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- Avaliação da expressão de genes envolvidos na síntese de microcistinas em cianobactérias tóxicas sujeitas a diferentes intensidades de luzPublication . Salvador, Daniel; Valério, Elisabete; Dias, Deodália[PT] As cianobactérias são um grupo de microrganismos fitoplanctónicos, procariotas unicelulares, aeróbios e autotróficos. Encontram-se difundidos numa ampla variedade de habitats, ainda assim, são especialmente comuns em ambientes de água doce. A maioria das espécies existe normalmente em baixas concentrações no ambiente, no entanto, quando as condições ambientais são favoráveis, as células podem proliferar massivamente, levando à formação de florescências (blooms). Os blooms são um problema bastante actual e crescente em todo o mundo, dado que por vezes podem ser tóxicos e causar intoxicações e até a morte. A sua toxicidade resulta da capacidade que algumas espécies de cianobactérias produzirem toxinas. Dos vários grupos de cianotoxinas, as hepatotoxinas são umas das que mais frequentemente estão relacionadas com intoxicações. Deste grupo, as microcistinas são as mais comuns em corpos de água doce portugueses. A crescente consciencialização dos seus riscos tem resultado em vários estudos para compreender o seu mecanismo de síntese e os factores que podem regular/influenciar o mesmo. A síntese das microcistinas é não ribossomal, a partir de um mecanismo característico de tio-molde, e utilizando complexos multienzimáticos codificados pelos genes mcy. Relativamente aos factores regulatórios, diversos estudos têm vindo a demonstrar que os factores ambientais podem induzir alterações na concentração/produção de cianotoxinas, designadamente o pH, a concentração/proporção de nutrientes, a temperatura e a intensidade de luz. No entanto a informação existente não é consensual. Assim, este estudo tem como objectivo principal avaliar a influência da intensidade de luz na transcrição do gene mcyA e correspondente produção de microcistina em diferentes cianobactérias tóxicas. Simultaneamente pretendeu-se avaliar a influência das diferentes intensidades de luz na taxa de crescimento e ainda avaliar diferentes genes de referência para a normalização da expressão génica, obtida em RT-qPCR. Foram utilizados dois isolados produtores de microcistina - Microcystis aeruginosa (LMECYA 7) e Planktothrix agardhii (LMECYA 256). As culturas foram expostas durante 18 dias a três diferentes intensidades de luz (4, 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1) a uma temperatura de 20 ± 1ºC. Diariamente recolheram-se amostras para avaliar o crescimento das culturas, através da medição da densidade óptica. Em cada fase do crescimento colheram-se também amostras (três vezes) para efectuar a contagem celular, quantificação das microcistinas pela técnica de ELISA e extracção de RNA. Neste trabalho foi avaliada a expressão do gene mcyA pertencente ao cluster mcy, por RT-qPCR. Para além disso, foram ainda estudados genes de referência (rRNA 16S, gltA e rpoC1). Verificou-se uma correlação entre a taxa de crescimento e a intensidade de luz, quer em M. aeruginosa, quer em P. agardhii. As taxas de crescimento em ambas as espécies foram menores a 4 μmol de fotões m-2 s-1 e maiores a 30 μmol de fotões m-2 s-1. As diferenças foram mais acentuadas entre o crescimento na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1 e o crescimento nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre estas últimas duas intensidades a taxa foi bastante semelhante. O efeito das diferentes intensidades de luz foi mais acentuado em M. aeruginosa do que em P. agardhii. As concentrações de microcistina por célula em M. aeruginosa foram semelhantes entre intensidades de luz, sobretudo nas duas primeiras fases do crescimento. Apenas na fase estacionária as concentrações de toxina diferiram consideravelmente, tendo a maior produção ocorrido a 30 μmol de fotões m-2 s-1 e a menor a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii houve maiores diferenças na concentração de microcistina por célula entre intensidades de luz e fases do crescimento. A maior produção ocorreu a 4 μmol de fotões m-2 s-1 na fase estacionária e a menor a 20 μmol de fotões m-2 s-1 na fase exponencial de crescimento. Relativamente à estabilidade dos genes de referência, o gene rRNA 16S foi o menos estável em M. aeruginosa, mas o mais estável em P. agardhii, tendo em conta os algoritmos geNorm e NormFinder. O gene rpoC1 foi o mais estável em M. aeruginosa e o menos estável em P. agardhii, tendo em consideração os mesmos algoritmos. Usando o algoritmo BestKeeper, o gene gltA foi classificado como o mais estável em ambas as espécies. Utilizaram-se assim os genes rpoC1 e gltA em M. aeruginosa e os genes rRNA 16S e gltA em P. agardhii na normalização da expressão do gene mcyA. A expressão do gene mcyA nas três fases do crescimento em M. aeruginosa foi sempre significativamente diferente entre a intensidade 4 μmol de fotões m-2 s-1 e as intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1, sendo que entre estas duas últimas a expressão foi semelhante. A maior expressão deu-se na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii, apenas nas duas últimas fases do crescimento a expressão do mcyA foi significativamente diferente entre as várias intensidades luz. Nas duas últimas fases, os níveis de expressão de mcyA nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1 foram inferiores ao nível de expressão a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre as duas intensidades de luz mais altas a expressão foi muito idêntica. A análise da evolução temporal da expressão do gene mcyA em cada intensidade de luz mostrou que em M. aeruginosa, de uma forma geral, a expressão variou sobretudo entre a fase de adaptação e a fase exponencial de crescimento. Os níveis de expressão foram máximos na fase de adaptação nas três intensidades de luz. Em P. agardhii, os níveis de expressão de mcyA ao longo do tempo não variaram igualmente nas três intensidades de luz. Ainda assim, a maior expressão observou-se na fase exponencial de crescimento. Não se verificou correspondência entre a expressão génica e a quantidade de microcistina efectivamente produzida por célula em nenhuma das espécies, pois as alterações verificadas na expressão de mcyA ao longo do tempo não foram acompanhadas por variações no mesmo sentido da quantidade de microcistina por célula. Conclui-se assim, que as intensidades de luz testadas influenciaram tanto o crescimento, como a produção de microcistina, como a expressão do gene mcyA, ainda que de forma diferente em M. aeruginosa e P. agardhii. Revelando que ainda há muitas questões em aberto que necessitam de ser esclarecidas em estudos futuros.