. A caracterização molecular incluiu a pesquisa de alterações nos genes LDLR, APOB e PCSK9, recorrendo às metodologias de dHPLC, sequenciação automática e MLPA. Em 5 doentes que apresentavam também TG elevados foi efectuada a pesquisa de alterações nos genes LPL, APOC2, APOC3, APOA4 e APOA5, por sequenciação automática dos mesmos. O estudo molecular dos 40 casos-índex estudados identificou 15 (37,5%) indivíduos com FH. Em 31-39% dos 609 casos-índex portugueses já estudados no EPGH, o diagnóstico clínico resultante da aplicação dos 2 critérios clínicos de FH aplicados não coincide com os resultados do estudo molecular. Relativamente à FCHL, o estudo molecular somente identificou alterações que estão descritas como polimorfismos. A identificação precoce de casos-índex com dislipidemia familiar e dos seus familiares em risco pode aumentar a qualidade e a esperança de vida destes indivíduos, por aplicação de uma orientação terapêutica adequada, que possa possibilitar a redução da incidência de doenças cardiovasculares prematuras.
- Estudo Bioquímico e Molecular de Famílias com Hipercolesterolemia FamiliarPublication . Raquel Gameiro Leitão, Flávia; Bourbon, Mafalda; Crespo, Ana Maria ViegasIntrodução: A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma patologia genética, caracterizada clinicamente por um aumento dos níveis de colesterol-LDL (c-LDL) no plasma, sendo maioritariamente causada por mutações no gene do receptor das LDL (gene LDLR). Mutações missense nos genes APOB ou PCSK9 podem causar fenótipos semelhantes. A FH sozinha ou em conjugação com outros factores de risco cardiovasculares pode promover o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCVs) prematuras. De acordo com a frequência da doença (1:500 indivíduos) estima-se que em Portugal existam cerca de 20.000 doentes com FH, porém esta encontra-se sub-diagnosticada. Até à data, apenas foram diagnosticados aproximadamente 550 doentes. O método de cascade screening (CS) permite a rápida identificação de indivíduos com FH numa família e foi descrito como custo-efectivo na identificação de novos doentes com FH. Objectivos: O principal objectivo deste trabalho foi, através do CS, aumentar o número de casos identificados com FH. Pretendeu-se ainda realizar a caracterização bioquímica de casos índex e respectivos familiares com FH, a fim de tentar correlacionar o genótipo e o fenótipo destes e compreender de que forma a FH e outros factores de risco cardiovascular influenciam o desenvolvimento de DCVs nesta população. Métodos: Para alcançar os objectivos propostos, estudaram-se 45 famílias, perfazendo um total de 194 indivíduos, 45 casos índex (cujo estudo molecular já havia sito realizado) e 149 familiares. As amostras de soro de casos índex e familiares foram analisados por electroforese de lipoproteínas para avaliação da presença de sdLDL e por métodos enzimáticos e colorimétricos automatizados para determinar a concentração de sdLDL e outras apolipoproteínas no soro. Após extracção de DNA dos familiares realizou-se a amplificação e sequenciação dos exões em que se detectou uma mutação no respectivo caso índex (gene LDLR, APOB). Foi ainda determinado o genótipo APOE de todos os indivíduos estudados. Os resultados da sequenciação foram analisados através do software staden package. Por fim realizou-se uma análise estatística de forma a interpretar os resultados obtidos. Resultados: A partir do estudo molecular aos 149 familiares, foram diagnosticados com FH 83 indivíduos (20 crianças e 63 adultos). Determinou-se que 71,79% das crianças e 76,62% dos adultos apresentam um genótipo APOE E3/E3, não se obtendo diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes alelos e o perfil bioquímico. Relativamente à estratificação das sdLDL, 65,52% das crianças e 72,88% dos adultos apresentam, maioritariamente, subfracções maiores e menos densas das LDL. Observou-se ainda que os níveis de Lipoproteína(a) são tendencialmente superiores em indivíduos com DCV. Da amostra total, 47,93% dos indivíduos com FH não estão ainda medicados. Porém, mesmo os indivíduos medicados apresentam um perfil lipídico de risco para o desenvolvimento de uma DCV prematura. Conclusão: O CS é um método cujo custo-benefício é extremamente eficaz. Sendo, no entanto, necessário, aumentar a adesão dos familiares. O CS permite identificar precocemente indivíduos com FH, que apresentam elevado risco cardiovascular, necessitando de intervenções farmacológica e de controlo de outros factores de risco adequadas. Os resultados obtidos demonstram que mais de 50% dos casos não tem o seu risco cardiovascular controlado, sendo essencial uma melhor compreensão sobre a dinâmica existente entre as DCVs e a FH.
- Epidemiologia genética do Acidente Vascular Cerebral: identificação de genes envolvidos na susceptibilidade e na recuperação do doentePublication . Paulos Pinheiro, Sofia; Vicente, Astrid Moura; Rebelo, Maria Teresa dos SantosO Acidente Vascular Cerebral (AVC) é um evento neurológico agudo resultante de uma doença cardiovascular, no qual a afluência de sangue ao cérebro se vê comprometida, seja por um bloqueio ou por uma ruptura num vaso sanguíneo cerebral. Esta doença representa uma das principais causas de morte e morbilidade em todo o mundo, pelo que o estudo das componentes ambientais e genéticas nela envolvidas se torna fundamental para a implementação de planos de prevenção que visem minimizar as suas consequências. Com vista a contribuir para o desenvolvimento do estudo das variantes genéticas implicadas quer na susceptibilidade, quer na recuperação após um AVC, os objectivos deste estudo foram os de, por um lado, estudar a relevância do Single Nucleotide Polymorphism (SNP) rs1229984 do gene ADH1B sobre o risco de AVC e, por outro, identificar novos polimorfismos envolvidos no processo de recuperação. Recorrendo a um TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assay foi feita uma análise comparativa de dois grupos de indivíduos, um grupo saudável (controlos) e outro de doentes que sofreram AVC (casos) e verificou-se que o SNP rs1229984 do gene ADH1B, implicado no metabolismo do álcool, está, de facto, envolvido na susceptibilidade ao AVC. Porém, a mediação desta relação pelo consumo de álcool não se verificou, pelo que se sugere a replicação do estudo. Tendo por base um rastreio genómico previamente efectuado através de um Genome Wide Association Study (GWAS) em pooled samples, cujo objectivo era a identificação de genes envolvidos na recuperação após um AVC, realizou-se um novo estudo acerca da recuperação após um AVC, como mesmo objectivo. Seleccionaram-se diversos SNPs segundo critérios bem definidos (e distintos do primeiro estudo), para genotipagem individual, através de ferramentas como Sequenom iPLEX e TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays e Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), em grupos de indivíduos com recuperação desigual três meses após um AVC. Este estudo permitiu identificar um novo gene candidato envolvido na recuperação, o CDKAL1 e confirmar o potencial envolvimento do gene BBS9 no mesmo processo, o qual já tinha sido identificado anteriormente como gene associado à recuperação. Foi também possível aferir alguns aspectos relacionados com a interpretação dos resultados de um GWAS em pooled samples, nomeadamente acerca da importância das réplicas da formação dos pools e das réplicas de alelotipagem e acerca da necessidade de validação dos resultados por genotipagem individual. Tendo em conta a identificação de genes candidatos para a recuperação após um AVC, sugere-se que sejam desenvolvidos trabalhos futuros, nomeadamente estudos funcionais, no sentido de compreender as vias através das quais os referidos genes actuarão sobre o processo de recuperação após um AVC. Estudos de replicação em outras populações são também aconselhados, para validação das conclusões tiradas neste estudo.
- Genética molecular das Perturbações do Espectro do Autismo: Análise de variantes estruturaisPublication . Isabel Neto Coelho, Joana; Vicente, Astrid Moura; Dias, Deodália Maria AntunesAs Perturbações do Espectro do Autismo (PEA) são um grupo de doenças com uma forte etiologia genética que afectam o neurodesenvolvimento, caracterizando-se por dificuldades na interação social e comunicação e comportamentos repetitivos e estereotipados, sendo o seu diagnóstico baseado nos critérios presentes nos manuais de diagnóstico, como o DSM-V (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders). AS PEA tem uma elevada prevalência, o que torna importante o seu estudo genético, tendo já sido executados estudos em gémeos e famílias, análises citogenéticas, estudos de Linkage e de Associação, sequenciação de genes candidatos e do exoma e análise de variantes estruturais (Copy Number Variants, CNV). O principal objetivo deste trabalho foi a identificação de CNV patogénicos e loci de suscetibilidade para o autismo. Para isso, foram analisados os CNV identificados no rastreio genómico efetuado pelo Autism Genome Project (AGP), sendo realizada a validação de alguns dos CNV e identificados os seus pontos de quebra, sendo analisados os genes candidatos presentes e estabelecida uma relação entre o fenótipo clinico das crianças e os genes duplicados ou deletados. Nos CNV que se concluiu serem herdados foi, também, analisado o padrão de transmissão dos CNV herdados e feita uma correlação do seu conteúdo génico com traços autistas dos familiares. Foram ainda estudados os potenciais mecanismos que poderão estar na base do fenótipo de autismo. No decorrer do estudo, foram inicialmente escolhidos os CNV com base no seu tamanho e conteúdo génico, presentes nos cromossomas 3p22.1-22.2, 9q31.1, 11q14.3, 16p13.11-13.12 e 20p13. Para validar estes CNV, foi usada a técnica de PCR quantitativo em tempo real (Quantitative Real Time PCR, qPCR), sendo validadas duas duplicações, uma presente na zona 3p22.1-22.2, como sendo herdada do pai e outra na zona 20p13, que se verificou ser herdada da mãe. Foram ainda validadas as deleções existentes na banda 9q31.1, como sendo de novo e na banda 16p13.11-13.12, herdada numa das crianças e de novo noutra. A deleção na banda 11q14.3 revelou ser um falso positivo em dois indivíduos. Os pontos de quebra foram identificados nos CNV presentes nas regiões 9q31.1 e 20p13, com recurso a técnica de PCR de cadeia longa (Long Range PCR, LR-PCR). Alem disso, foi realizado um rastreio populacional da duplicação na região cromossómica 9q21.13, em 104 casos de autismo e 265 controlos e foi identificado um novo caso com esta duplicação, tendo sido sequenciados os seus pontos de quebra. Na análise do fenótipo clinico e da história familiar de cada criança com estes CNV, observou-se uma grande hetrogeneidade clinica das PEA, a nível da presença de deficiência mental e dos atrasos do desenvolvimento motor e da linguagem e, alguns deles, tinham uma história familiar de doenças psiquiátricas ou atrasos cognitivos. Depois da análise do padrão de transmissão dos CNV nas famílias em que este era herdado, pode-se concluir que ocorria uma co-segregação com traços autistas ou psicopatologias no individuo que transmite o CNV, em duas das famílias estudadas. Foi ainda realizada uma relação dos fenótipos das crianças com os genes afetados pelos CNV, concluindo-se que a maioria deles continha genes relacionados com o mecanismo de transmissão sináptica ou apresentavam funções importantes relacionadas com o desenvolvimento e plasticidade neuronais, como os genes ANXA1, SCN11A, MOBP, SLC44A1, GRIN3A, NDE1, NTNA1, PDYN, SIRPA. Futuramente e importante identificar um maior número de genes associados as PEA e os mecanismos moleculares envolvidos nesta patologia, o que será possível com o desenvolvimento das técnicas de sequenciação, que permitem identificar mutações genéticas significativas o autismo. Isto poderá permitir a descoberta de novos alvos terapêuticos, bem como o desenvolvimento de um teste genético para o diagnóstico molecular de autismo.
- Estudo sobre a prevalência de fatores de risco cardiovascular numa amostra de adultos da Região de LisboaPublication . Duarte, Elisete Guerreiro; Bourbon, Mafalda; Vale, Ana Filipa
- Expression of iron metabolism: related genes in a portuguese population of Alzheimer’s disease patientsPublication . Cavaco Guerreiro, Cláudia; Rebelo, Maria Teresa; Costa, Luciana Maria Gonçalves da[ENG] Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and one of the most frequent dementia worldwide. The main neuropathological hallmarks of AD are extracellular senile “plaques” (SP) and intracellular neurofibrillary “tangles” (NFT), which are associated with the loss of cortical neurons. This disease is also characterized by elevated brain iron (Fe) levels and accumulation of copper and zinc in cerebral Aβ amyloid deposits, like SP. Thus, a dysfunctional homeostasis of transition metals seems to play pivotal role in pathogenesis of this disease. In this work we intended to further understand the putative role of Fe metabolism in AD pathophysiology. In order to achieve this goal, the expression of specific target Fe metabolism-related genes was measured in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from AD patients and controls by real time quantitative PCR techniques while Fe status in the periphery was evaluated using biochemical standard techniques. The results obtained showed significant decrease in the expression of acotinase 1 (ACO1; P=0.011); ferroportin (SLC40A1; P<0.001); ceruloplasmin (CP; P<0.001); amyloid peptide precursor (APP; P=0.007); transferrin receptor 1 (TFR1; P<0.001) and transferrin receptor 2 (TFR2; P<0.001) genes, in contrast with an increase in the expression of light chain of ferritin (FT-L; P=0.038) in AD patients compared with healthy volunteers. Also, although we did not find significant differences in Fe metabolism parameters measured in serum, a tendency for the decrease in serum Fe and ferritin (Ft) concentrations was observed in AD patients. These observations reinforce previous reports showing a low Fe status in periphery of AD patients. According to these findings one can suggest impairment in cellular Fe efflux in AD individuals, which may lead to cellular Fe overload and oxidative stress, a typical feature of this disease. Nevertheless, further research into the characterization of regulation of Fe metabolism at both phenotypic and genetic levels in AD may be important to provide a low invasive and earlier form for its diagnosis. Resumo: A doença de Alzheimer (AD) é a doença neurodegenerativa mais comum e representa um dos tipos de demência mais frequentes a nível mundial. As suas principais características neuropatológicas são a formação de “placas senis” e de “emaranhados neurofibrilares”, associados à perda de neurónios corticais. Esta doença é também caracterizada pela presença de elevados níveis de ferro (Fe) no cérebro e pela acumulação de cobre e de zinco nos agregados de β-amilóide, que constituem as “placas senis”. Desta forma, uma disfunção na homeostase dos metais de transição parece desempenhar um papel crucial na patogénese da AD. Neste trabalho pretendeu-se compreender o papel do metabolismo do Fe na patofisiologia da AD. A fim de alcançar este objectivo mediu-se expressão de genes-alvo específicos relacionados com o metabolismo do Fe, em células mononucleares de sangue periférico em doentes e controlos, através de técnicas de PCR quantitativo em tempo real. O status de Fe a nível periférico foi avaliado através da utilização de técnicas bioquímicas comuns. Os resultados obtidos mostraram uma diminuição significativa na expressão dos genes acotinase 1 (ACO1; P=0.011); SLC40A1 (P<0.001); ceruloplasmina (CP; P<0.001) proteína percursora da amilóide (APP; P=0.007); receptor da transferrina 1 (RTF1; P<0.001) e do receptor da transferrina 2 (RTF2; P<0.001), enquanto se verificou um aumento da expressão da cadeia leve da FT (FT-L; P=0.038) nos doentes em comparação com os indivíduos saudáveis. Por seu turno, os resultados bioquímicos mostraram, apesar de não terem sido encontradas diferenças significativas entre os doentes e os controlos, uma tendência para uma diminuição da concentração sérica de Fe e ferritina (Ft) e nos doentes. Estas observações estão de acordo com resultados anteriores, que mostraram a existência de uma baixa concentração de Fe periférico em doentes com AD. Os resultados obtidos neste estudo apontam para uma disfunção celular no efluxo de Fe em doentes com AD, o que pode levar a uma sobrecarga de Fe celular e ao stress oxidativo normalmente associado a esta doença. Estudos adicionais sobre a caracterização do metabolismo do Fe periférico tanto a nível fenotípico como genético poderão ser essenciais para o estabelecimento de um diagnóstico mais precoce e menos invasivo para esta doença.
- Molecular targeting of proteins by homocysteine: implications in familial and clinical hypercholesterolemiaPublication . Marques Lemos, Ana Rita; Pereira, Sofia; Bourbon, Mafalda[PT] As doenças cardiovasculares (DCVs) são uma das principais causas de morte mundialmente e um dos factores que esta na sua origem e a hipercolesterolémia. A hipercolesterolémia pode ter uma base genética (hipercolesterolémia familiar, HF) e não genética (hipercolesterolémia clinica, HC), sendo a primeira muito mais severa, originando aterosclerose prematura. Se por um lado a função patofisiológica da homocisteína (Hcy) na DCV e ainda controversa, por outro, a S e N-homocisteinilacão de proteínas oferece um novo paradigma a ser considerado na patogénese vascular da hipercolesterolémia. Neste sentido, o presente estudo ambiciona revelar novos conceitos sobre a ligação de Hcy a proteínas, na HC e HF. Foram incluídos no estudo 187 indivíduos: 65 normolipidémicos e 122 hipercolesterolémicos. As fraccões de Hcy total (tHcy) e livre (fHcy) foram quantificadas em amostras de soro apos validação de um método de HPLC-FD, para avaliar a S-homocisteinilacão. A actividade de lactonase (LACase) da enzima paraoxonase-1 (PON1) foi quantificada por um ensaio colorimétrico para avaliar a N-homocisteinilacão. Os níveis de tHcy não diferem entre grupos. Não obstante, a fraccão fHcy diminui nos grupos hipercolesterolémicos, com maior evidencia para a população HF. Consequentemente, parece haver um aumento de S-homocisteinilacão, independentemente da terapia de redução lipídica (TRL). Também a actividade LACase e mais baixa neste grupo, mesmo com TRL, por isso, o risco de Nhomocisteinilacão parece ser maior. Alem disso, a diminuição dos rácios LACase/ApoA1 e LACase/HDL na população HF mostra que a lipoproteína de alta densidade (HDL) esta disfuncional nesta população apesar da concentração ser normal. Os resultados suportam a hipótese de que a função patofisiológica da Hcy na Hipercolesterolemia pode residir na sua capacidade de fazer modificações pos-traducionais em proteínas. Este fenómeno e particularmente evidente na condição de HF. No futuro será interessante identificar quais as proteínas-alvo envolvidas na progressão da patologia vascular. ABSTRACT - Cardiovascular diseases (CVDs) are one of the leading causes of death and disability worldwide and one of its underlying causes is hypercholesterolemia. Hypercholesterolemia can have genetic (familial hypercholesterolemia, FH) and non-genetic causes (clinical hypercholesterolemia, CH), the first much more severe, with occurrence of premature atherosclerosis. While the pathophysiological role of homocysteine (Hcy) on CVD is still controversial, molecular targeting of protein by S and N-homocysteinylation offers a new paradigm to be considered in the vascular pathogenesis of hypercholesterolemia. On this regard, the present study aims to give new insights on protein targeting by Hcy in both CH and FH conditions. A total of 187 subjects were included: 65 normolipidemic and 122 hypercholesterolemic. Total (tHcy) and free (fHcy) fractions were quantified in serum samples after validation of an HPLCFD method, to assess S-homocysteinylation. Also, the lactonase (LACase) activity of paraoxonase-1 (PON1) was quantified by a colorimetric assay, as a surrogate of N-homocysteinylation. tHcy does not differ among groups. Nevertheless, fHcy declines in the hypercholesterolemic groups, with more evidence to the FH population. Consequently, there seems to be an increase of Shomocysteinylation, regardless of lipid lowering therapy (LLT). Also, despite of LLT use, LACase activity is lower in FH, thus the risk for protein N-homocysteinylation seems to be higher. Moreover, the decrease in LACase/ApoA1 and LACase/HDL ratios in FH, shows that HDL is dysfunctional in this population, despite its normal concentration values. Data supports that the pathophysiological role of Hcy on hypercholesterolemia may reside in its ability to post-translationally modify proteins. This role is particularly evident in FH condition. In the future, it will be interesting to identify which target proteins are modified and thus involved in vascular pathology progression. Cardiovascular diseases (CVDs) are one of the leading causes of death and disability worldwide and one of its underlying causes is hypercholesterolemia. Hypercholesterolemia can have genetic (familial hypercholesterolemia, FH) and non-genetic causes (clinical hypercholesterolemia, CH), the first much more severe, with occurrence of premature atherosclerosis. While the pathophysiological role of homocysteine (Hcy) on CVD is still controversial, molecular targeting of protein by S and N-homocysteinylation offers a new paradigm to be considered in the vascular pathogenesis of hypercholesterolemia. On this regard, the present study aims to give new insights on protein targeting by Hcy in both CH and FH conditions. A total of 187 subjects were included: 65 normolipidemic and 122 hypercholesterolemic. Total (tHcy) and free (fHcy) fractions were quantified in serum samples after validation of an HPLCFD method, to assess S-homocysteinylation. Also, the lactonase (LACase) activity of paraoxonase-1 (PON1) was quantified by a colorimetric assay, as a surrogate of N-homocysteinylation. tHcy does not differ among groups. Nevertheless, fHcy declines in the hypercholesterolemic groups, with more evidence to the FH population. Consequently, there seems to be an increase of Shomocysteinylation, regardless of lipid lowering therapy (LLT). Also, despite of LLT use, LACase activity is lower in FH, thus the risk for protein N-homocysteinylation seems to be higher. Moreover, the decrease in LACase/ApoA1 and LACase/HDL ratios in FH, shows that HDL is dysfunctional in this population, despite its normal concentration values. Data supports that the pathophysiological role of Hcy on hypercholesterolemia may reside in its ability to post-translationally modify proteins. This role is particularly evident in FH condition. In the future, it will be interesting to identify which target proteins are modified and thus involved in vascular pathology progression.
- Molecular diagnosis of familial hypercholesterolemia and functional characterization of missense variants in the LDLR genePublication . Valentim de Azevedo, Sílvia; Bourbon, Mafalda[PT] A Hipercholesterolemia Familiar (FH) é uma patologia genética que é transmitida de forma autossómica dominante e é caracterizada por elevados níveis de colesterol no plasma desde o nascimento. A FH ocorre devido a variantes funcionais num dos genes codificantes de três proteínas: recetor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLR), apolipoproteína B-100 (APOB) ou pró-proteína convertase subtilisina quexina tipo 9 (PCSK9). O LDLR é uma glicoproteína membranar que liga e internaliza colesterol associado às lipoproteínas de baixa densidade (LDL), que constituem o principal transportador de colesterol no sangue. Variantes no gene LDLR podem resultar num catabolismo deficiente das LDL, tendo como consequência o aumento do colesterol no plasma, que se acumula nos tendões e artérias. Esta acumulação pode levar ao desenvolvimento prematuro de aterosclerose e doença cardiovascular. A FH apresenta duas formas clínicas: a forma heterozigótica, que apresenta um fenótipo menos agressivo, com valores de colesterol total entre 290 e 500 mg/dl (com LDL>190 mg/dl); e a forma homozigótica, que apresenta um fenótipo mais agressivo, com valores de colesterol total entre 600 mg/dl e 1000 mg/dl. Estima-se que as prevalências das formas heterozigótica e homozigótica sejam de 1/500 e de 1/1000000 indivíduos, respetivamente. Sabe-se ainda que mais de 90% dos casos identificados apresentam uma variante no LDLR, fazendo deste gene o mais associado a esta doença. Apesar de haver mais de 1600 variantes do LDLR reportadas em bases de dados, para a maior parte delas não existe registo de estudos funcionais que provem a sua patogenicidade, levando a que não seja possível atribuir um diagnóstico molecular definitivo a estes casos. Assim sendo, a necessidade de avaliar funcionalmente estas variantes, de modo a perceber em que medida afetam a função do recetor, também se torna imperativa. Tendo em conta as prevalências acima referidas, estima-se que em Portugal existam cerca de 20000 casos de FH. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF), implementado em 1999 no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, tem como objectivo a determinação da prevalência e distribuição desta patologia em Portugal. A população em estudo é constituída por indivíduos de ambos os sexos e todas as idades, desde que cumpram com os critérios para o diagnóstico clínico de FH. O diagnóstico clínico de FH é feito, em Portugal, de acordo com os critérios clínicos adaptados de “Simon Broome Heart Research Trust” e idealmente deverá ser realizado o estudo genético, com a identificação da variante, pois só desta forma é possível confirmar o diagnóstico clínico. A realização de estudos funcionais para determinar o efeito de variantes identificadas na função da proteína é também de elevada importância, podendo contribuir para uma terapêutica mais personalizada. O EPHF está dividido em duas partes: o estudo bioquímico e o estudo molecular. Este último está sub-dividido em cinco fases. A fase I compreende a extração de DNA, o estudo do promotor, todos os exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como das variantes mais comuns nos exões 26 e 29 da APOB. A fase II consiste no estudo de grandes rearranjos por Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). A fase III consiste no estudo do PCSK9 e a fase IV no estudo de todo o gene da APOB. A V e última fase consiste na realização de estudos funcionais in vitro para variantes cuja patogenicidade ainda é desconhecida. Assim sendo, este projeto está dividido em duas partes, que compreendem três das cinco fases do EPHF, nomeadamente as fases I, II e V. A primeira parte consistiu na realização do estudo molecular em participantes do EPHF, estudando o promotor e os 18 exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como o estudo de parte dos exões 26 e 29 da APOB por Polymerase Chain Reaction (PCR) e sequenciação de Sanger. De seguida, procedeu-se à pesquisa de grandes rearranjos por MLPA. Uma predição, utilizando as ferramentas in silico, foi também realizada, de modo a prever o impacto das alterações encontradas ao nível da proteína. Esta predição foi realizada tanto para alterações identificadas ao nível do exão, com as ferramentas Polymorphism Phenotyping (PolyPhen-2), Sorting Tolerant From Intolerant (SIFT) e Mutationtaster, como para as alterações identificadas ao nível do intrão, de modo a prever efeitos no splicing, com as ferramentas Human Splicing Finder (HSF), the Splice Site Prediction by Neutral Network (NNSSP) e FSPLICE. A segunda parte deste projeto consistiu então no estudo funcional das 10 variantes do LDLR mais comuns na população portuguesa, até à data sem estudos funcionais. As diferentes variantes do LDLR foram obtidas por mutagénese dirigida num plasmídeo pcDNA3_LDLR sob o controlo do promotor viral SV40. Toda a região de interesse foi confirmada por sequenciação de Sanger e foi feita uma reclonagem, em que o gene LDLR, já com a variante, foi transferido para um vetor limpo. Células CHO-ldlA7, que não expressam endogenamente o recetor, foram transfetadas com os diferentes plasmídeos. A expressão do recetor foi avaliada através da deteção com anticorpos; a ligação e a internalização foram avaliados através do uso de LDL fluorescentemente marcada com FITC. O impacto de todas as variantes ao nível da expressão, ligação e internalização foi analisado por citometria de fluxo. Em 25 casos índex estudados, 11 variantes foram identificadas em 12 doentes, embora duas destas sejam provavelmente benignas. A variante patogénica mais frequentemente encontrada na APOB foi identificada em apenas 2 doentes. De entre as alterações encontradas no LDLR (10), 2 foram aqui primeiramente reportadas e 8 já tinham sido anteriormente identificadas. De entre estas últimas, 7 já apresentavam estudos funcionais comprovando a sua patogenicidade. Aquando da pesquisa por grandes rearranjos nestes doentes por MLPA, nenhuma alteração deste tipo foi identificada no grupo em estudo. O estudo funcional das dez alterações mais frequentemente identificadas no decorrer do EPHF, até à data sem estudos funcionais que comprovem o impacto na função do recetor, revelou que, de entre as 10 variantes estudadas, 7 são patogénicas, afetando de alguma forma a função do LDLR. A variante c.1802A>T p.(Asp601Val) é patogénica, fazedo com que não haja sequer LDLR à superfície celular. Como não atinge a membrana (por não ser expressa ou por não se ancorar a esta) apresenta valores de ligação e de internalização igualmente baixos. As variantes c.1876G>A p.(Glu626Lys), c.631C>G p.(His211Asp), c.661G>T p.(Asp221Tyr), c.618_638del p.(Gly207_Ser213del) e c.551G>A p.(Cys184Tyr) apresentaram uma expressão normal. No entanto, foram observáveis valores muito reduzidos para a fluorescência associada à união das LDL nestes casos. Consequentemente, a internalização também é defetiva, parecendo lógico classificar estas variantes como patogénicas. A variante c.1775G>A p.(Gly592Glu) resulta num defeito, possivelmente, ao nível da reciclagem do recetor, sendo também considerada patogénica. Por outro lado, as variantes c.1816G>T p.(Ala606Ser), c.1966C>A p.(His656Asn) e c.2177C>T p.(Thr726Ile) parecem não revelar qualquer impacto no LDLR, sugerindo a sua neutralidade, pois obtiveram-se valores de fluorescência, associados à expressão e atividades de ligação e internalização, comparáveis ao wt. Estes resultados sugerem que os doentes portadores destas variantes devem apresentar outra justificação para o seu fenótipo hipercolesterolémico. A análise destas variantes através de ferramentas de predição in silico, realizada para todas as variantes identificadas no decorrer deste projeto, permitiu concluir que estas predições nem sempre vão de encontro ao determinado através da realização de estudos funcionais. Assim sendo, estes programas deverão ser usados, mas com a devida ressalva de que são apenas preditores. A FH é uma doença para a qual, felizmente, existe um diagnóstico definitivo (genético) e variados tratamentos farmacológicos. Apesar de ser uma doença subdiagnosticada, estão a ser realizadas diversas iniciativas para que haja uma maior divulgação da doença, nomeadamente dos benefícios do diagnóstico precoce. No âmbito da EPHF tem-se feito um esforço para que seja implementado o diagnóstico molecular como diagnóstico preferencial, juntamente com a execução de estudos funcionais para determinar a patogenicidade de variantes desconhecidas. Só assim os doentes têm a possibilidade de ter um diagnóstico definitivo para a sua patologia tornado possível instituir medidas preventivas com uma terapêutica dirigida e personalizada, melhorando o prognóstico destes doentes.
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