DPSPDNT - Dissertações de mestrado
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- Caracterização Bioquímica e Molecular da Hipercolesterolemia Familiar na Região Norte e Centro de PortugalPublication . Freitas, Ana Isabel da Costa; Bourbon, Mafalda; Sousa, Maria JoãoFamilial Hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant genetic disorder and one of the most common genetic disorders in Europe and often under-diagnosed. The FH phenotype is characterized mainly by increased levels of total cholesterol (TC) and cholesterol in low-density lipoproteins (c-LDL) as well as the development of premature coronary heart disease and atherosclerosis. This condition is often caused by mutations in the Low-Density Lipoproteins Receptor (LDLR) gene however mutations in the Apolipoprotein B (ApoB) gene and Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) gene are also described as disease causing. The biochemical and molecular characterization of FH in patients from northern and central regions of Portugal was the purpose of this work. The study was based on molecular analysis of the LDLR gene and APOB gene by PCR amplification and direct sequencing. Were referred to the Portuguese Familial Hypercholesterolemia Study (EPHF), 34 individuals born in north or central region of Portugal, however 7 (20.6%) had no criteria for clinical diagnosis of FH. 17 (63%) of 27 index cases studied, were children (_ 16 years). The values of TC and c-LDL in the pediatric group were 249.4 ± 25.6 mg /dL and 173.8 ± 28.0 mg /dL, respectively. In the adult population these values were 308.0 ± 21.9 mg /dL and 218.5 ± 15.6 mg /dL. The genetic cause of hypercholesterolemia was determined in 29.6% of individuals. 7 genetic alterations were identified in the LDLR gene and only 1 in the APOB gene. Of the founded mutations, 3 are not yet described. This study highlights the importance of early diagnosis and cardiovascular prevention, enabling the introduction of therapeutic measures earlier and/or aggressive in both index cases and relatives, identified genetically with FH.
- Classification methods applied to familial hypercholesterolemia diagnosis in pediatric agePublication . Albuquerque, João David Ferreira de Castro; Antunes, Marília; Bourbon, MafaldaIntroduction: Familial Hypercholesterolemia (FH) is an inherited disorder of lipid metabolism, characterized by increased low density lipoprotein cholesterol (LDLc) levels. The resulting severe dyslipidemia leads to the early development of atherosclerosis, representing a major risk factor for cardiovascular disease (CVD). The early diagnosis of FH is associated with a significant reduction in CVD risk, supporting the introduction of precocious and more aggressive therapeutic measures. There are different clinical criteria available for the diagnosis of FH, although only genetic testing can confirm the diagnostic. Simon Broome (SB) criteria for FH diagnosis are among the most frequently used in clinical setting, and are based on family history, presence of physical signs, and LDLc and total cholesterol (TC) levels. When compared to genetic diagnosis results however, SB criteria present a high false positive rate, which constitutes a heavy burden in terms of healthcare costs, and limits the access to the genetic study of a larger universe of potential FH cases. Aim: The main purpose of this work was to develop alternative classification methods for FH diagnosis, based on different biochemical indicators, with improved ability to screen for FH cases in comparison to SB criteria. Two different models were developed for this purpose: a logistic regression (LR), and a decision tree (DT) model. Methods: Serum concentrations of TC, LDLc, high density lipoprotein cholesterol (HDLc), triglycerides (TG), apolipoproteins AI (apoAI) and B (apoB), and lipoprotein(a) (Lp(a)) were determined, and genetic diagnosis was performed, in a sample of 252 participants in the Portuguese FH Study, at pediatric age (2-17 years). All patients met the clinical criteria for dyslipidemia, and were not under hypolipidemic medication during the evaluation period. LR and DT models were fitted to sample data. For the LR model, two different cutoff points were defined, through receiver operating characteristics (ROC) curve analysis, following Yoden index and minimum p-value (min p) methods. The DT was built based on entropy reduction, or information gain measures. A modified version of the DT method was implemented, consisting in the sequential exclusion of predictor variables as they are introduced in the model. This allows producing a classification rule that uses single cutpoints for biomarkers, simplifying its interpretation. Different operating characteristics (OC) were estimated for all models: accuracy (Acc), sensitivity (Se), specificity (Spe), positive predictive value (PPV ) and negative predictive value (NPV ). These OC were calculated by generating a confusion matrix, considering molecular study results as the true state of the disease. The best performing LR and DT models were compared with SB biochemical criteria for FH diagnosis, through bootstrap resampling techniques. Median and mean values of the OC for 200 bootstrap samples were used for predictive performance comparison. Results: The logit function for the LR final model was expressed as g(π) = -7:083 + 0:086 X LDLc -0:041 X TG - 0:037X apoAI. The best performing DT model included the variables LDLc, TG, apoAI, apoB and HDLc, by descending order of importance. Between the different classification methods, Acc, Spe and PPV were higher in the DT model, followed by the LR model with the cut point value (c) defined by the min p method (c = 0:35). The lower values in these OC are found for SB criteria (p < 0:01). Higher Se and NPV on the other hand, are achieved by SB criteria, and the LR model with the cutpoint value calculated by Youden index (c = 0:17). However, the LR model using this cutpoint achieves significantly higher Acc, Spe and NPV than SB criteria (p < 0:01). Conclusions: Both LR and DT models seem to be a valid alternative to traditional clinical criteria for FH diagnosis. It seems possible to adjust the cutoff value in the LR model for similar Se levels as the ones observed in SB criteria, with significantly less false positive retention. To be validated by additional data, this would undoubtedly indicate this method as preferable between the two, and can have a very important impact in terms of cost-effectiveness. By avoiding the repetition of predictor variables, and providing single cutoff values for each biomarker, the modified DT model assumes a structure that typically resembles medical criteria, and can therefore be easily used in clinical practice. It seems that, in spite using different methodological approaches, both LR and DT models are able to divide the sample according to the most relevant biochemical characteristics for FH diagnosis. According to both classification methods, presence of FH is directly related to LDLc levels, and inversely related to TG and ApoAI concentrations, by this order of importance. The preferred classification model, as well as model specifications, may vary as a function of the OC that are considered more important, and context in which it is applied.
- Clinical and molecular characterization of Portuguese patients with a clinical diagnosis of MODYPublication . Mafra, João Paulo de Medeiros Gomes de; Bourbon, MafaldaA diabetes mellitus, ou simplesmente diabetes, pode ser definida como um conjunto complexo de perturbações crónicas de cariz metabólico caracterizadas por hiperglicémia. A diabetes tipo MODY, do inglês Maturity-onset diabetes of the young, é uma forma monogénica de diabetes. Inicialmente descrita em 1974 por Tattersall, a diabetes tipo MODY engloba um grupo de fenótipos heterogéneos, clinica e geneticamente, caracterizados por alterações no funcionamento normal das células beta do pâncreas e por um padrão de hereditariedade autossómico dominante. De uma forma geral, a diabetes tipo MODY tem um perfil não-insulino dependente e manifesta-se em crianças e indivíduos jovens, sendo tipicamente diagnosticada antes dos 25 anos. A diabetes tipo MODY aparenta ser rara, estimando-se que seja responsável por 0,6-2% dos casos de diabetes na Europa. No entanto, é frequente esta forma de diabetes ser equivocamente diagnosticada como diabetes tipo 1 ou tipo 2, pelo que a sua prevalência real deverá ser superior. Um dos grandes trunfos no combate a este subdiagnóstico da diabetes tipo MODY são os testes genéticos. Desde a década de 1990, foram 13 os genes associados à MODY. Mutações em heterozigotia nos genes GCK e HNF1A são as causas mais frequentes de diabetes tipo MODY, correspondendo a cerca de 70% dos casos. Logo a seguir estão as mutações em heterozigotia nos genes HNF4A (hepatocyte nuclear factor 4 alpha) e HNF1B, que correspondem a cerca de 15% dos casos. O gene GCK, localizado no cromossoma 7 (7p13), codifica o enzima glicocinase (glucokinase - GCK), também conhecido como hexocinase IV. Este enzima monomérico possui três isoformas - a isoforma 1, presente nas células beta, e as 2 e 3, presentes no fígado - e, no interior das células, atua como um sensor do nível de glicose. Nos hepatócitos, este enzima intervém no desencadear da glicólise e glicogénese, enquanto facilita a exocitose de insulina nas células beta. A diabetes tipo MODY, subtipo GCK, resulta de mutações de perda de função em heterozigotia no gene GCK, diminuindo a atividade do enzima, e caracteriza-se por uma hiperglicémia moderada, assintomática e não progressiva que se manifesta desde o nascimento. Estas mutações acabam por diminuir a quantidade de glicogénio sintetizado e impedem a normal libertação de insulina, ao aumentar a concentração mínima de glicose necessária à sua secreção. O gene HNF1A, localizado no cromossoma 12 (12q24.31), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1 alpha - HNF1A) homodimérico. Este fator de transcrição possui três isoformas, A, B e C. As três estão presentes no fígado, rins, pâncreas e intestinos mas a primeira predomina no fígado, rins e pâncreas fetal, enquanto a isoforma B predomina no pâncreas adulto. O HNF1A integra uma complexa rede de fatores de transcrição, desempenhando um papel regulador na expressão de diversos genes durante o desenvolvimento embrionário. No fígado, o HNF1A regula a expressão de vários genes hepáticos, como o gene que codifica para a albumina. Nas células beta, intervém na expressão de insulina e na proliferação e morte celular. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1A, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1A. Estas mutações podem ter diversos efeitos, reduzindo a secreção de insulina em resposta a glicose e aminoácidos, e alterando a expressão de genes envolvidos no transporte (GLUT2) e metabolismo de glicose, afetando processos como a glicólise, gluconeogénese e derivação de aminoácidos para o ciclo de Krebs. O subtipo HNF1A está associado a defeitos na proliferação das células beta e caracteriza-se por uma incapacidade progressiva na secreção de insulina, que não acompanha o aumento de glicose em circulação, dando origem a uma hiperglicémia mais grave que o subtipo GCK. O gene HNF1B, localizado no cromossoma 17 (17q12), codifica um fator de transcrição (hepatocyte nuclear factor 1beta - HNF1B) que atua como homodímero ou heterodímero, com HNF1A. O gene HNF1B produz três isoformas - 1, 2 e 3 - e é expresso no timo, pulmão, rim, fígado, pâncreas, estômago, intestino e trato genital. Este fator de transcrição, que integra a mesma rede regulatória que HNF1A, actua no desenvolvimento embrionário do pâncreas e do rim. A diabetes tipo MODY, subtipo HNF1B, resulta de mutações em heterozigotia no gene HNF1B e em cerca de 50% dos casos caracteriza-se por uma combinação de resistência à insulina e disfunção das células beta, exibindo, à semelhança do subtipo HNF1A, uma incapacidade na secreção de insulina em resposta a concentrações crescentes de glicose. Mutações neste gene podem também resultar em anomalias extra pancreáticas e afetar tecidos como o trato genital ou o fígado, sendo quistos renais o fenómeno mais observado. Neste estudo, foram recolhidas informações clínicas acerca de 39 indivíduos, 24 probandos e 15 familiares, através de questionários enviados por vários médicos de diferentes hospitais portugueses. Com base nestas informações, como glicémia em jejum, prova de tolerância à glicose oral e HbA1c, e no diagnóstico clínico de diabetes tipo MODY, foram-nos referenciados indivíduos com uma história familiar de diabetes que evidencie um padrão hereditário dominante; sem autoanticorpos pancreáticos; com início de sintomas antes dos 25 anos; e índice de massa corporal maioritariamente normal. Estes 24 probandos foram estudados por sequenciação de Sanger para os genes GCK e HNF1A, tendo sido também efetuada a pesquisa de inserções e deleções através da técnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Entre substituições pontuais e pequenas deleções, a sequenciação de Sanger detetou 46 variantes genéticas, 19 no gene GCK e 27 no gene HNF1A. Entre estas, seis podem ser classificadas como patogénicas ou provavelmente patogénicas, sendo quatro no gene GCK e duas no gene HNF1A. As variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas detetadas no gene GCK foram c.364C>T (p.(Leu122Phe)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY; c.579+1_579+33del, uma deleção de 33 pares de base no intrão 5 que elimina um local de splicing e também está associada à diabetes tipo MODY; c.766G>A (p.Glu256Lys), uma alteração missense no exão 7 que induz alterações conformacionais no enzima GCK, reduzindo a sua capacidade de ligação à glicose e subsequente atividade catalítica; e, finalmente, c.1268T>A (p.(Phe423Tyr)), uma alteração missense no exão 10 que cosegrega com diabetes e está associada à diabetes tipo MODY. Estas variantes foram encontradas num total de quatro probandos e cinco familiares. No gene HNF1A, as variantes patogénicas detetadas foram c.814C>T (p.(Arg272Cys)), uma alteração missense no exão 4 que cosegrega com diabetes e impede o fator de transcrição HNF1A de se ligar ao DNA, perdendo assim a sua atividade reguladora na expressão genética; e c.872del (p.(Pro291Glnfs*51)), uma deleção também localizada no exão 4 que provoca uma alteração na grelha de leitura, cosegrega com diabetes e possivelmente resulta de um fenómeno de splippage aquando da replicação de DNA, prevendo-se que resulte numa proteína truncada. Estas variantes foram encontradas num total de três probandos e três familiares. A técnica MLPA foi aplicada na investigação de inserções e deleções em 17 probandos. Três destes probandos geraram resultados sem qualidade, sendo necessárias novas amostras para eventual repetição. Noutros 11 nenhuma inserção ou deleção foi detetada. Nos restantes três probandos foram detetadas duas deleções patogénicas: deleção em heterozigotia dos exões 5 a 8 do gene GCK (c.484-?_1019+?del) num probando; e deleção em heterozigotia do gene HNF1B (c.1-?_1674+?del) em dois probandos. A deleção no gene GCK deverá produzir uma proteína não funcional para gerar o fenótipo MODY, subtipo GCK. No entanto, não foi encontrada qualquer informação sobre esta deleção ou o seu efeito na proteína, pelo que poderemos estar na presença de uma nova mutação. Quanto à deleção do gene HNF1B, estas são frequentes e existem várias fontes que apontam deleções completas do gene como patogénicas, que muitas vezes incluem outros genes na mesma região (17q12). Um dos probandos aparenta não ter história familiar de diabetes e, sendo mutações de novo frequentes, é possível que estejamos na presença de uma. No entanto, não haviam amostras de familiares para fazer estudos de cosegregação nestes dois probandos. A hemizigotia provocada por esta deleção deve resultar em MODY, subtipo HNF1B, por haploinsuficiência. Nenhum destes dois probandos aparenta ter anomalias renais. No total, entre 24 probandos, este estudo identificou 10 indivíduos com MODY, cinco do subtipo GCK, três do subtipo HNF1A e dois do subtipo HNF1B, realçando assim a importância de um diagnóstico correto, com recurso a ferramentas de genética molecular, uma vez que estes indivíduos tinham diagnósticos de diabetes tipo 1 ou tipo 2. Dos restantes 14 probandos sem qualquer variante patogénica/provavelmente patogénica, foi detetada pelo menos uma variante associada a diabetes tipo 2. A utilização destas técnicas no âmbito do diagnóstico genético permite estabelecer o diagnóstico correcto, com implicações para a terapêutica a administrar e qualidade de vida dos utentes dos serviços de saúde.
- Estudo Bioquímico e Molecular de Famílias com Hipercolesterolemia FamiliarPublication . Raquel Gameiro Leitão, Flávia; Bourbon, Mafalda; Crespo, Ana Maria ViegasIntrodução: A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma patologia genética, caracterizada clinicamente por um aumento dos níveis de colesterol-LDL (c-LDL) no plasma, sendo maioritariamente causada por mutações no gene do receptor das LDL (gene LDLR). Mutações missense nos genes APOB ou PCSK9 podem causar fenótipos semelhantes. A FH sozinha ou em conjugação com outros factores de risco cardiovasculares pode promover o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCVs) prematuras. De acordo com a frequência da doença (1:500 indivíduos) estima-se que em Portugal existam cerca de 20.000 doentes com FH, porém esta encontra-se sub-diagnosticada. Até à data, apenas foram diagnosticados aproximadamente 550 doentes. O método de cascade screening (CS) permite a rápida identificação de indivíduos com FH numa família e foi descrito como custo-efectivo na identificação de novos doentes com FH. Objectivos: O principal objectivo deste trabalho foi, através do CS, aumentar o número de casos identificados com FH. Pretendeu-se ainda realizar a caracterização bioquímica de casos índex e respectivos familiares com FH, a fim de tentar correlacionar o genótipo e o fenótipo destes e compreender de que forma a FH e outros factores de risco cardiovascular influenciam o desenvolvimento de DCVs nesta população. Métodos: Para alcançar os objectivos propostos, estudaram-se 45 famílias, perfazendo um total de 194 indivíduos, 45 casos índex (cujo estudo molecular já havia sito realizado) e 149 familiares. As amostras de soro de casos índex e familiares foram analisados por electroforese de lipoproteínas para avaliação da presença de sdLDL e por métodos enzimáticos e colorimétricos automatizados para determinar a concentração de sdLDL e outras apolipoproteínas no soro. Após extracção de DNA dos familiares realizou-se a amplificação e sequenciação dos exões em que se detectou uma mutação no respectivo caso índex (gene LDLR, APOB). Foi ainda determinado o genótipo APOE de todos os indivíduos estudados. Os resultados da sequenciação foram analisados através do software staden package. Por fim realizou-se uma análise estatística de forma a interpretar os resultados obtidos. Resultados: A partir do estudo molecular aos 149 familiares, foram diagnosticados com FH 83 indivíduos (20 crianças e 63 adultos). Determinou-se que 71,79% das crianças e 76,62% dos adultos apresentam um genótipo APOE E3/E3, não se obtendo diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes alelos e o perfil bioquímico. Relativamente à estratificação das sdLDL, 65,52% das crianças e 72,88% dos adultos apresentam, maioritariamente, subfracções maiores e menos densas das LDL. Observou-se ainda que os níveis de Lipoproteína(a) são tendencialmente superiores em indivíduos com DCV. Da amostra total, 47,93% dos indivíduos com FH não estão ainda medicados. Porém, mesmo os indivíduos medicados apresentam um perfil lipídico de risco para o desenvolvimento de uma DCV prematura. Conclusão: O CS é um método cujo custo-benefício é extremamente eficaz. Sendo, no entanto, necessário, aumentar a adesão dos familiares. O CS permite identificar precocemente indivíduos com FH, que apresentam elevado risco cardiovascular, necessitando de intervenções farmacológica e de controlo de outros factores de risco adequadas. Os resultados obtidos demonstram que mais de 50% dos casos não tem o seu risco cardiovascular controlado, sendo essencial uma melhor compreensão sobre a dinâmica existente entre as DCVs e a FH.
- Estudo Molecular de Dislipidemias FamiliaresPublication . Andreia Paninho Berguete Coelho, Sara; Bourbon, Mafalda; Rebelo, Maria Teresa Ferreira Ramos Nabais de OliveiraA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma dislipidemia de transmissão autossómica dominante que se caracteriza por níveis elevados de colesterol no plasma e aparecimento prematuro de aterosclerose e de doença cardiovascular. Mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9 são causa de FH. A dislipidemia familiar combinada (FCHL) é uma hiperlipidemia poligénica também relacionada com a ocorrência de DCV prematura. O seu fenótipo tem sido associado a alterações nos genes LPL, APOC2, APOC3, APOA4 e APOA5. O objectivo deste trabalho consistiu na caracterização clínica e molecular de indivíduos com suspeita clínica de dislipidemia familiar, nomeadamente FH. Foi também objectivo do estudo a avaliação dos critérios clínicos da FH. A amostra de estudo consistiu em 40 casos-índex (crianças e adultos de ambos os sexos) referenciados ao INSA por suspeita clínica de FH. A caracterização bioquímica permitiu avaliar o fenótipo do doente e inferir sobre a aplicação de critérios de diagnóstico clínico de FH. A caracterização molecular incluiu a pesquisa de alterações nos genes LDLR, APOB e PCSK9, recorrendo às metodologias de dHPLC, sequenciação automática e MLPA. Em 5 doentes que apresentavam também TG elevados foi efectuada a pesquisa de alterações nos genes LPL, APOC2, APOC3, APOA4 e APOA5, por sequenciação automática dos mesmos. O estudo molecular dos 40 casos-índex estudados identificou 15 (37,5%) indivíduos com FH. Em 31-39% dos 609 casos-índex portugueses já estudados no EPGH, o diagnóstico clínico resultante da aplicação dos 2 critérios clínicos de FH aplicados não coincide com os resultados do estudo molecular. Relativamente à FCHL, o estudo molecular somente identificou alterações que estão descritas como polimorfismos. A identificação precoce de casos-índex com dislipidemia familiar e dos seus familiares em risco pode aumentar a qualidade e a esperança de vida destes indivíduos, por aplicação de uma orientação terapêutica adequada, que possa possibilitar a redução da incidência de doenças cardiovasculares prematuras.
- Estudo sobre a prevalência de fatores de risco cardiovascular numa amostra de adultos da Região de LisboaPublication . Duarte, Elisete Guerreiro; Bourbon, Mafalda; Vale, Ana Filipa
- Estudos Funcionais de Variantes no Gene APOB em Doentes com Diagnóstico Clínico de Hipercolesterolemia FamiliarPublication . Ramos, Diana Catarina Fernandes; Bourbon, Mafalda; Alves, Ana CatarinaA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma doença caracterizada por níveis elevados de colesterol LDL, que se acumulam nas artérias, promovendo o desenvolvimento precoce de eventos cardiovasculares. Geneticamente, a FH é transmitida de forma autossómica semi-dominante, sendo causada por variantes nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As variantes no gene APOB afetam a ligação do colesterol LDL ao seu recetor, representando 5 a 10% dos casos de FH. No entanto, para a maioria das variantes identificadas, o efeito funcional na proteína ainda não está determinado. Esta dissertação teve como objetivo principal investigar a correlação entre fenótipo e genótipo, além de caracterizar funcionalmente variantes identificadas no gene APOB em indivíduos com diagnóstico clínico de FH na população portuguesa. Como objetivo secundário, foi desenvolvida uma base de dados que reúne todas as variantes deste gene com estudos funcionais realizados até ao momento. A identificação das variantes foi realizada por sequenciação de nova geração (NGS) e confirmada por PCR e sequenciação de Sanger, seguida da pesquisa da variante nos familiares dos casos index. As variantes em estudo foram identificadas no âmbito do projeto EPHF. O LDL dos participantes foi isolado por ultracentrifugação a partir do soro de casos index e familiares com variantes no gene APOB, bem como de indivíduos normolipidémicos. Este LDL foi marcado com fluorescência e incubado em células CHO-ldlΔ7 para avaliar a capacidade de ligação e internalização do LDL. A caracterização funcional, realizada por citometria de fluxo com LDL fluorescente, revelou que as variantes p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu) e p.(Arg4519Thr) apresentavam ligação e internalização normais do LDL, indicando que estas variantes não comprometem a função da proteína. Este trabalho destaca a importância de caracterizar funcionalmente as variantes no gene APOB para melhorar o diagnóstico dos indivíduos com FH, possibilitando tratamentos mais adequados a cada caso e contribuindo para a redução do risco cardiovascular.
- Familial Hypercholesterolaemia: molecular and functional study of LDLR mutationsPublication . Pinto Pereira, Andreia Sofia; Bourbon, MafaldaCardiovascular disease (CVD) remains the most common cause of death globally. Dyslipidaemia is one of the most important risk factors that leads to CVD. It can be due to a monogenic condition or to polygenic/environmental causes as diabetes, obesity, tobacco use, excess of alcohol or reduced physical activity. The identification of the individuals at risk and the distinction of these two types of dyslipidaemia is important for a correct cardiovascular risk assessment, counselling, and treatment reducing, this way, cardiovascular mortality. Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal dominant disorder of cholesterol metabolism. Most commonly, FH results from inherited defects in the Low-Density Lipoprotein Receptor Gene (LDLR) leading to increased levels of circulating LDL cholesterol and lipid accumulation in arteries and tendons. Mutations in other genes as the apolipoprotein B gene (APOB) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 gene (PCSK9), are also responsible for FH. The distribution pattern of apolipoprotein E gene (APOE) polymorphisms affects the affinity to lipoprotein receptors and, consequently, the clearance of dietary fat from the blood, also causing dyslipidaemia. The homozygous form of FH is rare and more severe, but the heterozygous form is common, with a frequency of 1/500 in most of European countries, although underdiagnosed in several populations, including the portuguese. FH is characterized by increased levels of plasmatic cholesterol since birth, which results in cholesterol deposits in extravascular tissues that can be identified in young patients (below 45 years old): xanthelasma, corneal arcus deposits and tendon xanthomas. This accumulation can cause premature arteriosclerosis and coronary heart disease (CHD). The presence of tendon xanthomas allows the differentiation of FH from other causes of hypercholesterolaemia as polygenic hypercholesterolaemia. More than 1700 different alterations in LDLR gene have been described worldwide. However, the functional studies for the great majority of these variants, have not been performed. For patients carrying these variants, a definitive molecular diagnosis for FH is not possible, representing a serious problem for FH diagnosis. In 1999, the Portuguese FH study was established at the National Institute of Health to identify the genetic cause of hypercholesterolaemia in individuals with a clinical diagnosis of FH. Index patients are included in this study using an adaptation of the Simon Broome (SB) criteria. Nonetheless, FH remains underdiagnosed and undertreated in the portuguese population. The main aim of this project was to perform the molecular identification of genetic variants in LDLR, APOB and APOE genes, causing dyslipidaemia in patients referred to the Portuguese FH Study in 2015/2016 with a clinical diagnosis of FH, in order to improve the identification of individuals at risk. Functional studies in RNA for putative splicing variants were also performed. The molecular diagnosis was performed for 60 index cases. Genomic DNA was isolated from peripheral blood lymphocytes using the salting out method. The 18 exons and promotor region of LDLR, part of exons 26 and 29 of APOB and exon 4 of APOE were amplified by PCR and sequenced by direct Sanger sequencing. A total of 18 variants were identified in 24 of these patients. The cascade screening in relatives of these 24 index patients allowed the identification and genetic characterization of additional 19 FH patients in Portugal. All alterations found have been previously reported, although only 11 had been functionally assessed. The search for large rearrangements was performed by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). In silico analysis was performed for all the variants found. III In order to access the effect of splicing mutations, RNA was isolated from patients’ blood with RNeasy® Mini Kit (Qiagen), after isolation of peripheral blood mononuclear cells, and then transcribed to cDNA. Regions of interest were amplified with specific primers designed to evaluate the effect on cDNA of two of the tree putative splicing variants found in LDLR gene. Specific detection of each transcript was accessed by an agarose gel and the fragments were sequenced by Sanger sequencing. Both alterations lead to skipping of an entire exon and create premature stop codons: c.1060+1G>A causes an inactivation of the donor site in intron 7 resulting in skipping of exon 7; the alteration in the last nucleotide of exon 16 (c.2389G>A) creates a new acceptor site causing the skipping of exon 16. The early genetic identification of a mutation, confirming the clinical diagnosis of FH, is very important, especially for young patients, since they can receive appropriate dietary and lifestyle advice and adequate therapeutic measures providing them longer and better lives.
- Molecular diagnosis of familial hypercholesterolemia and functional characterization of missense variants in the LDLR genePublication . Valentim de Azevedo, Sílvia; Bourbon, Mafalda[PT] A Hipercholesterolemia Familiar (FH) é uma patologia genética que é transmitida de forma autossómica dominante e é caracterizada por elevados níveis de colesterol no plasma desde o nascimento. A FH ocorre devido a variantes funcionais num dos genes codificantes de três proteínas: recetor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLR), apolipoproteína B-100 (APOB) ou pró-proteína convertase subtilisina quexina tipo 9 (PCSK9). O LDLR é uma glicoproteína membranar que liga e internaliza colesterol associado às lipoproteínas de baixa densidade (LDL), que constituem o principal transportador de colesterol no sangue. Variantes no gene LDLR podem resultar num catabolismo deficiente das LDL, tendo como consequência o aumento do colesterol no plasma, que se acumula nos tendões e artérias. Esta acumulação pode levar ao desenvolvimento prematuro de aterosclerose e doença cardiovascular. A FH apresenta duas formas clínicas: a forma heterozigótica, que apresenta um fenótipo menos agressivo, com valores de colesterol total entre 290 e 500 mg/dl (com LDL>190 mg/dl); e a forma homozigótica, que apresenta um fenótipo mais agressivo, com valores de colesterol total entre 600 mg/dl e 1000 mg/dl. Estima-se que as prevalências das formas heterozigótica e homozigótica sejam de 1/500 e de 1/1000000 indivíduos, respetivamente. Sabe-se ainda que mais de 90% dos casos identificados apresentam uma variante no LDLR, fazendo deste gene o mais associado a esta doença. Apesar de haver mais de 1600 variantes do LDLR reportadas em bases de dados, para a maior parte delas não existe registo de estudos funcionais que provem a sua patogenicidade, levando a que não seja possível atribuir um diagnóstico molecular definitivo a estes casos. Assim sendo, a necessidade de avaliar funcionalmente estas variantes, de modo a perceber em que medida afetam a função do recetor, também se torna imperativa. Tendo em conta as prevalências acima referidas, estima-se que em Portugal existam cerca de 20000 casos de FH. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF), implementado em 1999 no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, tem como objectivo a determinação da prevalência e distribuição desta patologia em Portugal. A população em estudo é constituída por indivíduos de ambos os sexos e todas as idades, desde que cumpram com os critérios para o diagnóstico clínico de FH. O diagnóstico clínico de FH é feito, em Portugal, de acordo com os critérios clínicos adaptados de “Simon Broome Heart Research Trust” e idealmente deverá ser realizado o estudo genético, com a identificação da variante, pois só desta forma é possível confirmar o diagnóstico clínico. A realização de estudos funcionais para determinar o efeito de variantes identificadas na função da proteína é também de elevada importância, podendo contribuir para uma terapêutica mais personalizada. O EPHF está dividido em duas partes: o estudo bioquímico e o estudo molecular. Este último está sub-dividido em cinco fases. A fase I compreende a extração de DNA, o estudo do promotor, todos os exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como das variantes mais comuns nos exões 26 e 29 da APOB. A fase II consiste no estudo de grandes rearranjos por Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). A fase III consiste no estudo do PCSK9 e a fase IV no estudo de todo o gene da APOB. A V e última fase consiste na realização de estudos funcionais in vitro para variantes cuja patogenicidade ainda é desconhecida. Assim sendo, este projeto está dividido em duas partes, que compreendem três das cinco fases do EPHF, nomeadamente as fases I, II e V. A primeira parte consistiu na realização do estudo molecular em participantes do EPHF, estudando o promotor e os 18 exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como o estudo de parte dos exões 26 e 29 da APOB por Polymerase Chain Reaction (PCR) e sequenciação de Sanger. De seguida, procedeu-se à pesquisa de grandes rearranjos por MLPA. Uma predição, utilizando as ferramentas in silico, foi também realizada, de modo a prever o impacto das alterações encontradas ao nível da proteína. Esta predição foi realizada tanto para alterações identificadas ao nível do exão, com as ferramentas Polymorphism Phenotyping (PolyPhen-2), Sorting Tolerant From Intolerant (SIFT) e Mutationtaster, como para as alterações identificadas ao nível do intrão, de modo a prever efeitos no splicing, com as ferramentas Human Splicing Finder (HSF), the Splice Site Prediction by Neutral Network (NNSSP) e FSPLICE. A segunda parte deste projeto consistiu então no estudo funcional das 10 variantes do LDLR mais comuns na população portuguesa, até à data sem estudos funcionais. As diferentes variantes do LDLR foram obtidas por mutagénese dirigida num plasmídeo pcDNA3_LDLR sob o controlo do promotor viral SV40. Toda a região de interesse foi confirmada por sequenciação de Sanger e foi feita uma reclonagem, em que o gene LDLR, já com a variante, foi transferido para um vetor limpo. Células CHO-ldlA7, que não expressam endogenamente o recetor, foram transfetadas com os diferentes plasmídeos. A expressão do recetor foi avaliada através da deteção com anticorpos; a ligação e a internalização foram avaliados através do uso de LDL fluorescentemente marcada com FITC. O impacto de todas as variantes ao nível da expressão, ligação e internalização foi analisado por citometria de fluxo. Em 25 casos índex estudados, 11 variantes foram identificadas em 12 doentes, embora duas destas sejam provavelmente benignas. A variante patogénica mais frequentemente encontrada na APOB foi identificada em apenas 2 doentes. De entre as alterações encontradas no LDLR (10), 2 foram aqui primeiramente reportadas e 8 já tinham sido anteriormente identificadas. De entre estas últimas, 7 já apresentavam estudos funcionais comprovando a sua patogenicidade. Aquando da pesquisa por grandes rearranjos nestes doentes por MLPA, nenhuma alteração deste tipo foi identificada no grupo em estudo. O estudo funcional das dez alterações mais frequentemente identificadas no decorrer do EPHF, até à data sem estudos funcionais que comprovem o impacto na função do recetor, revelou que, de entre as 10 variantes estudadas, 7 são patogénicas, afetando de alguma forma a função do LDLR. A variante c.1802A>T p.(Asp601Val) é patogénica, fazedo com que não haja sequer LDLR à superfície celular. Como não atinge a membrana (por não ser expressa ou por não se ancorar a esta) apresenta valores de ligação e de internalização igualmente baixos. As variantes c.1876G>A p.(Glu626Lys), c.631C>G p.(His211Asp), c.661G>T p.(Asp221Tyr), c.618_638del p.(Gly207_Ser213del) e c.551G>A p.(Cys184Tyr) apresentaram uma expressão normal. No entanto, foram observáveis valores muito reduzidos para a fluorescência associada à união das LDL nestes casos. Consequentemente, a internalização também é defetiva, parecendo lógico classificar estas variantes como patogénicas. A variante c.1775G>A p.(Gly592Glu) resulta num defeito, possivelmente, ao nível da reciclagem do recetor, sendo também considerada patogénica. Por outro lado, as variantes c.1816G>T p.(Ala606Ser), c.1966C>A p.(His656Asn) e c.2177C>T p.(Thr726Ile) parecem não revelar qualquer impacto no LDLR, sugerindo a sua neutralidade, pois obtiveram-se valores de fluorescência, associados à expressão e atividades de ligação e internalização, comparáveis ao wt. Estes resultados sugerem que os doentes portadores destas variantes devem apresentar outra justificação para o seu fenótipo hipercolesterolémico. A análise destas variantes através de ferramentas de predição in silico, realizada para todas as variantes identificadas no decorrer deste projeto, permitiu concluir que estas predições nem sempre vão de encontro ao determinado através da realização de estudos funcionais. Assim sendo, estes programas deverão ser usados, mas com a devida ressalva de que são apenas preditores. A FH é uma doença para a qual, felizmente, existe um diagnóstico definitivo (genético) e variados tratamentos farmacológicos. Apesar de ser uma doença subdiagnosticada, estão a ser realizadas diversas iniciativas para que haja uma maior divulgação da doença, nomeadamente dos benefícios do diagnóstico precoce. No âmbito da EPHF tem-se feito um esforço para que seja implementado o diagnóstico molecular como diagnóstico preferencial, juntamente com a execução de estudos funcionais para determinar a patogenicidade de variantes desconhecidas. Só assim os doentes têm a possibilidade de ter um diagnóstico definitivo para a sua patologia tornado possível instituir medidas preventivas com uma terapêutica dirigida e personalizada, melhorando o prognóstico destes doentes.
- Molecular diagnosis of Maturity Onset Diabetes of the Young: a case for personalized medicinePublication . Poejo, Daniela Mendes; Bourbon, MafaldaRESUMO: A diabetes mellitus, ou apenas diabetes, como é usualmente conhecida, é um dos fatores de maior risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Esta patologia é caracterizada por um conjunto de alterações metabólicas causadas pela deficiência na secreção da hormona insulina. A resposta ineficaz da insulina conduz a um estado de hiperglicemia permanente desencadeada pelo aumento dos níveis de glicose no sangue. Apesar da diabetes mellitus tipo 1 e a diabetes mellitus tipo 2 serem as mais frequentes e consequentemente mais estudadas, existem vários tipos de diabetes mellitus que diferem tanto nas características clínicas como na sua fisiopatologia. Desde modo, é essencial considerar as formas mais raras de diabetes adequando o tipo de intervenção terapêutica de acordo com as características específicas do tipo de diabetes e do paciente. A diabetes tipo MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) é uma forma monogénica de diabetes descrita pela primeira vez em 1974 por Tattersall. A diabetes tipo MODY é uma doença de origem genética de padrão de hereditariedade autossómico dominante que provoca alterações no normal funcionamento nas células responsáveis pela produção de insulina, as células beta do pâncreas. O aparecimento deste tipo de diabetes costuma manifestar-se em crianças e jovens antes dos 25 anos, em indivíduos não-insulino dependentes e sem sinais de insulinorresistência. Apesar de apresentar tanto características clínicas como base genética díspares, pacientes com diabetes tipo MODY são muitas vezes erradamente diagnosticados com diabetes tipo 1 ou diabetes tipo 2. Além disso, a diabetes tipo MODY apresenta uma elevada heterogeneidade fenotípica e genotípica fazendo com que o teste genético seja extremamente relevante tanto para a otimização do tratamento como para a prevenção de possíveis complicações de saúde associadas a diabetes. Atualmente, sabe-se que alterações genéticas em 1 dos 14 genes associados à MODY podem ser causa patogénica da diabetes deste tipo. Mutações heterozigóticas nos genes GCK, HNF1A, HNF4A e HNF1B são as causas mais comuns encontradas em pacientes com diabetes tipo MODY. Localizado no cromossoma 7 (7p13), o gene GCK codifica a enzima glucocinase (GCK – glucokinase) que desempenha um papel fundamental na primeira fase dos processos metabólicos da glicose. As isoformas desta enzima monomérica estão presentes no fígado e células beta do pâncreas. Nestas últimas, atuam como um sensor do nível de glicose induzindo a secreção de insulina. Quando ocorrem alterações patogénicas neste gene a atividade enzimática da GCK fica comprometida. A diminuição da atividade da GCK afeta diretamente a normal secreção de insulina, aumentando a concentração mínima de glicose no sangue necessária para a estimulação da libertação de insulina. Assim, indivíduos com diabetes tipo MODY, subtipo GCK apresentam hiperglicemia moderada desde a nascença, podendo ser em muitos casos assintomáticos. O gene HNF1A está localizado no cromossoma 12 (12q24.31), codifica um fator de transcrição hepatocyte nuclear factor 1 alpha pertencente a um grupo de fatores de transcrição hepáticos que estão associados ao aparecimento a longo prazo de complicações de saúde derivadas da diabetes. Este fator de transcrição possui três isoformas A, B e C que estão distribuídas diferencialmente em vários orgãos, como fígado, rim e pâncreas. O seu perfil de expressão difere consoante o órgão e o estado de desenvolvimento do mesmo. Enquanto a isoforma A está presente em fases iniciais de desenvolvimento do pâncreas fetal, a isoforma B é predominante no pâncreas maturo. Além disso, sabe-se que HNF1A regula a proliferação e morte celular das células beta tendo um papel crucial na expressão de insulina.Variantes genéticas neste gene levam a uma desregulação na proliferação das células beta desencadeando uma deficiência progressiva na secreção de insulina. Os níveis de insulina endógena de pacientes com este II subtipo HNF1A de diabetes tipo MODY tendem a diminuir ao longo da vida. Desde modo, estes pacientes necessitam de um tratamento contínuo que deverá ser periodicamente ajustado. À semelhança do anterior, o gene HNF1B pertence ao mesmo grupo fatores de transcrição. Está localizado no cromossoma 17 (17q12) e codifica para o fator de transcrição hepatocyte nuclear factor 1 beta. O gene HNF1B é expresso em inúmeros tecidos como é o caso do timo, pulmão, estômago, intestino, fígado, rim, pâncreas e trato genital. Destacando a sua função em fase prematura do desenvolvimento das estruturas dos tecidos. De facto, HNF1B desempenha um papel essencial no desenvolvimento embrionário de vários órgãos, como é o caso do pâncreas e do rim. Alterações patogénicas no gene HNF1B são caracterizadas pela disfunção de células beta combinada com um uma diminuição da sensibilidade à insulina. Adicionalmente, é bastante comum em paciente com este subtipo de MODY o desenvolvimento de disfunções renais e complicações cardiovasculares. Assim, pacientes com este subtipo de diabetes tipo MODY precisam de um controlo glicémico adequado para prevenir e ou atenuar os problemas de saúde associados, onde a administração de insulina é frequentemente utilizada. Neste estudo participaram dezanove indivíduos previamente selecionados com características clínicas que permitissem suspeitar de diabetes tipo MODY. As informações clínicas foram recolhidas através de um questionário enviado por uma médica da Associação Protetora dos Diabéticos de Portugal (APDP), que indicou estes pacientes para o estudo molecular de diabetes tipo MODY que decorre no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. O DNA de cada participante foi extraído a partir das amostras de sangue colhidas aos participantes. Posteriormente os genes GCK, HNF1A e HNF1B foram amplificados por PCR e estudados utilizando o método de sequenciação de Sanger. Foram utilizadas ferramentas bioinformáticas para o alinhamento e análise de variantes nos cromatogramas obtidos. Por fim, as variantes encontradas foram classificadas segundo os critérios da American College of Medical Genetics and Genomics. Como resultado da sequenciação de Sanger foram detetadas no total dezasseis variantes com distribuição não uniforme ao longo de dois genes estudados: três variantes no gene GCK e treze variantes no gene HNF1A. Sete destas variantes foram classificadas como de significado incerto. O número de doentes não relacionados com a variante, o tipo de variante e sua localização, a prevalência da variante em populações controlo, a co segregação da variante com o fenótipo na família e os fenótipos apresentados pelos participantes são algumas das evidências que permitiram interpretar e classificar estas variantes. Infelizmente, devido à falta de informação disponível, não foi possível atribuir uma classificação definitiva a estas 7 variantes. Assim, estas variantes foram classificadas como de significado incerto até que seja possível obter mais dados que suportem a revisão da sua interpretação. Em resumo, foram encontradas sete variantes em sete participantes classificadas como variante de significado incerto e nos restantes doze indivíduos em estudo as variantes encontradas foram classificadas como benignas não estando associadas à patologia. É necessário continuar o estudo dos outros genes associados a MODY e aumentar a evidência sobre as variantes encontradas de forma a que estes doentes tenham um diagnóstico definitivo. Este estudo realça a importância da implementação do teste genético em pacientes diabéticos com fenótipo de MODY. Da mesma forma, o investimento na investigação de diabetes tipo MODY é essencial para a melhor interpretação e classificação de variantes. O correto diagnóstico e a identificação genotípica de indivíduos com diabetes tipo MODY permite melhor adequar as opções terapêuticas. A personalização do tratamento de acordo com as características genéticas de cada subtipo pode ser um enorme avanço na melhoria do controlo glicémico e na prevenção de outras complicações de saúde tendo grande impacto na qualidade de vida dos pacientes e famílias. III