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- KBG Syndrome: a de novo chromosomal rearrangement in prenatal diagnosis beyond conventional cytogeneticsPublication . Carvalho, I.; Freixo, J.P.; Cruz, J.; Oliveira, N.; Marques, B.; Correia, H.; Morton, C.; David, D.Introduction: KBG syndrome (OMIM #148050) is a rare disorder characterized by a typical facial dysmorphism, macrodontia of the upper central incisors, skeletal anomalies, short stature and developmental delay. Cutaneous syndactyly, webbed short neck, cryptorchidism, hearing loss, palatal defects, strabismus and congenital heart defects are less common findings. Although this is an autosomal dominant condition predominant maternal inheritance, mainly due to a milder clinical manifestation in females, is frequently observed. Pathogenic alterations, mainly truncating point mutations and microdeletions, leading to haploinsufficiency of ANKRD11, have been described to be the molecular basis of this syndrome.
- Presença de listeria monocytogenes em queijos de pasta mole da região a sul do TejoPublication . Gonçalves, Magda; Furtado, Rosália; Coelho, Anabela; Belo Correia, Cristina; Valente, AnaIntrodução: Nas últimas décadas, o número de casos de infeções de origem alimentar provocadas por Listeria monocytogenes tem vindo a aumentar. Objetivo: Deteção e quantificação de Listeria monocytogenes em queijos de pasta mole produzidos na região a Sul do Tejo. Metodologia: Foram analisadas 30 amostras de queijos de pasta mole de diferentes fabricantes, dos quais 66,7% produzidas a partir de leite de ovelha cru. Resultados: Das amostras analisadas, 10% (n = 3) estavam contaminadas com Listeria monocytogenes e 17% (n=5) com Listeria innocua. Conclusão: O consumo de queijos de pasta mole está associado com o aumento do risco de ocorrência de listeriose.
- Functional characterization of 2 news variants in the APOB genePublication . Alves, A.C.; Medeiros, A.M.; Etxebarria, A.; Benito-Vicente, A.; Martin, C.; Bourbon, MafaldaFamilial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal dominant disorder of cholesterol metabolism. Loss of function mutations in LDLR and APOB and also gain of function mutations in PCSK9 have been associated with FH, but mutations in LDLR are the most common cause of FH. Until 2012 only mutations in two small fragments of exon 26 and 29 were described as causing FH. However with Next Generation Sequencing techniques others alterations in fragments not studied in routine diagnosis are being found and need to be functional characterized. In the past years 5 new functional mutations have been described in APOB fragments not routinely studied and our group characterized 2/5 as causing FH
- Caraterização dos domínios da proteína adaptadora Ezrina essenciais à estabilização membranar do canal CFTR-F508delPublication . Rodrigues Neno, Vanessa Isabel; Matos, Paulo Henrique Carrasquinho deA Fibrose Quística (FQ) é a doença genética autossómica recessiva mais prevalente em Caucasianos. Esta doença é causada por mutações no gene CFTR que codifica a glicoproteína CFTR, um canal transportador de iões cloreto expresso em células epiteliais de vários órgãos. Atualmente estão identificadas cerca de 2000 mutações, sendo a mais comum a F508del - que corresponde à deleção do aminoácido fenilalanina na posição 508 e está presente em 90% dos doentes, em pelo menos um dos alelos. Esta mutação prejudica o folding e o tráfego do canal para a membrana plasmática (MP) afetando assim a função da CFTR. Ainda assim, a CFTR-F508del que consegue atingir a MP apresenta ainda defeitos no transporte de cloreto e na sua permanência e estabilidade na superfície das células. Consequentemente, a ausência funcional do canal CFTR nas células epiteliais causa deficiências em vários órgãos e sistemas, dos quais se destacam a insuficiência pancreática, a infertilidade masculina e os problemas respiratórios, de longe a manifestação com maior mortalidade, decorrente de infeções recorrentes e da inflamação crónica das vias respiratórias, que acabam por levar à falência pulmonar. Nos últimos anos têm sido feitos diversos estudos para identificar estratégias que permitam corrigir e resgatar a CFTR-F508del para a MP. A pesquisa de compostos para este efeito – denominados “corretores” – levou à descoberta de várias novas moléculas. O corretor mais promissor é o composto VX-809 que permite corrigir parcialmente o folding da CFTR-F508del e, consequentemente, promove o seu resgate para a MP. Contudo, os ensaios clínicos para este composto não mostraram melhorias significativas na maturação da CFTR-F508del em biopsias rectais, nem na função pulmonar dos doentes. Estudos posteriores demonstraram que o canal corrigido é muito instável sendo rapidamente removido da MP por endocitose. O grupo de acolhimento tem investigado este fenómeno, procurando caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos, por forma a encontrar estratégias que permitam estabilizar a CFTR-F508del corrigida com o VX-809 na MP. Em estudos recentes do grupo mostrou-se que a ativação da proteína Ezrina e a interação do seu domínio FERM com a proteína NHERF1 estabilizam a CFTR-F508del corrigida farmacologicamente na MP através da formação do complexo macromolecular CFTR-NHERF1-Ezrina. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu em identificar que subdomínios da proteína Ezrina são essenciais para esta estabilização da CFTR-F508del e utilizar esta informação para desenvolver um péptido recombinante bioativo. No desenho deste péptido de fusão foram ainda incluídos domínios de transdução proteica, de modo possibilitar a sua entrega às células alvo, e uma sequência péptido sinal eucariota, permitindo a sua síntese e secreção a partir de células de mamífero, o que possibilitou a sua produção e isolamento. Os resultados obtidos mostraram que o péptido bioativo produzido promove a estabilização na superfície celular da CFTR-F508del resgatada farmacologicamente. Foi também possível observar, através de imunofluorescência confocal, que o péptido de fusão é capaz de atravessar as membranas celulares e que possui um efeito autócrino ao ser secretado por células epiteliais brônquicas que expressam constitutivamente CFTR-F508del. Finalmente, o efeito aditivo do co-tratamento com VX-809 e a administração ectópica de péptido produzido em células HEK 293 foi demonstrado pelo aumento da atividade da CFTR-F508del em ensaios de influxo de iodeto. O segundo objetivo deste trabalho consistiu em explorar a alteração conformacional da proteína adaptadora NHERF1, que determina a estabilização da CFTR-F508del resgatada na MP, para produzir um sensor de FRET que possa vir a ser utilizado em ensaios de alto rendimento na pesquisa de alternativas químicas ou bioquímicas ao péptido bioativo produzido. Os resultados preliminares demonstraram a viabilidade do método, mas evidenciaram a necessidade de restringir a localização do sensor à MP para permitir a automação da metodologia em ensaios de alto rendimento. Por fim, analisou-se a expressão da GTPase variante RAC1b em amostras de tecido pulmonar, comparando indivíduos saudáveis com doentes de FQ (F508del+/+). A RAC1b é uma variante de splicing com propriedades antagónicas da GTPase RAC1, molécula que participa na ativação da Ezrina e é necessária à estabilização endógena da CFTR na MP. Os resultados obtidos não evidenciaram qualquer aumento de expressão desta variante em pulmões FQ F508del+/+. Não obstante, ao dosear-se a expressão de citoqueratina 8, verificou-se que a composição epitelial das amostras FQ era deficitária, pelo que a expressão de RAC1b detetada pode encontrar-se subestimada. Assim, pensa-se que os objetivos propostos para este trabalho de mestrado foram predominantemente atingidos, quer no que respeita ao desenvolvimento do péptido bioativo derivado da Ezrina, quer ao nível da construção e testes preliminares do sensor de FRET baseado na NHERF1. Assim, só não foi possível cumprir integralmente o último objetivo, pois a análise dos níveis de expressão de RAC1b em tecidos epiteliais brônquicos de doentes com FQ (F508del+/+) revelou-se inconclusiva.
- Micropipetas - Verificações intermédiasPublication . Flores, CristinaComunicação sobre Micropipetas - Verificações intermédias, apresentada no âmbito do trabalho desenvolvido pelo GT Volume da Comissão Técnica RELACRE - METROLOGIA.
- Neurodegenerative Lysosomal Diseases Approached by Next Generation SequencingPublication . Encarnação, Marisa; Coutinho, Maria Francisca; Silva, Lisbeth; Ribeiro, Diogo; Nogueira, Célia; Vilarinho, Laura; Alves, SandraIntroduction: Lysosomal Storage Disorders (LSD) are a heterogenous group of rare, monogenic diseases with significant phenotypic overlap and clinical variability. For this reason, the diagnosis is difficult and time consuming, with multiple tests/samples being often required before a definitive diagnosis is reached. Next Generation Sequencing (NGS) is changing this scenario by allowing the variant assessment at a large scale in a single run. The aim of this work, was to develop an NGS-based workflow for the identification of LSD-causing variants. Methods: We designed a panel including exons and intronic flanking regions from 96 genes involved in lysosome homeostasis and function. The workflow was performed using an Agilent SureSelect QXT Target Enrichment protocol followed by sequencing in an Illumina MiSeq® platform. For alignment and variant anotation the softwares Surecall and wANNOVAR were used.
- The experience of the Portuguese National Institute of Health (INSA) in the Joint Action CHRODISPublication . Costa, LucianaAbout the experience of the Portuguese National Institute of Health (INSA) in the Joint Action CHRODIS - Joint Action on Chronic Diseases and promoting healthy ageing across the life-cycle.
- Cap-independent translation ensures mTOR expression and function upon protein synthesis inhibitionPublication . Marques-Ramos, Ana; Romão, Luísa; Candeias, Marco; Menezes, Juliane; Lacerda, Rafaela; Willcocks, M.; Teixeira, Alexandre; Locker, NicolasThe mechanistic/mammalian target of rapamycin (mTOR) is a conserved serine/threonine kinase that integrates cellular signals from the nutrient and energy status to act, namely, on the protein synthesis machinery. While major advances have emerged regarding the regulators and effects of the mTOR signaling pathway, little is known about the regulation of mTOR gene expression. Here, we show that the human mTOR transcript can be translated in a cap-independent manner, and that its 5' untranslated region (UTR) is a highly folded RNA scaffold capable of binding directly to the 40S ribosomal subunit. We further demonstrate that mTOR is able to bypass the cap requirement for translation both in normal and hypoxic conditions. Moreover, our data reveal that the cap-independent translation of mTOR is necessary for its ability to induce cell-cycle progression into S phase. These results suggest a novel regulatory mechanism for mTOR gene expression that integrates the global protein synthesis changes induced by translational inhibitory conditions.
- Genetically Modulated Substrate Reduction Therapy for Sanfilippo syndrome – proof of principlePublication . Santos, Juliana Inês; Coutinho, Maria Francisca; Alves, SandraIntroduction: Sanfilippo syndrome, or Mucopolysaccharidosis (MPS) type III refers to a group of five autosomal recessive neurodegenerative lysosomal storage disorders caused by the incomplete lysosomal degradation of the glycosaminoglycan (GAG) heparan sulphate (HS) that accumulates in patient cells and triggers disease. The main characteristic of MPS III is the degeneration of the central nervous system, resulting in mental retardation and hyperactivity, with a typical early onset. Currently, there is no effective therapy available, with treatment limited to clinical management of neurological symptoms. In order to address this issue, we have designed an RNA-based therapeutic strategy based upon the selective downregulation of genes involved in HS biosynthesis. Methods: Taking advantage of the RNA interference (RNAi) technology potential, we have designed and assayed a specific siRNA targeting an early stage of the HS biosynthetic cascade (XYLT1). Our goal is to promote an effective reduction of the accumulating substrate, ultimately decreasing or delaying the symptoms. Fibroblasts from MPS III patients’ were transfected with the designed siRNA. Total RNA was extracted and target mRNA levels evaluated through real-time PCR. In order to evaluate the effect of this approach, the GAGs accumulation was quantified over time using a modified 1,9-dimethylmethylene blue assay. Results and Discussion: Proof of principle on the effect of an siRNA targeting XYLT1 was achieved for two independent control cell lines, with 8-12 fold decreases on the target mRNA levels, after 24h of incubation with concentrations of 20nM of each siRNA. Subsequent analysis on the effect of the same siRNA on patients’ cell lines resulted in significant lower expression of XYLT1 in MPS IIIA, IIIC and IIID fibroblasts. Initial studies evaluated mRNA levels after 24-48h incubation. Studies on MPS IIIB are also ongoing. For MPS IIIC, we have already assessed the treatment effect on storage and observed a significant reduction (50%) on the total GAGs levels. We are currently addressing GAGs’ storage in the remaining MPS III cell lines. Here we present an overview of the preliminary results of this project and unveil its next steps towards a full characterization/evaluation of its potential therapeutic effect.
- Risk assessment of patulin intake through apple-based food by infants and preschool children in SerbiaPublication . Torović, Ljilja; Dimitrov, Nina; Assunção, Ricardo; Alvito, PaulaThis study reports for the first time in Serbia the occurrence of patulin in apple-based food and the risk assessment associated with patulin intake by infants and preschool children. In total, 214 samples of infant fruit juices (48), infant purée (66), and juices for children (small package with straw, 100) were collected over 3 years (2013–15) and analysed using HPLC with ultraviolet detection. Patulin was found in 43.8% of infant juices and 16.7% of infant purée, with all values below the legal limit of 10 μg kg−1 (maximum 8.3 and 7.7 μg kg−1, respectively). The proportion of contaminated samples among fruit juices for children was 43.0%, with the highest patulin concentration at 30.2 μg kg−1, not exceeding the maximum allowed level of 50 μg kg−1. Risk assessment of patulin intake by Serbian infants and preschool children, conducted by deterministic and probabilistic approaches, revealed a hazard quotient well below 1, indicating a tolerable exposure level and no health concern.