DDI - Dissertações de mestrado
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- Avaliação da resistência a antibióticos em estirpes de cianobactérias isoladas de ambientes hídricosPublication . Oliveira, Micaela; Dias, Elsa; Dias, Deodália[PT] Os ambientes hídricos constituem veículos para a emergência e disseminação da resistência a antibióticos. As cianobactérias encontram-se amplamente distribuidas nestes ambientes, estando frequentemente expostas a antibióticos, bactérias resistentes e genes de resistência. Contudo, o seu papel no resistoma hídrico nunca foi investigado. Este trabalho pretendeu avaliar a susceptibilidade de oito estirpes de Microcystis aeruginosa, oito estirpes de Planktothrix agardhii e oito estirpes de Planktothrix mougeotii a diferentes antibióticos (amoxicilina, ceftazidima, ceftriaxona, canamicina, gentamicina, tetraciclina, ácido nalidíxico, norfloxacina e trimetoprim). Para tal, foi utilizado um procedimento baseado no método standard Broth Microdilution para bactérias, no qual as cianobactérias foram expostas a diluições sucessivas de cada antibiótico em meio Z8 (0,0015 mg/L – 1,6 mg/L) e mantidas numa câmara de culturas sob ciclos de 14 horas de luz – com uma intensidade de 16 ± 4 μEm-2 s-1 – e 10 horas de escuro, a uma temperatura de 20 ± 1ºC. O crescimento celular foi seguido durante 14 dias (observação macroscópica, microscópica e leitura da DO450nm) e as concentrações inibitórias mínimas de cada antibiótico (CIMs) foram calculadas para cada estirpe. Nenhuma das estirpes foi susceptível a qualquer das concentrações de ácido nalidíxico e de trimetoprim testadas. Adicionalmente, as estirpes de M. aeruginosa apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina, as estirpes de P. agardhii apresentaram uma susceptibilidade reduzida à norfloxacina e as estirpes de P. mougeotii não foram susceptíveis à amoxicilina nem à norfloxacina e apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina. Foi também pesquisada a presença de genes e de integrões associados à resistência a antibióticos nas cianobactérias em estudo por PCR e posterior sequenciação dos produtos obtidos. Foram encontrados genes de resistência à estreptomicina numa estirpe de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em quatro estirpes de P. mougeotii; genes de resistência às sulfonamidas em quatro estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em cinco estirpes de P. mougeotii; integrões de classe 1 em duas estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em três estirpes de P. mougeotii. Adicionalmente, o gene qacE foi encontrado numa estirpe de M. aeruginosa e numa estirpe de P. agardhii. Os resultados obtidos sugerem que as cianobactérias apresentam resistência intrínseca a alguns antibióticos e que, de acordo com o seu local de origem, podem apresentar resistência adquirida a outros. Assim, tudo indica que, de facto, as cianobactérias desempenham um papel importante no resistoma hídrico.
- Avaliação da resistência de Trichophyton rubrum ao antifúngico terbinafina e caracterização fenotípica e genotípica de fungos dermatófitosPublication . Henriques, Camila Valadas; Sabino, Raquel; Dias, DeodáliaOs dermatófitos são um grupo de fungos filamentosos com uma distribuição cosmopolita, que têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados (pele, cabelo e unhas) de humanos e outros animais e provocar uma infeção superficial denominada de dermatofitose. As dermatofitoses são responsáveis por 3 - 4% dos casos afeções dermatológicas, sendo a infeção superficial mais comum em humanos (com uma prevalência entre os 20-25%). No entanto, espera-se que a sua prevalência continue a aumentar devido ao aparecimento de novos fatores de risco. As espécies do género Trichophyton são os principais agentes causadores de patologias como pé de atleta e onicomicose nas mãos e pés e estima-se que afete ~1.000.000.000 de pessoas em todo o mundo. T. rubrum e T. interdigitale são os principais agentes etiológicos com prevalências de 80% e 20%, respetivamente. Em Portugal, é estimado que 1.510.391 de portugueses sofram de dermatofitoses, correspondendo a uma incidência de 14.300 infeções por dermatófitos por cada 1.000.000 de habitantes. Para o tratamento das dermatofitoses, a primeira terapia a ser prescrita é, na grande maioria dos casos, a terbinafina. Desde 2017 que os casos de resistência a este antifúngico por parte de T. rubrum e T. interdigitale têm vindo a aumentar gradualmente. Os mecanismos de resistência à terbinafina são, essencialmente, descritos como mutações pontuais no gene que codifica a esqualeno epoxidase. Assim, neste estudo, procurámos perceber se a problemática de resistência ao antifúngico terbinafina em T. rubrum e T. interdigitale estaria ou não negligenciada em Portugal. Cento e sessenta e quatro isolados de T. rubrum e T. interdigitale foram identificados até à espécie através de tecnologias moleculares e também com recurso a espectoctrometria de massa (MALDI-TOF). De seguida, verificámos a presença da resistência ao antifúngico terbinafina nestes isolados e pesquisámos as mutações associadas a essa mesma resistência. Para tal, procedemos à otimização e implementação de metodologias que permitiram efetuar a avaliação da resistência de isolados de T. rubrum e T. interdigitale, quer por método cultural quer por metodologias moleculares com sequenciação do gene da esqualeno epoxidase (SQLE) seguida de deteção de mutações neste gene que conferem resistência a este composto. A caracterização dos padrões de suscetibilidade ao antifúngico terbinafina foi feita recorrendo a meios de screening (agar suplementado com terbinafina) e ao método das microdiluições em caldo. Numa primeira abordagem, de 102 isolados de T. rubrum, apenas 1 isolado (nº126) revelou ser resistente á terbinafina por meio de screening e dos 17 isolados T. interdigitale, apenas 3 demonstraram ser resistentes à terbinafina por meio de screening em ambas as concentrações utilizadas definidas pela norma EUCAST (0.06 mg/L e 0.125 mg/L). De acordo com a metodologia das microdiluições, 2,44% dos isolados apresentaram menor suscetibilidade à terbinafina. Os nossos resultados demonstram que o isolado nº126 (T. rubrum) revelou ser bastante resistente à terbinafina com uma CMI de 8 mg/L, os isolados nº 63 e nº94 (T. interdigitale) apresentaram CMIs superiores a 8 mg/L o que representa uma baixa suscetibilidade à terbinafina. O isolado T. interdigitale nº 59 apresentou uma CMI igual a 1 mg/L o que revela uma resistência moderada à terbinafina. A otimização da PCR de amplificação e sequenciação do gene da SQLE de T. rubrum e T. interdigitale permitiu a deteção de mutações pontuais apenas num isolado de cada espécie num total de quatro isolados classificados como resistentes. O isolado T. rubrum nº126, após análise da sequência do gene da SQLE, apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE o que corresponde a uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma isoleucina. Apesar de as substituições mais comuns e que levam a uma maior resistência à terbinafina serem L393F e F397L, a substituição F397I detetada no isolado T. rubrum deste estudo, sugere causar uma elevada resistência à terbinafina. Relativamente aos isolados resistentes T. interdigitale, apenas o isolado nº 94 apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE, ocorrendo uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma leucina, o que confirma a sua CMI superior a 8 mg/L. Nos restantes isolados resistentes pertencentes à espécie T. interdigitale, não foram encontradas quaisquer mutações no gene que codifica a SQLE. Este estudo, permitiu-nos efetuar uma caracterização da população amostrada, das amostras biológicas e dos isolados do género Trichophyton obtidos por cultura destas amostras. Foi também possível detetar, pela primeira vez, isolados do género Trichophyton resistentes à terbinafina em Portugal. Foi ainda possível estimar, dentro dos isolados estudados, uma frequência de resistência de 2,44%. A resistência à terbinafina por parte de T. rubrum e T. interdigitale é um problema real em todo o mundo e estima-se que os casos continuem em aumentar e por isso acreditamos que, a aplicação do método de screening e das microdiluições bem como a implementação da reação de PCR para pesquisa de mutações que conferem essa mesma resistência será uma mais valia e um contributo importante no que toca ao diagnóstico e posterior terapia das dermatofitoses reportadas em Portugal.
- Evolução da resistência aos antibióticos em estirpes isoladas de diferentes reservatóriosPublication . Graça, Rafael; Caniça, Manuela; Dias, DeodáliaA resistência aos antibióticos é um problema global e atual. O uso e mau uso de antibióticos não só em medicina humana e veterinária, mas também no ambiente, são fatores responsáveis pela emergência e disseminação de bactérias multirresistentes. A difusão das β-lactamases de espectro alargado (ESBL) constitui o principal mecanismo de resistência às cefalosporinas de 3ª geração em bactérias de Gram-negativo. Atualmente, as ESBL, particularmente as produtoras de CTX-M, têm emergido em diferentes reservatórios (animal, homem e ambiente). A produção de CTX-M, concomitantemente com a resistência a outras classes de antibióticos, ou mesmo por coprodução de outras β-lactamases (como as carbapenemases), tem constituído uma forma das bactérias se tornarem multirresistentes. No sentido de avaliar a evolução da resistência aos antibióticos em estirpes de Escherichia coli isoladas de diferentes reservatórios, este trabalho teve como objetivos específicos: a) investigar a diversidade das β-lactamases produzidas por 68 isolados de origem humana e animal e avaliar a sua suscetibilidade às diferentes classes de antibióticos; b) caracterizar a estrutura-função da nova enzima CTX-M-166 e estudar as suas consequências fenotípicas. Para alcançar estes objetivos, foi utilizada uma combinação de métodos fenotípicos, de biologia molecular e bioquímicos. A caracterização molecular dos mecanismos de resistência permitiu identificar uma grande diversidade de β-lactamases: penicilinases (TEM-1 e OXA-tipo); ESBLs da família CTX-M [CTX-M-1, CTX-M-14, CTX-M-15 (mais prevalente), CTX-M-27, CTX-M-32 e CTX-M-166 (nova variante)], TEM (TEM-52) e SHV (SHV-12); resistentes aos inibidores (TEM-30/IRT-2); e AmpCs plasmídicas (CMY-2 e DHA-1). Foram também identificados genes plasmídicos de resistência às fluoroquinolonas: aac(6’)-Ib-cr e qnrB 19. Dos 68 isolados analisados, 75% revelaram ser multirresistentes. A determinação das constantes cinéticas da CTX-M-166, identificada num isolado de origem animal, permitiu verificar uma diminuição na eficiência catalítica (kcat/Km), em comparação com a CTX-M-1. Contudo, a substituição aminoacídica Ala120Val contribuiu para o aumento da afinidade (Km) para a penicilina G, piperacilina, cefotaxima e ceftiofur, sendo este último antibiótico exclusivamente utilizado em medicina veterinária. Em conclusão, este estudo evidenciou uma grande diversidade de β-lactamases em isolados de E. coli de vários reservatórios, e uma elevada prevalência de multirresistência. Contribuiu ainda para uma melhor compreensão da evolução das propriedades catalíticas das enzimas CTX-M.
- Infeção invasiva por Haemophilus influenzae: caracterização fenotípica e molecular e estudo da virulência de estirpes isoladas em PortugalPublication . Heliodoro, Catarina Isabel Moreira; Lavado, Maria Paula Bajanca; Dias, DeodáliaHaemophilus influenzae é um microrganismo responsável por infeções invasivas graves no Homem, apesar de ser frequentemente encontrado como colonizador do trato respiratório. Este agente patogénico é dinâmico e a sua epidemiologia tem vindo a mudar desde a introdução da vacina nos anos 90. Até à data, foram identificados 6 tipos capsulares (a-f), apesar de a maioria das estirpes caracterizadas atualmente serem não capsuladas (HiNC). Estudos anteriores caracterizaram a doença invasiva em Portugal, entre 1989-2001 e entre 2002-2010. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e molecularmente os isolados clínicos de doença invasiva em Portugal, durante um período de 6 anos (2011-2016), e comparar os resultados obtidos com os de estudos realizados anteriormente, bem como identificar a presença/ausência de 6 dos fatores de virulência destas estirpes. Durante o período de estudo considerado foram analisadas 174 estirpes invasivas, provenientes de 32 hospitais. A cápsula e o serotipo capsular foram identificados e caracterizados através de amplificação por PCR. A produção de β-lactamase foi pesquisada com nitrocefin, e a suscetibilidade aos antibióticos foi determinada pelo método da microdiluição em placa, de acordo com as diretrizes do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). De modo a avaliar a relação genética entre os isolados, foi realizada a técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST), para amplificar e sequenciar os fragmentos internos dos 7 genes ‘housekeeping’ – adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi, e recA. O sequence type (ST) foi atribuído através da base de dados de MLST para H. influenzae (https://pubmlst.org/hinfluenzae/), e as distâncias alélicas entre os STs foram representadas através da análise do algoritmo goeBURST, na plataforma PHYLOViZ. A presença/ausência dos fatores de virulência pilA, ompP5, hmw1A/hmw2A, hifA, e hia foi determinada por amplificação por PCR. As estirpes HiNC foram as principais responsáveis por doença invasiva (143/174; 82%); no entanto, 31 estirpes (31/174; 17,8%) eram capsuladas e foram caracterizadas como: 4 do serotipo a (2,3%), 21 do serotipo b (12,1%), 2 do serotipo e (1,1%), e 4 do serotipo f (2,3%). A maior parte das estirpes eram suscetíveis aos antibióticos estudados, com 12% (21/174) de estirpes resistentes à ampicilina por produção de β-lactamase. O MLST foi realizado para 136 estirpes e revelou elevada variabilidade genética entre 106 HiNC, com 71 STs diferentes (71/106; 67%). Pelo contrário, as estirpes capsuladas eram clonais: Hib-ST6 e ST-190, Hia-ST23, Hie-ST18, e Hif-ST124. Em Portugal, as estirpes HiNC suscetíveis aos antibióticos e apresentando elevada diversidade genética são as principais responsáveis pela doença invasiva a H. influenzae, apesar de estirpes Hib ainda circularem numa percentagem considerável no nosso país. Estirpes do serotipo não-b têm vindo a emergir, após a introdução da vacina contra o Hib, nomeadamente os serotipos a e f. Os fatores de virulência estudados, essenciais na fase de adesão ao hospedeiro, não se encontram obrigatoriamente em todas as estirpes e a sua presença não está associada a uma maior gravidade da infeção. No entanto, eventos como recombinação genética, ou variação de fase, estão entre os fatores que mais contribuem para o fitness do microrganismo, aquando da colonização da nasofaringe, contribuindo para uma maior patogenicidade, principalmente das estirpes HiNC. Devido à sua dinâmica evolutiva, é necessária a continuação da vigilância da doença invasiva a H. influenzae em Portugal, para que se possam desenvolver estratégias de prevenção adequadas.
- Mecanismos de resistência aos antibióticos em bactérias de Gram negativo com susceptibilidade diminuida aos carbapenemes: caracterização laboratorialPublication . Simões, Constança; Caniça, Manuela; Dias, DeodáliaOs carbapenemes são antibióticos β-lactâmicos utilizados como último recurso no tratamento de infeções causadas por bactérias de Gram negativo. Considerando a emergência da resistência a estes antibióticos, importa esclarecer os mecanismos que estão na origem desta diminuição de suscetibilidade. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar, laboratorialmente, os mecanismos responsáveis pela resistência aos carbapenemes em isolados clínicos de Gram negativo, a sua multirresistência, e as vias implicadas na possível disseminação dessa resistência. Dos 426 isolados estudados, foram identificados 22 (5%) com suscetibilidade diminuída ao ertapeneme, os quais foram retidos para a restante investigação. Assim, com os testes de suscetibilidade aos antibióticos realizados, verificou-se que 4% dos isolados apresentavam multirresistência aos antibióticos, tendo ainda permitido predizer mecanismos de resistência responsáveis pelos fenótipos encontrados, e orientar os estudos bioquímicos e moleculares. Estas duas últimas abordagens metodológicas identificaram e caraterizaram a expressão de carbapenemases (3 KPC- 3 e 1 GES-5) e/ou a expressão de β-lactamases de espectro alargado (ESBL) ou AmpC (MIR-tipo). Em 21 isolados foi identificada a alteração aminoacídica das principais porinas (por inserção, deleção e/ou substituição): OmpK35, OmpK36, OmpK37 (Klebsiella pneumoniae), OmpC, OmpF (Escherichia coli, Enterobacter cloacae e Enterobacter cancerogenus), Omp35 e Omp36 (Enterobacter aerogenes). A ESBL predominante foi a β-lactamase CTX-M-15 (n=11) em co-expressão com OXA-1 e TEM-1, bem como a enzima Aac(6’)-Ib-cr (n=8) e OqxAB (n=5); um isolado coexpressava a ESBL SHV-12 e GES-5. Foram identificadas outras β-lactamases, como SHV-1, SHV-11 e SHV-32. Se E. coli pertencia à sequência tipo ST131, estirpe pandémica, já K. pneumoniae apresentou diversidade genética, destacando-se 2 isolados com ST147, disseminado em vários países, e o novo ST1138. Globalmente, este estudo dá um contributo muito importante para o conhecimento dos mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenemes (cuja disseminação clonal e horizontal é preocupante), nomeadamente em isolados com multirresistência, realçando-se a resistência plasmídica às fluoroquinolonas.