DSA - Dissertações de mestrado
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- Avaliação da expressão de genes envolvidos na síntese de microcistinas em cianobactérias tóxicas sujeitas a diferentes intensidades de luzPublication . Salvador, Daniel; Valério, Elisabete; Dias, Deodália[PT] As cianobactérias são um grupo de microrganismos fitoplanctónicos, procariotas unicelulares, aeróbios e autotróficos. Encontram-se difundidos numa ampla variedade de habitats, ainda assim, são especialmente comuns em ambientes de água doce. A maioria das espécies existe normalmente em baixas concentrações no ambiente, no entanto, quando as condições ambientais são favoráveis, as células podem proliferar massivamente, levando à formação de florescências (blooms). Os blooms são um problema bastante actual e crescente em todo o mundo, dado que por vezes podem ser tóxicos e causar intoxicações e até a morte. A sua toxicidade resulta da capacidade que algumas espécies de cianobactérias produzirem toxinas. Dos vários grupos de cianotoxinas, as hepatotoxinas são umas das que mais frequentemente estão relacionadas com intoxicações. Deste grupo, as microcistinas são as mais comuns em corpos de água doce portugueses. A crescente consciencialização dos seus riscos tem resultado em vários estudos para compreender o seu mecanismo de síntese e os factores que podem regular/influenciar o mesmo. A síntese das microcistinas é não ribossomal, a partir de um mecanismo característico de tio-molde, e utilizando complexos multienzimáticos codificados pelos genes mcy. Relativamente aos factores regulatórios, diversos estudos têm vindo a demonstrar que os factores ambientais podem induzir alterações na concentração/produção de cianotoxinas, designadamente o pH, a concentração/proporção de nutrientes, a temperatura e a intensidade de luz. No entanto a informação existente não é consensual. Assim, este estudo tem como objectivo principal avaliar a influência da intensidade de luz na transcrição do gene mcyA e correspondente produção de microcistina em diferentes cianobactérias tóxicas. Simultaneamente pretendeu-se avaliar a influência das diferentes intensidades de luz na taxa de crescimento e ainda avaliar diferentes genes de referência para a normalização da expressão génica, obtida em RT-qPCR. Foram utilizados dois isolados produtores de microcistina - Microcystis aeruginosa (LMECYA 7) e Planktothrix agardhii (LMECYA 256). As culturas foram expostas durante 18 dias a três diferentes intensidades de luz (4, 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1) a uma temperatura de 20 ± 1ºC. Diariamente recolheram-se amostras para avaliar o crescimento das culturas, através da medição da densidade óptica. Em cada fase do crescimento colheram-se também amostras (três vezes) para efectuar a contagem celular, quantificação das microcistinas pela técnica de ELISA e extracção de RNA. Neste trabalho foi avaliada a expressão do gene mcyA pertencente ao cluster mcy, por RT-qPCR. Para além disso, foram ainda estudados genes de referência (rRNA 16S, gltA e rpoC1). Verificou-se uma correlação entre a taxa de crescimento e a intensidade de luz, quer em M. aeruginosa, quer em P. agardhii. As taxas de crescimento em ambas as espécies foram menores a 4 μmol de fotões m-2 s-1 e maiores a 30 μmol de fotões m-2 s-1. As diferenças foram mais acentuadas entre o crescimento na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1 e o crescimento nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre estas últimas duas intensidades a taxa foi bastante semelhante. O efeito das diferentes intensidades de luz foi mais acentuado em M. aeruginosa do que em P. agardhii. As concentrações de microcistina por célula em M. aeruginosa foram semelhantes entre intensidades de luz, sobretudo nas duas primeiras fases do crescimento. Apenas na fase estacionária as concentrações de toxina diferiram consideravelmente, tendo a maior produção ocorrido a 30 μmol de fotões m-2 s-1 e a menor a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii houve maiores diferenças na concentração de microcistina por célula entre intensidades de luz e fases do crescimento. A maior produção ocorreu a 4 μmol de fotões m-2 s-1 na fase estacionária e a menor a 20 μmol de fotões m-2 s-1 na fase exponencial de crescimento. Relativamente à estabilidade dos genes de referência, o gene rRNA 16S foi o menos estável em M. aeruginosa, mas o mais estável em P. agardhii, tendo em conta os algoritmos geNorm e NormFinder. O gene rpoC1 foi o mais estável em M. aeruginosa e o menos estável em P. agardhii, tendo em consideração os mesmos algoritmos. Usando o algoritmo BestKeeper, o gene gltA foi classificado como o mais estável em ambas as espécies. Utilizaram-se assim os genes rpoC1 e gltA em M. aeruginosa e os genes rRNA 16S e gltA em P. agardhii na normalização da expressão do gene mcyA. A expressão do gene mcyA nas três fases do crescimento em M. aeruginosa foi sempre significativamente diferente entre a intensidade 4 μmol de fotões m-2 s-1 e as intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1, sendo que entre estas duas últimas a expressão foi semelhante. A maior expressão deu-se na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii, apenas nas duas últimas fases do crescimento a expressão do mcyA foi significativamente diferente entre as várias intensidades luz. Nas duas últimas fases, os níveis de expressão de mcyA nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1 foram inferiores ao nível de expressão a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre as duas intensidades de luz mais altas a expressão foi muito idêntica. A análise da evolução temporal da expressão do gene mcyA em cada intensidade de luz mostrou que em M. aeruginosa, de uma forma geral, a expressão variou sobretudo entre a fase de adaptação e a fase exponencial de crescimento. Os níveis de expressão foram máximos na fase de adaptação nas três intensidades de luz. Em P. agardhii, os níveis de expressão de mcyA ao longo do tempo não variaram igualmente nas três intensidades de luz. Ainda assim, a maior expressão observou-se na fase exponencial de crescimento. Não se verificou correspondência entre a expressão génica e a quantidade de microcistina efectivamente produzida por célula em nenhuma das espécies, pois as alterações verificadas na expressão de mcyA ao longo do tempo não foram acompanhadas por variações no mesmo sentido da quantidade de microcistina por célula. Conclui-se assim, que as intensidades de luz testadas influenciaram tanto o crescimento, como a produção de microcistina, como a expressão do gene mcyA, ainda que de forma diferente em M. aeruginosa e P. agardhii. Revelando que ainda há muitas questões em aberto que necessitam de ser esclarecidas em estudos futuros.
- Avaliação da resistência a antibióticos em estirpes de cianobactérias isoladas de ambientes hídricosPublication . Oliveira, Micaela; Dias, Elsa; Dias, Deodália[PT] Os ambientes hídricos constituem veículos para a emergência e disseminação da resistência a antibióticos. As cianobactérias encontram-se amplamente distribuidas nestes ambientes, estando frequentemente expostas a antibióticos, bactérias resistentes e genes de resistência. Contudo, o seu papel no resistoma hídrico nunca foi investigado. Este trabalho pretendeu avaliar a susceptibilidade de oito estirpes de Microcystis aeruginosa, oito estirpes de Planktothrix agardhii e oito estirpes de Planktothrix mougeotii a diferentes antibióticos (amoxicilina, ceftazidima, ceftriaxona, canamicina, gentamicina, tetraciclina, ácido nalidíxico, norfloxacina e trimetoprim). Para tal, foi utilizado um procedimento baseado no método standard Broth Microdilution para bactérias, no qual as cianobactérias foram expostas a diluições sucessivas de cada antibiótico em meio Z8 (0,0015 mg/L – 1,6 mg/L) e mantidas numa câmara de culturas sob ciclos de 14 horas de luz – com uma intensidade de 16 ± 4 μEm-2 s-1 – e 10 horas de escuro, a uma temperatura de 20 ± 1ºC. O crescimento celular foi seguido durante 14 dias (observação macroscópica, microscópica e leitura da DO450nm) e as concentrações inibitórias mínimas de cada antibiótico (CIMs) foram calculadas para cada estirpe. Nenhuma das estirpes foi susceptível a qualquer das concentrações de ácido nalidíxico e de trimetoprim testadas. Adicionalmente, as estirpes de M. aeruginosa apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina, as estirpes de P. agardhii apresentaram uma susceptibilidade reduzida à norfloxacina e as estirpes de P. mougeotii não foram susceptíveis à amoxicilina nem à norfloxacina e apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina. Foi também pesquisada a presença de genes e de integrões associados à resistência a antibióticos nas cianobactérias em estudo por PCR e posterior sequenciação dos produtos obtidos. Foram encontrados genes de resistência à estreptomicina numa estirpe de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em quatro estirpes de P. mougeotii; genes de resistência às sulfonamidas em quatro estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em cinco estirpes de P. mougeotii; integrões de classe 1 em duas estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em três estirpes de P. mougeotii. Adicionalmente, o gene qacE foi encontrado numa estirpe de M. aeruginosa e numa estirpe de P. agardhii. Os resultados obtidos sugerem que as cianobactérias apresentam resistência intrínseca a alguns antibióticos e que, de acordo com o seu local de origem, podem apresentar resistência adquirida a outros. Assim, tudo indica que, de facto, as cianobactérias desempenham um papel importante no resistoma hídrico.
- Biofilmes polimicrobianos em águas ornamentais, potenciais riscos para a saúde pública e estratégias de prevençãoPublication . Meneses, Madalena; Jordão, Luìsa; Rodrigues, AntónioAs águas ornamentais podem funcionar como reservatórios de microrganismos patogénicos, constituindo um risco para a saúde pública. Este trabalho tem, como principal objetivo, avaliar a capacidade de produção de biofilmes in vitro, por bactérias potencialmente patogénicas para o Homem, isoladas de águas ornamentais. As bactérias do estudo pertencem aos géneros Escherichia, Pseudomonas, Aeromonas e Klebsiella e foram caraterizadas segundo o crescimento a diferentes temperaturas, o tempo de geração, a temperatura ótima de crescimento e a capacidade de produção de biofilmes. A última foi determinada pelo método de cristal violeta, para bactérias isoladas ou em consórcios binários, de isolados do mesmo mês de colheita (co-existentes no ambiente) ou de meses distintos. Adicionalmente, foram comparados, qualitativa e estatisticamente, os resultados do método de cristal violeta (método convencional) e de impedância elétrica (método inovador), na determinação do efeito de Aeromonas spp., ou do seu sobrenadante, em biofilmes de Klebsiella pneumoniae. A maioria dos isolados demonstrou crescimento a todas as temperaturas (5, 25, 37 e 45 ºC) e todos cresceram preferencialmente a 25 e 37 ºC, tendo apresentado tempos de geração inferiores a 88,8 minutos. Quanto à capacidade de formação de biofilme, 25 % dos isolados foram classificados como não produtores ou produtores fracos, 40 % como produtores moderados e 10 % como fortes produtores de biofilme. Em biofilmes binários, 90 % das interações entre bactérias co-existentes no ambiente foram competitivas, contudo, existiu uma maior competição em co-culturas de isolados de meses distintos de colheita. Na comparação entre os dois métodos, a análise qualitativa e a análise estatística apresentaram relações distintas (direta e inversa, respetivamente). Em suma, estes resultados sugeriram que 75 % dos isolados apresentaram capacidade para produzir biofilmes in vitro, o que amplia o risco de infeções no Homem. É, assim, crucial, a tomada de medidas de controlo dos biofilmes no ambiente.
- Evaluation of the physiologic response of heterotrophic bacteria present in aquatic environments to the presence of microcystinsPublication . Andrade, Joana; Valério, Elisabete; Reis, Ana Maria GonçalvesMicrocystins (MC) are the hepatotoxins produced by cyanobacteria, which are photosynthetic organisms that usually colonize aquatic environments. Climate change has had a significant impact on the increased frequency of cyanobacterial blooms, which are often associated with the production of cyanotoxins. Studies show that the growth of aquatic heterotrophic bacteria that co-occur with cyanobacteria may not be affected by the presence of MC, or, on the other hand they may present a reduction in growth, never being totally inhibited by their presence (Miguéns, 2013; Pinto, 2016). The aim of this study was to examine the effects of three microcystin variants (MCLR, MCRR, MCYR) on heterotrophic aquatic bacteria living in the same ecosystem as cyanobacteria. In particular, (1) to observe the impact of microcystins on the growth of heterotrophic bacteria, (2) the impact on the enzymes of the antioxidant system of these bacteria and (3) to screen the presence of mlr genes. For this purpose, we performed the morphological and molecular characterization of 22 bacteria isolated from two reservoirs. It was intended to analyze the growth of bacterial isolates exposed to different concentrations of extract of each variant of MCs, and also to two concentrations of pure microcystin-LR. The search for the presence of MCs degradation genes (mlrA-D), was done using PCR. In order to analyze the effect of microcystins on the antioxidant system of the isolates, catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD1 and SOD2) activities were determined spectrophotometrically, at 240 nm and 550 nm, respectively, in the cells exposed to the different variants of microcystin. None of the isolates grown in liquid medium was completely inhibited by the exposure to microcystins, however, it was found that MCs can reduce the growth of most bacteria tested. While some bacteria grew without any induced effect, others reacted differently according to the variant and the concentration (in the same isolate). In some cases a slight growth stimulation was observed. In most cases the growth stimulation appears to be related with other molecules from the MC extracts. The results of the determination of CAT and SOD activities revealed that only three isolates have catalase, namely M17F, M17K and 594196, and only three isolates have superoxide dismutase, M17C, M17D and 594196. In this study, a heterotrophic bacteria, M17C, mlr+, was also isolated, mlr genes were amplified and sequenced. A new primer pair for the mlrA was also proposed in this study. In summary, the results from this study, showed that there is not a pattern characteristic of the species or genera analyzed, thus indicating that the response of the heterotrophic bacteria isolates to MCs is mainly related to strain characteristics. They corroborate previous studies, which indicate that the cluster of mlr genes is not the only cause to allow bacteria to grow in the presence of MC without being affected by them, even with no alteration in the main enzymes from the antioxidant system (CAT and SOD).
- Explorando a razão de bactérias do meio aquático não serem afetadas por microcistinas: sistema antioxidante vs. degradaçãoPublication . Pinto, André; Valério, Elisabete; Rebelo, Maria TeresaAs microcistinas são a classe de hepatotoxinas mais vulgarmente produzidas por cianobactérias. Estas são encontradas em ecossistemas aquáticos onde convivem com outros microorganismos, tais como Aeromonashydrophila e Flavobacteriumsp. Já existe uma quantidade razoável de estudos sobre o efeito de microcistinas em organismos eucarióticos, mas existem poucos estudos sobre os efeitos destas toxinas em microorganismos. Os escassos estudos existentes mostram que as microcistinas podem causar uma diminuição do crescimento microbiano, nâo o inibindo completamente. Neste estudo, o objectivo é determinar a razão pela qual bactérias heterotróficas aquáticas não são muito afectadas pela presença de microcistinas no seu meio de crescimento. Para tal, a actividade de algumas enzimas do sistema antioxidante foram avaliadas e a presença de genes responsáveis pela degradação das microcistinas (mlrA-D) foi avaliada em isolados recuperados a partir de água doce onde as microcistinas são comumente encontradas. Estes resultados foram comparados com as bases pré-existentes na literatura para avaliar a importância da presença ou ausência dos genes responsáveis pela degradação microcistinas com a resistência natural encontradas nas bactérias heterotróficas aquáticas. Além disso, a actividade das enzimas do sistema antioxidante também foi contabilizada para explicar este comportamento.Os comportamentos observados parecem indicar que estão mais relacionados com especificidades da estirpe, não havendo um comportamento similar entre os isolados da mesma espécie. Devido ao facto deste tema de trabalho se inserir numa área ainda pouco explorada, existem atualmentemais questões do que respostas. Contudo, não se pode deixar de destacar a relevância do tema, devido à necessidade de perceber o impacto da presença das cianotoxinas nos ecossistemas do meio aquático.
- Fungos em areias e águas costeiras e interiores em Portugal: relevância para a saúde humana e bem-estarPublication . Brito, Sara; Valério, Elisabete; Dias, DeodáliaOs fungos filamentosos e as leveduras são omnipresentes na natureza, incluindo nas zonas balneares. A areia frequentada por pessoas e por animais tem uma população crescente de fungos específicos de humanos e específicos de animais, em comparação com a areia não frequentada por pessoas e animais. Contudo, certas espécies de fungos podem causar infeções ou alergias em humanos. Estudos anteriores mostraram que existem microrganismos patogénicos ou patogénicos oportunistas que sobrevivem e crescem na areia. O conjunto de doenças resulta da inalação e da ingestão de esporos fúngicos e de células vegetativas, ou do contato direto com células fúngicas. Uma vez que as zonas balneares são locais frequentados por um elevado número de pessoas, especialmente no verão, a qualidade microbiológica das areias e das águas balneares é particularmente importante. Assim sendo, o objetivo deste estudo é a recolha de dados sobre as espécies de fungos existentes nas três zonas balneares em estudo – Carcavelos, Alburrica e Praia Verde. A identificação dos isolados foi realizada através da observação de caracteres morfológicos e através de ferramentas moleculares. Para isto, foram analisadas 18 amostras de areia e 18 amostras de água. No total, nas amostras de areia foram identificados 1 538 isolados, ao passo que nas amostras de água foram identificados 180 isolados. Os isolados fúngicos detetados com mais frequência foram Cladosporium sp. (na Praia Verde e em Alburrica) e Acremonium kiliense (em Carcavelos). Foram também identificadas algumas espécies responsáveis por causar alergias e infeções, tais como Exophiala dermatitidis, Alternaria alternata, Trematosphaeria grisea e Aspergillus nidulans. No entanto, não foi possível identificar 19 isolados presentes nas amostras. A realização desta dissertação permitiu identificar os isolados fúngicos presentes nos locais em estudo, assim como a frequência de cada uma das espécies presente nas amostras. Permitiu também verificar a presença de determinadas espécies que podem provocar doenças graves, o que representa um risco para a saúde dos utilizadores das praias.
- Impact of microcystins on the growth and antioxidant system of aquatic bacteriaPublication . Miguéns, Diana; Valério, Elisabete; Reis, Ana[EN] Microcystins (MC) are the type of hepatotoxins more abundantly produced by cyanobacteria. Studies have shown that these toxins affect many multicellular organisms that inhabit aquatic ecosystems, however their impact on bacteria that cohabit with freshwater cyanobacteria is still unclear. In this work the impact of three variants of the MC (-LR,-RR,-YR) was evaluated on growth and antioxidant system of heterotrophic bacteria isolated from three Portuguese reservoirs where blooms of cyanobacteria are often observed, some having microcystin-producing strains, and also in bacteria isolated from a reservoir where these phenomena do not occur. To this end, morphological and molecular characterization of the bacterial isolates was proceeded and these bacteria were exposed to three different concentrations of each variant of the MC, and the effect on the bacterial growth curves was evaluated. The enzymatic activity of catalase (CAT) and SuperOxide Dismutase (SOD1 and SOD2) was determined spectrophotometrically at 240 nm and 550 nm, respectively, in cells exposed to the microcystin variants. It was found that MC can reduce the growth of most bacteria tested (62.5%), and some bacterial cultures grown with no effect (37.5%), while others reacted differently depending on the variant and concentration used on the same isolate. However, in two isolated bacteria a slight stimulation of growth was observed, although with no statistical significance. The results of the determination of CAT and SOD activities showed that the bacterial isolates were susceptible to 10 nM of each variant MC. In all strains tested there was an increase in CAT activity and, in relation to the SOD1 and SOD2 activities it was observed that, most bacteria had an increase of the each SOD activity when exposed to MC. However, not all isolates showed effects on SOD1 or SOD2 activities in the three variants of the MC used. This study showed that MCs can induce a reduction on the growth of most bacteria isolated from freshwater. In respect to the antioxidant system enzymes, all results point out that microcystins can induce oxidative stress in the bacteria tested and that CAT and SOD activities were activated as a defense mechanism to scavenge reactive oxygen species (ROS) increment.