DPSPDNT - Dissertações de mestrado
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- Prediction of Genes Associated With Autism Spectrum Disorder Using Sequence and Graph Embedding MethodsPublication . Inácio, João Pedro da Silva; Martiniano, Hugo; Vicente, AstridNeurodevelopmental disorders impose a significant social and economic burden on individuals with these conditions and their families. Given that all neurodevelopmental disorders have a genetic component, identifying the risk genes for these disorders enhances our understanding of their etiology and can aid in the development of future screening methods and targeted therapies. Autism Spectrum Disorder (ASD) is a prototypical complex neurodevelopmental disorder characterized by high heritability and a heterogeneous genetic architecture and phenotypic presentation. This thesis presents a Machine Learning (ML) approach that improves upon state-of-the-art methods for ASD risk gene prediction, this thesis presents a Machine Learning (ML) approach capable of improving state-of-the-art methods for ASD risk gene prediction. To achieve this goal, a novel approach is created using publicly available ASD-associated genes and graph and sequence gene embeddings with supervised ML classifiers. Using a 5-fold nested stratified cross-validation, the pipeline achieved an AUC of 0.90, F1 of 0.82, and MCC of 0.77. Additionally, the top decile of the ranked list of predicted risk genes generated by the model was significantly enriched for ASD phenotypes but not other brain-specific disorders. The proposed pipeline improved state-of-the-art approaches in predicting genes targeted by LOF mutations in the MSSNG and SCC studies. A functional network characterization of the top decile identified four distinct communities significantly enriched for biological pathways associated with ASD. Of the 50 top predicted genes by the pipeline, 37 were already present in ASD risk gene databases, while 13 were not yet linked to ASD. The 13 genes were significantly enriched in the cerebral cortex, and the telencephalon cell migration processes critical for brain development and linked to neurodevelopmental disorders. This thesis provides an accurate comparison of embedding methods for risk gene discovery and improves existing ASD risk gene predictions, taking a step closer to a better understanding of this complex genetic disorder.
- Estudos Funcionais de Variantes no Gene APOB em Doentes com Diagnóstico Clínico de Hipercolesterolemia FamiliarPublication . Ramos, Diana Catarina Fernandes; Bourbon, Mafalda; Alves, Ana CatarinaA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma doença caracterizada por níveis elevados de colesterol LDL, que se acumulam nas artérias, promovendo o desenvolvimento precoce de eventos cardiovasculares. Geneticamente, a FH é transmitida de forma autossómica semi-dominante, sendo causada por variantes nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As variantes no gene APOB afetam a ligação do colesterol LDL ao seu recetor, representando 5 a 10% dos casos de FH. No entanto, para a maioria das variantes identificadas, o efeito funcional na proteína ainda não está determinado. Esta dissertação teve como objetivo principal investigar a correlação entre fenótipo e genótipo, além de caracterizar funcionalmente variantes identificadas no gene APOB em indivíduos com diagnóstico clínico de FH na população portuguesa. Como objetivo secundário, foi desenvolvida uma base de dados que reúne todas as variantes deste gene com estudos funcionais realizados até ao momento. A identificação das variantes foi realizada por sequenciação de nova geração (NGS) e confirmada por PCR e sequenciação de Sanger, seguida da pesquisa da variante nos familiares dos casos index. As variantes em estudo foram identificadas no âmbito do projeto EPHF. O LDL dos participantes foi isolado por ultracentrifugação a partir do soro de casos index e familiares com variantes no gene APOB, bem como de indivíduos normolipidémicos. Este LDL foi marcado com fluorescência e incubado em células CHO-ldlΔ7 para avaliar a capacidade de ligação e internalização do LDL. A caracterização funcional, realizada por citometria de fluxo com LDL fluorescente, revelou que as variantes p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu) e p.(Arg4519Thr) apresentavam ligação e internalização normais do LDL, indicando que estas variantes não comprometem a função da proteína. Este trabalho destaca a importância de caracterizar funcionalmente as variantes no gene APOB para melhorar o diagnóstico dos indivíduos com FH, possibilitando tratamentos mais adequados a cada caso e contribuindo para a redução do risco cardiovascular.
- APOB Variants Spectrum and Functional Characterization in Portuguese Patients with Familial Hypercholesterolaemia PhenotypePublication . Ferreira, Maria Rafael Simões do Carmo; Alves, Ana Catarina; Rebelo, Maria TeresaFamilial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal semi dominant disorder of lipid metabolism clinically characterized by increased levels of circulating LDL cholesterol and associated with elevated cardiovascular risk. The genetic diagnosis is usually based on the analysis of LDLR, APOB, and PCSK9 genes. APOB variants are responsible for 5-10% of FH cases, and the variant spectrum of APOB has increased due to sequencing of the whole gene through Next Generation Sequencing, consequently increasing the number of variants that need to be functionally assessed. This dissertation aimed to verify the correlation between phenotype and genotype in individuals from the Portuguese FH Study, as well as create a database including all APOB variants found up to date in this study. Moreover, it was intended to characterize two APOB variants identified in subjects from this cohort. Graphics regarding LDL cholesterol levels were designed for index cases FH positive and negative and relatives FH positive. The variants previously detected by NGS were confirmed by PCR and Sanger sequencing, and cascade screening was carried out in families. All APOB variants with MAF <1% were gathered into a database. LDL from index cases and relatives was separated using sequential ultracentrifugation and labelled with FITC for uptake assessment by flow cytometry in CHO-ldlA7 cells, and proliferation assays were performed with U937 cells. A definite diagnosis was possible for 4 individuals carrying known pathogenic variants, and c.6639_6641del/p.(Asp2213del) and c.10121T>C/p.(Ile3374Thr) alterations from exon 26 were functionally assessed. In vitro studies showed a neutral effect on the apoB function for these variants. Furthermore, 143 different variants were discovered located throughout the whole gene, of which more than 90% were variants of uncertain significance. Functional studies, combined with the association between phenotype and genotype, allow a better and more personalized treatment according to the needs of each individual.
- Health inequalities in cerebro and cardiovascular health – an analysis of the e_COR studyPublication . Afonso dos Santos, Carolina Sofia; Antunes, Marília Cristina de Sousa; Alves, Ana CatarinaAccording to the World Health Organization (WHO), health inequalities are systematic differences in the health status of different population groups with significant social and economic costs for individuals and societies. These differences are unfair and can be mitigated through the action of government policies, so it is necessary to understand their impact. Cardiovascular diseases (CVD) are a group of disorders of the brain, heart and blood vessels and include coronary heart disease, cerebro-cardiovascular disease, rheumatic heart disease and other conditions. More than four out of five CVD deaths are due to heart attacks and strokes, and one third of these deaths occur prematurely in people under 70 years of age (WHO). The events of interest considered in this work were stroke, acute myocardial infarction, and peripheral arterial disease. In Portugal in 2019, strokes were the number one cause of death representing 9.8% of the total mortality and the deaths by myocardial infarction represented 3.8% of the total mortality, according to INE. It is estimated that about 10 670 potential years of life were lost due to cerebro-cardiovascular diseases in Portugal in 2019. In addition to being interesting for being very prevalent across Europe, cerebrovascular diseases are impacted by the lifestyle and behavior of individuals. Several studies have concluded that a substantial part of the risk of developing cerebro-cardiovascular disease can be reduced through personal choices and preventive approaches, such as adapting healthy lifestyles. An individual’s socioeconomic position has a potential effect on their health status and also on the health care they receive, which means that socioeconomic inequalities are determinants of health. The European Deprivation Index (EDI) is a way of quantifying the level of deprivation of individuals and, therefore, the version adapted to the Portuguese reality, developed in 2016 by a multinational and multidisciplinary team of researchers, was incorporated in this work. The main objective of this work is to evaluate the effect of health inequalities, namely those associated with low education and levels of deprivation in cerebro-cardiovascular disease. To achieve this objective, the main set of data used resulted from the e_COR study, developed by the Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, between 2012 and 2014, within the scope of cardiovascular prevention and with the objective of estimating the prevalence of cardiovascular risk factors. In the present work, the past occurrence of at least one cerebro-cardiovascular event and the number of risk factors that each of the participants in the e_COR study had were studied. The variables under study are some of the variables collected during the e_COR study, referring to demographic, physical, metabolic, medical history, and lifestyle characteristics of the participants. Some other variables were collected such as variables that characterize access to healthcare, extracted from INE, and variables related to socioeconomic status, that resulted from the EDI adapted to the Portuguese context. To model the occurrence of a cerebro-cardiovascular event, the logistic regression method was used, as it suits the binary nature of the response variable. Before modeling the data, possible correlations between the variables under study were evaluated. The variables that were included in the Generalized Linear Model were selected through the Stepwise Selection process, considering an inclusion p-value of 0.20 and an exclusion p-value of 0.25. The confounding variables, sex and age, were the first to be introduced in the model and, regardless of their p-value, they always remained in the model. After the Stepwise process, variables related to levels of education and deprivation were introduced. The random effect of the region of residence was added to the final model. Since there was a large imbalance between cases and non-cases of cerebro-cardiovascular disease, the SMOTE technique was used to create a more balanced dataset and the same modeling process was applied. For the validation of the models obtained, the ROC curve with the respective AUC was calculated and cross validation was also performed. Poisson regression was used to model the number of risk factors, since it is one of the methods indicated when the response variable is a count variable. In this model, once again, confounding variables, sex and age were included, as well as the variables related to inequalities, education levels and deprivation levels. Multiple comparisons were performed to assess how variables associated with inequalities affect the number of risk factors that each individual has. The recorded cerebro-cardiovascular events that occurred happened in the past and the risk factors that individuals have are in the present, so the interpretation of the models is not the most conventional and some of the variables would have different values if they had been evaluated before the event occurred. Both logistic regression models suggest that in the presence of two individuals with similar physical and biological characteristics, the influence of their levels of education or deprivation is not significant, and these are not good indicators to distinguish individuals who have already suffered a cerebro-cardiovascular event from those who have not. The random effect of the region is also not statistically significant. Since the event has already occurred, this model is useful mainly to distinguish individuals who have already suffered the event from those who have not suffered, through their characteristics. The Poisson regression model suggests that an individual's education levels affect the number of risk factors that an individual has, i.e., it was found that individuals with more advanced education had a lower number of risk factors.
- Molecular diagnosis of Maturity Onset Diabetes of the Young: a case for personalized medicinePublication . Poejo, Daniela Mendes; Bourbon, MafaldaRESUMO: A diabetes mellitus, ou apenas diabetes, como é usualmente conhecida, é um dos fatores de maior risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Esta patologia é caracterizada por um conjunto de alterações metabólicas causadas pela deficiência na secreção da hormona insulina. A resposta ineficaz da insulina conduz a um estado de hiperglicemia permanente desencadeada pelo aumento dos níveis de glicose no sangue. Apesar da diabetes mellitus tipo 1 e a diabetes mellitus tipo 2 serem as mais frequentes e consequentemente mais estudadas, existem vários tipos de diabetes mellitus que diferem tanto nas características clínicas como na sua fisiopatologia. Desde modo, é essencial considerar as formas mais raras de diabetes adequando o tipo de intervenção terapêutica de acordo com as características específicas do tipo de diabetes e do paciente. A diabetes tipo MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) é uma forma monogénica de diabetes descrita pela primeira vez em 1974 por Tattersall. A diabetes tipo MODY é uma doença de origem genética de padrão de hereditariedade autossómico dominante que provoca alterações no normal funcionamento nas células responsáveis pela produção de insulina, as células beta do pâncreas. O aparecimento deste tipo de diabetes costuma manifestar-se em crianças e jovens antes dos 25 anos, em indivíduos não-insulino dependentes e sem sinais de insulinorresistência. Apesar de apresentar tanto características clínicas como base genética díspares, pacientes com diabetes tipo MODY são muitas vezes erradamente diagnosticados com diabetes tipo 1 ou diabetes tipo 2. Além disso, a diabetes tipo MODY apresenta uma elevada heterogeneidade fenotípica e genotípica fazendo com que o teste genético seja extremamente relevante tanto para a otimização do tratamento como para a prevenção de possíveis complicações de saúde associadas a diabetes. Atualmente, sabe-se que alterações genéticas em 1 dos 14 genes associados à MODY podem ser causa patogénica da diabetes deste tipo. Mutações heterozigóticas nos genes GCK, HNF1A, HNF4A e HNF1B são as causas mais comuns encontradas em pacientes com diabetes tipo MODY. Localizado no cromossoma 7 (7p13), o gene GCK codifica a enzima glucocinase (GCK – glucokinase) que desempenha um papel fundamental na primeira fase dos processos metabólicos da glicose. As isoformas desta enzima monomérica estão presentes no fígado e células beta do pâncreas. Nestas últimas, atuam como um sensor do nível de glicose induzindo a secreção de insulina. Quando ocorrem alterações patogénicas neste gene a atividade enzimática da GCK fica comprometida. A diminuição da atividade da GCK afeta diretamente a normal secreção de insulina, aumentando a concentração mínima de glicose no sangue necessária para a estimulação da libertação de insulina. Assim, indivíduos com diabetes tipo MODY, subtipo GCK apresentam hiperglicemia moderada desde a nascença, podendo ser em muitos casos assintomáticos. O gene HNF1A está localizado no cromossoma 12 (12q24.31), codifica um fator de transcrição hepatocyte nuclear factor 1 alpha pertencente a um grupo de fatores de transcrição hepáticos que estão associados ao aparecimento a longo prazo de complicações de saúde derivadas da diabetes. Este fator de transcrição possui três isoformas A, B e C que estão distribuídas diferencialmente em vários orgãos, como fígado, rim e pâncreas. O seu perfil de expressão difere consoante o órgão e o estado de desenvolvimento do mesmo. Enquanto a isoforma A está presente em fases iniciais de desenvolvimento do pâncreas fetal, a isoforma B é predominante no pâncreas maturo. Além disso, sabe-se que HNF1A regula a proliferação e morte celular das células beta tendo um papel crucial na expressão de insulina.Variantes genéticas neste gene levam a uma desregulação na proliferação das células beta desencadeando uma deficiência progressiva na secreção de insulina. Os níveis de insulina endógena de pacientes com este II subtipo HNF1A de diabetes tipo MODY tendem a diminuir ao longo da vida. Desde modo, estes pacientes necessitam de um tratamento contínuo que deverá ser periodicamente ajustado. À semelhança do anterior, o gene HNF1B pertence ao mesmo grupo fatores de transcrição. Está localizado no cromossoma 17 (17q12) e codifica para o fator de transcrição hepatocyte nuclear factor 1 beta. O gene HNF1B é expresso em inúmeros tecidos como é o caso do timo, pulmão, estômago, intestino, fígado, rim, pâncreas e trato genital. Destacando a sua função em fase prematura do desenvolvimento das estruturas dos tecidos. De facto, HNF1B desempenha um papel essencial no desenvolvimento embrionário de vários órgãos, como é o caso do pâncreas e do rim. Alterações patogénicas no gene HNF1B são caracterizadas pela disfunção de células beta combinada com um uma diminuição da sensibilidade à insulina. Adicionalmente, é bastante comum em paciente com este subtipo de MODY o desenvolvimento de disfunções renais e complicações cardiovasculares. Assim, pacientes com este subtipo de diabetes tipo MODY precisam de um controlo glicémico adequado para prevenir e ou atenuar os problemas de saúde associados, onde a administração de insulina é frequentemente utilizada. Neste estudo participaram dezanove indivíduos previamente selecionados com características clínicas que permitissem suspeitar de diabetes tipo MODY. As informações clínicas foram recolhidas através de um questionário enviado por uma médica da Associação Protetora dos Diabéticos de Portugal (APDP), que indicou estes pacientes para o estudo molecular de diabetes tipo MODY que decorre no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. O DNA de cada participante foi extraído a partir das amostras de sangue colhidas aos participantes. Posteriormente os genes GCK, HNF1A e HNF1B foram amplificados por PCR e estudados utilizando o método de sequenciação de Sanger. Foram utilizadas ferramentas bioinformáticas para o alinhamento e análise de variantes nos cromatogramas obtidos. Por fim, as variantes encontradas foram classificadas segundo os critérios da American College of Medical Genetics and Genomics. Como resultado da sequenciação de Sanger foram detetadas no total dezasseis variantes com distribuição não uniforme ao longo de dois genes estudados: três variantes no gene GCK e treze variantes no gene HNF1A. Sete destas variantes foram classificadas como de significado incerto. O número de doentes não relacionados com a variante, o tipo de variante e sua localização, a prevalência da variante em populações controlo, a co segregação da variante com o fenótipo na família e os fenótipos apresentados pelos participantes são algumas das evidências que permitiram interpretar e classificar estas variantes. Infelizmente, devido à falta de informação disponível, não foi possível atribuir uma classificação definitiva a estas 7 variantes. Assim, estas variantes foram classificadas como de significado incerto até que seja possível obter mais dados que suportem a revisão da sua interpretação. Em resumo, foram encontradas sete variantes em sete participantes classificadas como variante de significado incerto e nos restantes doze indivíduos em estudo as variantes encontradas foram classificadas como benignas não estando associadas à patologia. É necessário continuar o estudo dos outros genes associados a MODY e aumentar a evidência sobre as variantes encontradas de forma a que estes doentes tenham um diagnóstico definitivo. Este estudo realça a importância da implementação do teste genético em pacientes diabéticos com fenótipo de MODY. Da mesma forma, o investimento na investigação de diabetes tipo MODY é essencial para a melhor interpretação e classificação de variantes. O correto diagnóstico e a identificação genotípica de indivíduos com diabetes tipo MODY permite melhor adequar as opções terapêuticas. A personalização do tratamento de acordo com as características genéticas de cada subtipo pode ser um enorme avanço na melhoria do controlo glicémico e na prevenção de outras complicações de saúde tendo grande impacto na qualidade de vida dos pacientes e famílias. III
- Prevalence of Thrombogenic Risk Factors in the Portuguese population and Identification of High-risk Individuals in PortugalPublication . Gomes dos Santos, Micaela Patrícia; Alves, Ana Catarina; Rivera, Isabel AntolinIntrodução: A trombose é uma patologia comum e complexa, referente à formação de um coágulo que dificulta o normal fluxo sanguíneo. Sob condições normais, os mecanismos procoagulantes, anticoagulantes e fibrinolíticos regulam a hemostasia para evitar a formação patológica destes coágulos. No entanto, alterações nos genes de proteínas envolvidas direta ou indiretamente na regulação hemostática podem levar a um aumento anómalo da coagulação e a uma maior predisposição da formação de coágulos obstrutivos. Esta condição é conhecida como trombofília e descreve um estado de hipercoagulabilidade responsável pelo desenvolvimento de eventos trombóticos que comprometem a vida (como o enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral e embolia pulmonar) e que geralmente se desenvolvem na presença de um ou mais fatores de risco herdados (variantes genéticas) e ambientais (adquiridos). A trombose tem, portanto, uma origem multifatorial causada pela interação destes fatores de risco herdados e/ou outros adquiridos (tabagismo, gravidez, uso de contracetivos orais e terapia hormonal), que podem coexistir no mesmo indivíduo e conferir um risco contínuo ao longo da vida. Devido ao seu estado adquirido de hipercoagulabilidade, as grávidas apresentam ainda um risco acrescido à manifestação de tromboses, traduzido pela ocorrência de abortos espontâneos recorrentes. Através da eliminação de fatores de risco adquiridos é possível prevenir (até certo ponto) o desenvolvimento de trombose. É assim importante conhecer o perfil genético da população de forma a reunir dados que permitam a identificação de indivíduos de alto risco e antecipar a ocorrência destes eventos, bem como desenvolver medidas preventivas dirigidas aos mesmos. Os objetivos deste projeto são então estimar a prevalência das variantes trombogénicas FV G1691A (FV Leiden), FII G20210A, AT Cambridge II, PAI-1 4G/5G, MTHFR C677T e MTHFR A1298C na população portuguesa, estabelecer associações entre a presença destas variantes genéticas e outros fatores de risco adquiridos no desenvolvimento de eventos trombóticos e identificar grupos de indivíduos de alto risco em Portugal. Introduction: Thrombosis is a pathology in which a blood clot (thrombus) hampers the normal blood flow to a tissue. Under normal conditions, procoagulant, anticoagulant and fibrinolytic pathways regulate hemostasis to avoid pathological clot formation. However, changes in the genes encoding proteins, directly or indirectly involved in hemostatic regulation, can lead to enhanced abnormal blood coagulation, resulting in an increased disposition to the formation of obstructive clots, known as thrombophilia. This state of hypercoagulability is responsible for the development of life-threatening thromboembolic events (like myocardial infarction, ischemic stroke and pulmonary embolism), which usually develop when one or more of both genetic (inherited) and environmental (acquired) risk factors come into play. Pregnant women are also at major risk to manifest thrombosis by recurrent spontaneous abortion episodes. Thus, thrombosis results from the interplay of inherited DNA changes and/or acquired risk factors (cigarette smoking, pregnancy and oral contraceptive or hormone therapy use) that may coexist in the same individual; however, it is preventable. Hence, it is important to recognize the genetic thrombogenic profile of the population to assemble data for identification of high-risk individuals and to develop local guidelines for prevention. With this in mind, this project aims to estimate the prevalence of the FV G1691A (FV Leiden), FII G20210A, AT Cambridge II, PAI-1 4G/5G and MTHFR C677T and A1298C thrombogenic variants in the Portuguese population, to establish associations between the presence of these genetic variants and the presence of other increasing risk factors in the development of thrombotic-related events and to identify groups of high-risk individuals in Portugal.
- Estrogen Receptor mediated pathway in schistosomiasis mansoni induced infertilityPublication . Gonçalves Ribeiro, Ana Rita; Botelho, Mónica; Fernandes, RúbenIntrodução: A schistosomose é considerada a segunda doença parasitária mais devastadora, a seguir a malária, no mundo. Os ovos do schistosoma produzem catecóis-estrógenios. Essas moléculas são metabolizadas em quinonas ativas que causam alterações no DNA. Dado que os estrogénios e os recetores de estrogénios são importantes na reprodução humana, o bloqueio destes recetores por essas quinonas pode afetar a resposta hormonal e, portanto, causar infertilidade. Objetivos: Para se compreender melhor esses mecanismos, avaliamos a presença do recetor de estrogénios a (REa) e do recetor 1 de estrogénio acoplado à proteína G (GPER também conhecido como GPR30) nos órgãos de reprodução de um modelo animal infectado com Schistosoma mansoni através de ensaios histoquímicos e imunohistoquímicos. Métodos: Na análise histoquímica, foi realizada a coloração com hematoxilina e eosina (H&E). Para a análise imunohistoquímica do REa incubamos secções de tecido com o anticorpo primário monoclonal de coelho anti-REa [SP1], pré-diluído e, para o GPER, incubamos com o anticorpo primário policlonal de coelho anti-GPER. O anticorpo secundário usado tanto para o REα como para o GPER o foi o anticorpo IgG-B biotinilado de cabra anti-coelho. Resultados: Existem diferenças histológicas entre os órgãos de ratos infetados e não infetados. A expressão de REa diminui no ovário e aumenta no útero e testículos de ratos infectados com S. mansoni em comparação com os controlos. A expressão de GPER aumenta no ovário e diminui no útero e testículos de ratos infectados com S. mansoni em comparação com os controlos. Abstract - Background: Schistosomiasis is considered the second most devastating parasitic disease after malaria in the world. Schistosome eggs produce catechol-estrogens. These molecules are metabolized to active quinones that cause alterations in DNA. Given that estrogens and estrogen receptors are key players in human reproduction, the blockage of Estrogen Receptors by these catechol estrogen quinones might affect the hormonal response and hence cause infertility. Aims: To better understand these mechanisms, we evaluated the presence of Estrogen receptorα (ERα) and G protein-coupled estrogen receptor 1 (GPER also known as GPR30) in the reproduction organs of an animal model infected with Schistosoma mansoni through histochemical and immunohistochemical assays. Methods: In the histochemical analysis we performed the hematoxylin and eosin (H&E) staining. For the immunohistochemical analysis of GPER we incubated the tissue sections with primary rabbit polyclonal with GPER antibody and for the ERα we incubated with primary rabbit monoclonal [SP1] to ERα, pre-diluted. The secondary antibody was the biotinylated goat anti-rabbit antibody IgG-B and was used for both ERα and GPER. Results: There are some histhological differences between infected and non-infected organs from the mice model. ERa expression is decreased in the ovary and increased in the uterus and testes of S. mansoni infected mice compared to controls. GPER expression is increased in the ovary and decreased in the uterus and testes of S. mansoni infected mice compared to controls.
- Classification methods applied to familial hypercholesterolemia diagnosis in pediatric agePublication . Albuquerque, João David Ferreira de Castro; Antunes, Marília; Bourbon, MafaldaIntroduction: Familial Hypercholesterolemia (FH) is an inherited disorder of lipid metabolism, characterized by increased low density lipoprotein cholesterol (LDLc) levels. The resulting severe dyslipidemia leads to the early development of atherosclerosis, representing a major risk factor for cardiovascular disease (CVD). The early diagnosis of FH is associated with a significant reduction in CVD risk, supporting the introduction of precocious and more aggressive therapeutic measures. There are different clinical criteria available for the diagnosis of FH, although only genetic testing can confirm the diagnostic. Simon Broome (SB) criteria for FH diagnosis are among the most frequently used in clinical setting, and are based on family history, presence of physical signs, and LDLc and total cholesterol (TC) levels. When compared to genetic diagnosis results however, SB criteria present a high false positive rate, which constitutes a heavy burden in terms of healthcare costs, and limits the access to the genetic study of a larger universe of potential FH cases. Aim: The main purpose of this work was to develop alternative classification methods for FH diagnosis, based on different biochemical indicators, with improved ability to screen for FH cases in comparison to SB criteria. Two different models were developed for this purpose: a logistic regression (LR), and a decision tree (DT) model. Methods: Serum concentrations of TC, LDLc, high density lipoprotein cholesterol (HDLc), triglycerides (TG), apolipoproteins AI (apoAI) and B (apoB), and lipoprotein(a) (Lp(a)) were determined, and genetic diagnosis was performed, in a sample of 252 participants in the Portuguese FH Study, at pediatric age (2-17 years). All patients met the clinical criteria for dyslipidemia, and were not under hypolipidemic medication during the evaluation period. LR and DT models were fitted to sample data. For the LR model, two different cutoff points were defined, through receiver operating characteristics (ROC) curve analysis, following Yoden index and minimum p-value (min p) methods. The DT was built based on entropy reduction, or information gain measures. A modified version of the DT method was implemented, consisting in the sequential exclusion of predictor variables as they are introduced in the model. This allows producing a classification rule that uses single cutpoints for biomarkers, simplifying its interpretation. Different operating characteristics (OC) were estimated for all models: accuracy (Acc), sensitivity (Se), specificity (Spe), positive predictive value (PPV ) and negative predictive value (NPV ). These OC were calculated by generating a confusion matrix, considering molecular study results as the true state of the disease. The best performing LR and DT models were compared with SB biochemical criteria for FH diagnosis, through bootstrap resampling techniques. Median and mean values of the OC for 200 bootstrap samples were used for predictive performance comparison. Results: The logit function for the LR final model was expressed as g(π) = -7:083 + 0:086 X LDLc -0:041 X TG - 0:037X apoAI. The best performing DT model included the variables LDLc, TG, apoAI, apoB and HDLc, by descending order of importance. Between the different classification methods, Acc, Spe and PPV were higher in the DT model, followed by the LR model with the cut point value (c) defined by the min p method (c = 0:35). The lower values in these OC are found for SB criteria (p < 0:01). Higher Se and NPV on the other hand, are achieved by SB criteria, and the LR model with the cutpoint value calculated by Youden index (c = 0:17). However, the LR model using this cutpoint achieves significantly higher Acc, Spe and NPV than SB criteria (p < 0:01). Conclusions: Both LR and DT models seem to be a valid alternative to traditional clinical criteria for FH diagnosis. It seems possible to adjust the cutoff value in the LR model for similar Se levels as the ones observed in SB criteria, with significantly less false positive retention. To be validated by additional data, this would undoubtedly indicate this method as preferable between the two, and can have a very important impact in terms of cost-effectiveness. By avoiding the repetition of predictor variables, and providing single cutoff values for each biomarker, the modified DT model assumes a structure that typically resembles medical criteria, and can therefore be easily used in clinical practice. It seems that, in spite using different methodological approaches, both LR and DT models are able to divide the sample according to the most relevant biochemical characteristics for FH diagnosis. According to both classification methods, presence of FH is directly related to LDLc levels, and inversely related to TG and ApoAI concentrations, by this order of importance. The preferred classification model, as well as model specifications, may vary as a function of the OC that are considered more important, and context in which it is applied.
- Exploring environmental factors and gene-environment interactions in Autism Spectrum Disorder: a pilot studyPublication . Lopes, Ana Leonie Correia Barreto; Vicente, Astrid Moura; Dias, Deodália Maria AntunesAutism Spectrum Disorder (ASD) is a pervasive and clinically heterogeneous neurodevelopmental disorder by deficits in social communication and interactions skills, and repetitive and stereotyped behaviours. It has becomes apparent that ASD has a strong genetics component. However, the level of heritability is still debated: compared to older and smaller studies, results from recent studies estimate a lower heritability percentage (83%), thus leaving a meaningful percentage of the risk that could be explained by environmental factors. Exposure to potentially harmful environmental factors can result in neurodevelopmental issues, due to neurotoxicity. Such environmental factors include endocrine disruptive chemicals like BPA, PBDEs, phthalates, PAHs, pesticides, and heavy metals, which disrupts optimal hormonal function, as well as pharmaceutical drugs which are able to cross physiological barriers and come into contact with the fetus. Moreover, the incorrect metabolization of these xenobiotics due to defective enzymatic activity may be linked to an increased risk of ASD. It has been suggested that individuals carrying polymorphisms that hinder the activity of cytochrome p450 enzymes, responsible for phase I metabolism, as well as UDP-glucuronosyltransferases and glutathione S-transferase enzymes responsible for phase II metabolism, will be more susceptible to potentially toxic chemicals. Therefore, considering the role played by environmental factors, this pilot study aims to investigate and contribute to the understanding of gene-environment interactions in ASD. In order to do this, we explored the usage of the Early Life Exposure Assessment Tool (ELEAT): a questionnaire which indirectly examines child’s exposure to exogenous factors that could be related to ASD from 3 months before conception, during pregnancy, to the first year of the child’s life, by analyzing maternal exposure. We aimed to investigate the type of data that could be obtained from this questionnaire, how it could be treated, and ultimately how it could be related to genetic information obtained from probands. The questionnaire was filled by 20 Portuguese mothers who had been part of a previous study. Additionally, we were able to obtain 14 biological samples from the children whose mothers filled out the questionnaire, who were then screened for various functional polymorphisms in genes known to interact with the environmental factors investigated in ELEAT. Finally, we related probands’ genotype to exposure reported in the ELEAT. Our results suggest that mothers were indeed exposed to some of the environmental factors being studied by the ELEAT in these critical periods of neurodevelopment. Additionally, genotyping results showed that this group of probands did carry a number of the polymorphisms being investigated in this pilot study, which could make them more susceptible to certain xenobiotics. When we merged probands’ genotype to reported exposure, we concluded that probands may have been exposed to the chemicals they were sensitive to during neurodevelopment. Most of the variants investigated in this study have not been yet related to ASD, but have the potential to indirectly contribute to the disorder’s onset. Our results demonstrate that meaningful results can be obtained from combining the ELEAT with genetic information. Seeing as the general population is somewhat regularly exposed to some levels of these chemicals, genetic factors play a crucial role in increasing susceptibility and thus leading to negative consequences such as increased ASD risk. This pilot study is an important step for future studies that intend to use the ELEAT to identify environmental risk factors for ASD. These should include a large population sample, and an equal number of controls, in order to obtain statistical power when calculating the multiplicative effect of given environmental exposures with genetic liability. In conclusion, the ELEAT could play a vital role in the understanding of geneenvironment interactions, and the development of preventive strategies for autism.
- Clinical and molecular characterization of Portuguese patients with a clinical diagnosis of MODYPublication . Mafra, João Paulo de Medeiros Gomes de; Bourbon, MafaldaA diabetes mellitus, ou simplesmente diabetes, pode ser definida como um conjunto complexo de perturbações crónicas de cariz metabólico caracterizadas por hiperglicémia. A diabetes tipo MODY, do inglês Maturity-onset diabetes of the young, é uma forma monogénica de diabetes. Inicialmente descrita em 1974 por Tattersall, a diabetes tipo MODY engloba um grupo de fenótipos heterogéneos, clinica e geneticamente, caracterizados por alterações no funcionamento normal das células beta do pâncreas e por um padrão de hereditariedade autossómico dominante. De uma forma geral, a diabetes tipo MODY tem um perfil não-insulino dependente e manifesta-se em crianças e indivíduos jovens, sendo tipicamente diagnosticada antes dos 25 anos. A diabetes tipo MODY aparenta ser rara, estimando-se que seja responsável por 0,6-2% dos casos de diabetes na Europa. No entanto, é frequente esta forma de diabetes ser equivocamente diagnosticada como diabetes tipo 1 ou tipo 2, pelo que a sua prevalência real deverá ser superior. Um dos grandes trunfos no combate a este subdiagnóstico da diabetes tipo MODY são os testes genéticos. Desde a década de 1990, foram 13 os genes associados à MODY. Mutações em heterozigotia nos genes GCK e HNF1A são as causas mais frequentes de diabetes tipo MODY, correspondendo a cerca de 70% dos casos. Logo a seguir estão as mutações em heterozigotia nos genes HNF4A (hepatocyte nuclear factor 4 alpha) e HNF1B, que correspondem a cerca de 15% dos casos. O gene GCK, localizado no cromossoma 7 (7p13), codifica o enzima glicocinase (glucokinase - GCK), também conhecido como hexocinase IV. Este enzima monomérico possui três isoformas - a isoforma 1, presente nas células beta, e as 2 e 3, presentes no fígado - e, no interior das células, atua como um sensor do nível de glicose. Nos hepatócitos, este enzima intervém no desencadear da glicólise e glicogénese, enquanto facilita a exocitose de insulina nas células beta. A diabetes tipo MODY, subtipo GCK, resulta de mutações de perda de função em heterozigotia no gene GCK, diminuindo a atividade do enzima, e caracteriza-se por uma hiperglicémia moderada, assintomática e não progressiva que se manifesta desde o nascimento. Estas mutações acabam por diminuir a quantidade de glicogénio sintetizado e impedem a normal libertação de insulina, ao aumentar a concentração mínima de glicose necessária à sua secreção. O gene HNF1A, localizado no cromossoma 12 (12q24.31), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1 alpha - HNF1A) homodimérico. Este fator de transcrição possui três isoformas, A, B e C. As três estão presentes no fígado, rins, pâncreas e intestinos mas a primeira predomina no fígado, rins e pâncreas fetal, enquanto a isoforma B predomina no pâncreas adulto. O HNF1A integra uma complexa rede de fatores de transcrição, desempenhando um papel regulador na expressão de diversos genes durante o desenvolvimento embrionário. No fígado, o HNF1A regula a expressão de vários genes hepáticos, como o gene que codifica para a albumina. Nas células beta, intervém na expressão de insulina e na proliferação e morte celular. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1A, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1A. Estas mutações podem ter diversos efeitos, reduzindo a secreção de insulina em resposta a glicose e aminoácidos, e alterando a expressão de genes envolvidos no transporte (GLUT2) e metabolismo de glicose, afetando processos como a glicólise, gluconeogénese e derivação de aminoácidos para o ciclo de Krebs. O subtipo HNF1A está associado a defeitos na proliferação das células beta e caracteriza-se por uma incapacidade progressiva na secreção de insulina, que não acompanha o aumento de glicose em circulação, dando origem a uma hiperglicémia mais grave que o subtipo GCK. O gene HNF1B, localizado no cromossoma 17 (17q12), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1beta - HNF1B) que atua como homodímero ou heterodímero, com HNF1A. O gene HNF1B produz três isoformas - 1, 2 e 3 - e é expresso no timo, pulmão, rim, fígado, pâncreas, estômago, intestino e trato genital. Este fator de transcrição, que integra a mesma rede regulatória que HNF1A, actua no desenvolvimento embrionário do pâncreas e do rim. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1B, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1B e em cerca de 50% dos casos caracteriza-se por uma combinação de resistência à insulina e disfunção das células beta, exibindo, à semelhança do subtipo HNF1A, uma incapacidade na secreção de insulina em resposta a concentrações crescentes de glicose. Mutações neste gene podem também resultar em anomalias extra pancreáticas e afetar tecidos como o trato genital ou o fígado, sendo quistos renais o fenómeno mais observado. Neste estudo, foram recolhidas informações clínicas acerca de 39 indivíduos, 24 probandos e 15 familiares, através de questionários enviados por vários médicos de diferentes hospitais portugueses. Com base nestas informações, como glicémia em jejum, prova de tolerância à glicose oral e HbA1c, e no diagnóstico clínico de diabetes tipo MODY, foram-nos referenciados indivíduos com uma história familiar de diabetes que evidencie um padrão hereditário dominante; sem autoanticorpos pancreáticos; com início de sintomas antes dos 25 anos; e índice de massa corporal maioritariamente normal. Estes 24 probandos foram estudados por sequenciação de Sanger para os genes GCK e HNF1A, tendo sido também efetuada a pesquisa de inserções e deleções através da técnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Entre substituições pontuais e pequenas deleções, a sequenciação de Sanger detetou 46 variantes genéticas, 19 no gene GCK e 27 no gene HNF1A. Entre estas, seis podem ser classificadas como patogénicas ou provavelmente patogénicas, sendo quatro no gene GCK e duas no gene HNF1A. As variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas detetadas no gene GCK foram c.364C>T (p.(Leu122Phe)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY; c.579+1_579+33del, uma deleção de 33 pares de base no intrão 5 que elimina um local de splicing e também está associada à diabetes tipo MODY; c.766G>A (p.Glu256Lys), uma alteração missense no exão 7 que induz alterações conformacionais no enzima GCK, reduzindo a sua capacidade de ligação à glicose e subsequente atividade catalítica; e, finalmente, c.1268T>A (p.(Phe423Tyr)), uma alteração missense no exão 10 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY. Estas variantes foram encontradas num total de quatro probandos e cinco familiares. No gene HNF1A, as variantes patogénicas detetadas foram c.814C>T (p.(Arg272Cys)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e impede o fator de transcrição HNF1A de se ligar ao DNA, perdendo assim a sua atividade reguladora na expressão genética; e c.872del (p.(Pro291Glnfs*51)), uma deleção também localizada no exão 4 que provoca uma alteração na grelha de leitura, cosegrega com diabetes e possivelmente resulta de um fenómeno de splippage aquando da replicação de DNA, prevendo-se que resulte numa proteína truncada. Estas variantes foram encontradas num total de três probandos e três familiares. A técnica MLPA foi aplicada na investigação de inserções e deleções em 17 probandos. Três destes probandos geraram resultados sem qualidade, sendo necessárias novas amostras para eventual repetição. Noutros 11 nenhuma inserção ou deleção foi detetada. Nos restantes três probandos foram detetadas duas deleções patogénicas: deleção em heterozigotia dos exões 5 a 8 do gene GCK (c.484-?_1019+?del) num probando; e deleção em heterozigotia do gene HNF1B (c.1-?_1674+?del) em dois probandos. A deleção no gene GCK deverá produzir uma proteína não funcional para gerar o fenótipo MODY, subtipo GCK. No entanto, não foi encontrada qualquer informação sobre esta deleção ou o seu efeito na proteína, pelo que poderemos estar na presença de uma nova mutação. Quanto à deleção do gene HNF1B, estas são frequentes e existem várias fontes que apontam deleções completas do gene como patogénicas, que muitas vezes incluem outros genes na mesma região (17q12). Um dos probandos aparenta não ter história familiar de diabetes e, sendo mutações de novo frequentes, é possível que estejamos na presença de uma. No entanto, não haviam amostras de familiares para fazer estudos de cosegregação nestes dois probandos. A hemizigotia provocada por esta deleção deve resultar em MODY, subtipo HNF1B, por haploinsuficiência. Nenhum destes dois probandos aparenta ter anomalias renais. No total, entre 24 probandos, este estudo identificou 10 indivíduos com MODY, cinco do subtipo GCK, três do subtipo HNF1A e dois do subtipo HNF1B, realçando assim a importância de um diagnóstico correto, com recurso a ferramentas de genética molecular, uma vez que estes indivíduos tinham diagnósticos de diabetes tipo 1 ou tipo 2. Dos restantes 14 probandos sem qualquer variante patogénica/provavelmente patogénica, foi detetada pelo menos uma variante associada a diabetes tipo 2. A utilização destas técnicas no âmbito do diagnóstico genético permite estabelecer o diagnóstico correcto, com implicações para a terapêutica a administrar e qualidade de vida dos utentes dos serviços de saúde.
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