Browsing by Author "Churro, Catarina"
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- 4º Congresso Ibérico de Cianotoxinas − Lisboa, 8-10 julho 2015Publication . Churro, Catarina; Pereira, Paulo
- Abordagem multidisciplinar na identificação e monitorização de cianobactérias potencialmente tóxicasPublication . Churro, Catarina; Valério, ElisabeteO risco que as florescências cianobacterianas representam para a saúde humana advêm do facto destes desenvolvimentos excessivos estarem frequentemente associados à produção de cianotoxinas. As principais vias de exposição para o homem são através de água potável contaminada, diálise, consumo de peixe e marisco contaminado e atividades recreativas. A toxicidade destes compostos é elevada, como pode ser constatado no gráfico 1 em que está representada a comparação da toxicidade, com base na dose-letal (LD50%) em murganhos, entre as cianotoxinas e algumas das toxinas mais conhecidas em relação ao cianeto.
- Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural watersPublication . Churro, Catarina; Vasconcelos, Vitor Manuel de OliveiraThe most common cyanotoxins in Portuguese freshwaters are microcystins and their occurrence has been mainly attributed to cyanobacteria from the Microcystis genus. However, most recently, it has been described the production of these toxins by species of the Planktothrix, suggesting that this genus is also a major producer of microcystin in Portuguese surface waters. Nevertheless, and conversely to the Microcystis species, the knowledge on the occurrence, distribution and toxigenesis of Planktothrix is still limited. Planktothrix species exhibits some particularities that difficult their sampling, identification, quantification and toxigenic characterization in natural samples - Chapter 2. Particularly, the morphology of Planktothrix colonies does not allow distinguishing easily the individual cells. This makes their identification and quantification by optical microscopy a very difficult task, although this is the method generally used in cyanobacteria monitoring. Moreover, the most common methods for the detection of microcystins (ELISA, HPLC) do not identify the producer strains. These strains can be identified by conventional PCR, but this method doesnt enable to quantify them. In resume, there is not yet available a method that allow simultaneously identify and quantify microcystin-producing strains. This work aimed to develop a method based on Real-Time PCR applied to the monitoring of toxic species of Planktothrix in surface freshwater reservoirs used as drinking water supply and for recreational activities. The experimental work was developed according to several phases that are listed and explained below. In a first approach, field surveys were conducted to access the occurrence and distribution of Planktothrix – Chapter 3. It was observed that Planktothrix has a wide distribution in Portuguese lakes and that Planktothrix agardhii is the most commonly found specie. Furthermore microcystin production was detected in isolates from this species. In a second stage, it was developed a method based on real-time PCR to detect and quantify Planktothrix agardhii - Chapter 4. The real-time PCR is a promising technique for cyanobacteria research and monitoring. The main advantage of real-time PCR over conventional PCR is the ability to quantify the target gene copy numbers on a sample. Thus, in addition to identifying Planktothrix strains, the real-time PCR also enables to quantify those strains, which constitutes an advantage over the procedures used in the routine monitoring of cyanobacteria. It should be noted that the determination of the cell FCUP Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters vii density is critical in the risk assessment of toxic cyanobacteria, as the guideline values for cyanotoxins are based on cyanobacterial concentrations as well as on toxin cell quota. Another important aspect in cyanobacteria monitoring is the use of preserved samples. Preservation is used to maintain the morphologic features of cyanobacterial cells to further be used in their identification/quantification and also to avoid sample degradation during transport. In this work, the applicability of the real-time technique in the amplification of DNA from preserved samples was evaluated, by using the method previously developed for cell quantification – Chapter 5. The results indicate that real-time PCR is a robust technique applicable to those types of samples but that the most common preservation methods (Lugol’s solution, formaldehyde, glutaraldehyde) reduce the DNA quantity and quality. Since DNA degrades fast in those samples, the applicability of real-time PCR on preserved samples was tested using other preservation procedure – Chapter 6. The preservation in methanol 100% at -20ºC allowed maintaining the integrity of the samples both for morphologic and molecular analysis up to two years after preservation. The last chapter of this thesis reports the result of two years of monitoring of a reservoir having a persistent bloom of toxic P. agardhii (Appendix A) - Chapter 7. In this reservoir, high cell densities did not always correspond to high amounts of toxin and vice versa. Using the real-time PCR it was demonstrated that both toxic and non-toxic strains are present within the reservoirs and that they can flourish at different times. It was also detected a specie from another genus that also contributes to the production of microcystins. During the monitoring it was observed a chytrid parasite that infected the filaments of Planktothrix (Appendix A). The density of this parasite was also quantified by real-time PCR and the results showed that its development coincides with the increase of toxic Planktotrhix strains and of microcystin levels in the reservoir.
- Aplicabilidade da PCR em tempo real na amplificação de DNA cianobacteriano em amostras preservadas.Publication . Churro, Catarina; Pereira, Paulo; Valério, Elisabete; Vasconcelos, VitorO estudo e monitorização de florescências de cianobactérias envolve frequentemente o uso de amostras fixadas a fim de evitar a sua degradação. Com o aumento das técnicas moleculares disponiveis, a possibilidade de utilizar este recurso de DNA para explorar informação genética representa uma mais valia na investigação em cianobacterias e toxinas associadas. Neste trabalho, determinou-se a quantidade e qualidade do DNA cianobacteriano recuperado a partir de amostras ambientais e de culturas fixadas com (1) solução de Lugol, (2) formaldeído, (3) gluteraldeído e (4) solução de Transeau. A quantificação e capacidade de amplificação do DNA extraído foi avaliada por PCR em tempo real utilizando como fragmento alvo o gene rpoC1. A extração foi feita com fenol-cloróformio e a pureza do DNA foi determinada espectrofotometricamente pela razão DO260/DO280 e DO260/DO230. As amostras foram analisadas em 5 diluições seriadas de 1:10 para determinar o limite de detecção e a eficiência da reacção. A amplificação das várias diluições por PCR em tempo real foi comparada com a amplificação em PCR convencional. Nas amostras fixadas com solução de Lugol ou formaldeído, a quantidade de DNA obtido foi inferior à quantidade obtida na amostra controlo (sem fixação). Contudo obteve-se DNA de boa qualidade (DO260/DO280> 1,86 e DO260/DO230> 2,22). Na análise por PCR em tempo real o fragmento alvo foi amplificado exponencialmente, com réplicas consistentes e uma eficiência de 0,91 (r2=0,99; m=-3,55) para a solução de Lugol e eficiência de 1.02 (r2=0,98; m=-3,28) para o formaldeído. No entanto a quantificação do gene alvo nestas duas amostras foi significativamente inferior à do controlo o que indica que o gene alvo pode ser quantificado mas a sua concentração não pode ser extrapolada para concentração real da amostra não fixada. Todas as diluições das amostras referidas anteriormente foram amplificadas enquanto que por PCR convencional só se obteve produto nas três primeiras diluições, o que indica maior sensibilidade do PCR em tempo real para a amplificação de amostras fixadas. Para a fixação com a solução de Transeau e gluteraldeído obteve-se DNA de fraca qualidade (DO260/DO280 <1,6) o que influenciou a quantificação espectrofotométrica, assim como a análise do gene rpoC1 por PCR em tempo real, em que a amplificação não ocorreu correctamente e as réplicas foram inconsistentes.
- Applicability of the real-time PCR assay in the amplification of cyanobacterial DNA from preserved samplesPublication . Churro, Catarina; Valério, Elisabete; Pereira, Paulo; Vasconcelos, VitorThe study and monitoring of cyanobacterial blooms often involves the use of preserved samples to avoid cellular degradation. However, preserved samples may not be suitable for molecular biology studies because preservation methods can interfere with DNA quality/quantity. Real-time quantitative PCR analysis (qPCR) has been widely applied in molecular analysis and is considered a promising method for monitoring purposes. This study intended to evaluate the applicability of the real-time qPCR technique in samples that were subjected to different methods of preservation: (1) 15% Lugol’s iodine solution (2) 4% formaldehyde and (3) 25% glutaraldehyde. The ability to amplify and quantify DNA extracted from Planktothrix agardhii was assessed using the rpoC1 gene as the target fragment in both raw water samples and in vitro cultures. No reliable DNA amplification was obtained from glutaraldehyde-preserved samples. Successful amplification was obtained from Lugol’s and formaldehyde-preserved samples. In this case, however, the quantification that was achieved by real-time PCR cannot be used to infer cell numbers, because the Ct values that were obtained from the Lugol’s and formaldehydepreserved samples were significantly higher than the Ct values that were obtained from the unpreserved samples. Therefore real-time PCR can be used for the detection and identification of cyanobacteria in preserved samples but no reliable cell quantification can be performed using this method.
- Avaliação da influência da intensidade de luz na expressão do gene mcyA e na produção de microcistina em Microcystis aeruginosa e Planktothrix agardhiiPublication . Salvador, Daniel; Churro, Catarina; Valério, ElisabeteAs cianobactérias são frequentemente associadas à produção de toxinas, nomeadamente microcistinas. A sua síntese é não ribossomal, e acontece utilizando complexos multienzimáticos (genes mcy). Diversos estudos têm demonstrado que os fatores ambientais podem influenciar a produção de toxina. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da intensidade da luz na transcrição do gene mcyA e correspondente produção de microcistina em isolados tóxicos de Microcystis aeruginosa e Planktothrix agardhii. Para esse fim, as culturas foram expostas a três diferentes intensidades de luz (4, 20 e 30 µmol fotões m-2 s-1) durante 18 dias a 20 ± 1ºC. O crescimento foi seguido diariamente espectrofotometricamente. O nível de transcritos foi quantificado por RT-qPCR e a expressão relativa determinada usando três genes de referência - rRNA 16S, gltA e rpoc1. Os resultados mostraram a existência de uma correspondência entre a taxa de crescimento e a intensidade de luz em ambas as espécies. As taxas de crescimento foram menores a 4 e maiores a 30 µmol fotões m-2 s-1. Em M. aeruginosa a concentração de microcistina por célula foi semelhante entre intensidades de luz e ao longo do tempo, enquanto que em P. agardhii a concentração foi mais elevada na fase estacionária a 4 µmol fotões m-2 s-1. Existiram diferenças na expressão de mcyA entre as duas espécies. Em M. aeruginosa, a expressão foi máxima a 4 µmol fotões m-2 s-1 na fase de adaptação, já em P. agardhii foi máxima a 4 µmol fotões m-2 s-1 na fase exponencial de crescimento.
- Coleção de culturas de algas Estela Sousa e SilvaPublication . Menezes, Carina; Churro, Catarina; Paulino, Sérgio; Sam-Bento, Filomena; Alverca, Elsa; Dias, Elsa; Pereira, PauloA coleção de culturas de algas Estela Sousa e Silva (ESSACC) foi criada em 1956 e reside atualmente no Laboratório de Biologia e Ecotoxicologia no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. A ESSACC foi implementada em resposta à necessidade de um repositório de material biológico para investigação na área do fitoplâncton. Este importante recurso biológico contém culturas monoclonais de algas eucarióticas e cianobactérias provenientes de águas costeiras e albufeiras portuguesas. Atualmente, a coleção mantém acima de 176 isolados vivos, dos quais 151 são cianobactérias de água doce e 25 são dinoflagelados marinhos. Adicionalmente são também mantidos alguns isolados pertencentes a outros grupos de fitoflagelados. Esta coleção permitiu até agora a identificação e caracterização de espécies assim como a produção e purificação de toxinas para aplicação em estudos toxicológicos entre outras diversas áreas de investigação. Deste modo, a ESSACC constitui uma ferramenta importante no fornecimento de culturas de algas a investigadores na área do fitoplâncton, particularmente no estudo de espécies nocivas.
- Effects of bacillamide and newly synthesized derivatives on the growth of cyanobacteria and microalgae culturesPublication . Churro, Catarina; Alverca, Elsa; Sam-Bento, Filomena; Paulino, Sérgio; Figueira, Valdemar; Bento, Artur; PrabhaKar, Sundaresan; Lobo, Ana; Calado, António; Pereira, PauloThe antialgal activity of newly synthesized bacillamides against several cyanobacteria and microalgae isolates was screened using a rapid 96-well microplate bioassay. Cultures were exposed to serial dilutions of each bacillamide derivative (0–160 μg mL−1) in the microplate wells and daily optical measurements were used to estimate growth over a 216 h period. Inhibition values (%) were calculated from the estimated growth curves and inhibitory concentrations (IC50-216 h) were obtained from the sigmoidal inhibition curves fitted by regression analysis. The effects of bacillamides on cell morphology and ultrastructure were also analysed by light and transmission electron microscopy. In general, the toxic cyanobacteria Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon gracile, Anabaena circinalis and Anabaenopsis circularis were much more sensitive to bacillamides then the chlorophytes Ankistrodesmus falcatus and Scenedesmus obliquus. However, clear signs of morphological and ultrastructural changes induced by bacillamide were observed on both cyanobacteria and chlorophytes. Other cyanobacteria, namely the nostocalean Nodularia spumigena and the oscillatorialeans Leptolyngbya sp. and Planktothrix rubescens, exhibit higher tolerances to bacillamides, similar to that shown by different eukaryotic microalgae. Diatoms, on the other hand, proved to be quite as sensitive to most bacillamides as the most affected cyanobacteria. The properties of 5-iodo-Bacillamide (algicide or algistatic) were further investigated. This compound acted as an algistactic agent against eukaryotic algae and, depending on its concentration, acted as either an algicide or algistactic agent against most of the cyanobacteria tested. Although bacillamides cannot be considered as broad spectrum cyanobacterial algicides, different bacillamides might be of use in selectively controlling the growth of particular species of cyanobacteria.