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- Base molecular da hemocromatose hereditária não-clássica em PortugalPublication . Faria, Ricardo; Silva, Bruno; Silva, Catarina; Loureiro, Pedro; Queiroz, Ana; Esteves, Jorge; Mendes, Diana; Fleming, Rita; Vieira, Luís; Gonçalves, João; Lavinha, João; Faustino, PaulaA Hemocromatose Hereditária (HH) é uma doença autossómica recessiva caracterizada pela absorção excessiva de ferro a nível intestinal e sua acumulação em órgãos vitais, podendo originar cardiomiopatia, cirrose e carcinoma hepatocelular. O correspondente diagnóstico molecular é obtido pela associação com genótipos específicos no gene HFE (homozigotia para p.Cys282Tyr ou heterozigotia composta p.Cys282Tyr/p.His63Asp). Contudo, nos países do sul da Europa, cerca de um terço dos doentes com diagnóstico clínico de HH não apresenta os referidos genótipos. Para identificar a base molecular da HH não-clássica em Portugal usaram-se metodologias de pesquisa geral de variantes genéticas (SSCP e dHPLC), Next-Generation Sequencing (NGS) e sequenciação de Sanger, cobrindo seis genes relacionados com o metabolismo do ferro em 303 doentes. Identificaram-se 69 variantes diferentes e de vários tipos, por ex. missense, nonsense, de splicing, que perturbam a transcrição do gene ou a regulação da tradução do mRNA. Seguidamente, realizaram-se estudos in silico e in vitro para esclarecer o significado etiológico de algumas das novas variantes. Concluiu-se que a base molecular desta patologia é bastante heterogénea e que a NGS é uma ferramenta adequada para efetuar a análise simultânea dos vários genes num grande número de amostras. Contudo, o estabelecimento da relevância clínica de algumas variantes requer a realização de estudos funcionais.
- Doença da Ferroportina - A propósito de um caso clínicoPublication . Novo, Elena; Faria, Ricardo; Faustino, Paula; Fleming, RitaIntrodução: A Hemocromatose Hereditária tipo 4 (HH-4), também designada Doença da Ferroportina é uma doença genética de sobrecarga em ferro devida a alteração da proteína ferroportina que tem como função a exportação de ferro das células e é alvo de regulação negativa pela hormona hepcidina. A patologia ocorre por mutações no gene SLC40A1, tem transmissão autossómica dominante, fenotipicamente heterogénea com 2 subtipos (forma A e B) e prevalência mundial <1/1.000.000. Objetivo: A HH-4 pertence ao grupo das Doenças Raras (cerca de 200 casos descritos mundialmente); procede-se à descrição do caso clínico de doente enviada à consulta de Imuno-hemoterapia por hiperferritinémia. Doente e Métodos: Doente do sexo feminino, 41 anos, em que foram estudadas causas de hiperferritinémia, nomeadamente síndroma metabólico, parâmetros inflamatórios, doença hepática crónica, hemólise e aceruloplasmina, cujos resultados foram negativos. Seguiu-se quantificação de ferro hepático por Ressonância Magnética (RM). Perante os resultados, fez-se pesquisa de mutações raras para HH. Iniciou-se Flebotomias.Terapêuticas (FT) de 450cc semanais que passaram a quinzenais para atingir ferritina <50ng/ml. A probanda refere que o pai e uma irmã fazem FT. No estudo genético do pai foi detetada uma mutação em heterozigotia no gene SLC40A1, o que direcionou o estudo genético na doente. Resultados (antes/após 4 FT): Ferritina: 708/553 ng/ml; Saturação transferrina: 27/30 %; ALT: 17/20 U/L;Glicemia: 88/- mg/dl; RM: 85/- μmol/g; Hemoglobina: 13,6/12,5 g/dl. Genética: A análise do gene SLC40A1 revelou heterozigotia para a mutação c.238G>A o que origina a alteração p.Gly80Ser na ferroportina, perda da sua função e acumulação intracelular de ferro. Houve necessidade de espaçar as FT, por rápida baixa de hemoglobina já prevista pela patologia, mantendo-se ainda em fase de indução. Discussão: Perante hiperferritinémia, após eliminar causas de Hemocromatose Secundária, havendo ligeira sobrecarga de ferro hepático e história familiar, diagnosticou-se um caso de Doença da Ferroportina, forma A. Embora a doente apresente um padrão benigno com saturação de transferrina normal e sobrecarga inicial essencialmente a nível das células de Kupffer, optou-se por iniciar FT dada a tendência para aumento de sobrecarga com a idade. l
- Ferroportin Disease (Haemochromatosis-type IV): a case reportPublication . Novo, Elena; Faria, Ricardo; Faustino, Paula; Fleming, RitaIntrodution: Haemochromatosis-type IV, the ferroportin disease, is characterized by an autosomal-dominant transmission and early iron accumulation in macrophages. It is caused by mutations in the transmembrane iron exporter protein ferroportin1 (SLC40A1 gene). In form A (classic), ferroportin loss of function mutants are unable to export iron from cells leading to cellular iron accumulation with decreased availability of iron for serum transferrin (TS). We present a Portuguese rare clinical case of HH-IV. Materials and Methods: A 41-year-old woman with hyperferritinemia and normal TS. Causes of hyperferritinemia (inflammation, chronic alcohol consumption, metabolic syndrome, cell necrosis, non-alcoholic fatty liver disease and aceruloplasminemia) were assessed. Liver iron, evaluated by magnetic resonance imaging (MRI) was carried out. Screening for mutation in HFE and SCL40A1 genes were performed by Sanger sequencing. Baseline: Ferritin:708ng/ml; TS: 27%; MRI:85µmol/g; Hb:13,6g/dl. Therapy: weekly 450ml Therapeutic Phlebotomies (TP) until ferritin≤50ng/ml. Results: Hyperferritinemia comorbidities and common genetic mutations for haemochromatosis were negative. However, sequencing of the patient SLC40A1 gene has revealed the presence in heterozygosity of the variant c.238G>A; p.Gly80Ser. Due to low tolerance to TP, we adopted smaller phlebotomies every three weeks. Conclusion: This patient has a rare autosomal-dominant Ferroportin disease due to a mutated ferroportin which is predicted to be defective in iron cellular export. In agreement, she presents hyperferritinemia, with normal TS and liver iron overload. The genotype/phenotype association allowed to diagnosis this rare FD case. Although a mild form A, we decided to start TP. Her father also has been treated for iron overload.
- Hemocromatose Hereditária Não-Clássica - pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro e estudos funcionais de uma nova variante da proteína hemojuvelinaPublication . Faria, Ricardo; Faustino, Paula; Rivera, Isabel Antolin[PT] O ferro é um dos micronutrientes mais importantes a nível biológico, participando em diversos processos biológicos. Por outro lado, o seu excesso ou défice no organismo estão associados a consequências negativas para a saúde. A Hemocromatose Hereditária (HH) é um distúrbio da regulação da homeostase do ferro caracterizado por uma elevada absorção intestinal de ferro levando à sua acumulação em diversos órgãos. As consequências mais frequentes desta doença são o desenvolvimento de cirrose hepática, carcinoma hepatocelular, cardiomiopatias, artralgias, hiperpigmentação da pele e problemas endócrinos. O gene HFE é o principal gene associado a esta patologia (HH-clássica ou do tipo I). Os genótipos mais frequentes são a homozigotia para a alteração p.C282Y e a heterozigotia composta p.C282Y/p.H63D. No entanto, existem outros genes envolvidos no desenvolvimento de hemocromatose hereditária não clássica. Entre eles, encontra-se o gene TfR2 que codifica o recetor 2 da transferrina, estando associado à hemocromatose hereditária do tipo III e o gene SLC40A1 codificante da ferroportina e associado à hemocromatose hereditária do tipo IV. A forma mais grave de HH é, no entanto, a hemocromatose juvenil (HJ) ou tipo II associada a alterações nos genes que codificam a hemojuvelina (HJV) ou a hepcidina (HAMP). Um dos objetivos do trabalho subjacente a esta dissertação consistiu na implementação no laboratório de uma metodologia de pesquisa rápida, pouco dispendiosa e em larga escala, de alterações em genes relacionados com o metabolismo do ferro. Deste modo, foi possível realizar a identificação e caraterização de mutações em 6 genes relacionados com o metabolismo do ferro (HFE, HJV, HAMP, TfR2, SLC40A1 e FTL) em 88 doentes com sobrecarga em ferro (ferritina sérica superior a 200 ng/mL e saturação de transferrina superior a 60%), e diagnóstico negativo para Hemocromatose Hereditária do tipo I. Os DNAs foram preparados utilizando a metodologia Treu Seq Custum Amplicon e sequenciados recorrendo à tecnologia de Next Generation Sequencing, illumina. Através desta metodologia foram detetadas 1242 alterações correspondentes a 55 variantes genéticas diferentes, 16 das quais não estão descritas nas bases de dados disponíveis. Dessas 5 são potencialmente patogénicas (3 são missense HFE, p.Y230C, TfR2, p.L750V e TfR2, p.A777V; 1 localiza-se numa região de splicing no gene TfR2 (c.967-1 G>C) e 1 localiza-se na região 5’-UTR do gene HAMP (-25 G>A). iii Foram realizados estudos in silico, recorrendo à ferramenta bioinformática PolyPhen-2, de modo a identificar possíveis efeitos que estas mutações poderão ter na estrutura das proteínas resultantes. Para além disso, também se procedeu à análise do impacto da alteração nucleotídica a nível do splicing utilizando o software Human Splicing Finder. Dado o tipo de transmissão autossómica recessiva da hemocromatose hereditária, foi possível, através da metodologia utilizada, justificar a sobrecarga em ferro (estabelecer uma associação genótipo/fenótipo) em 5 dos indivíduos em estudo. O outro objetivo deste trabalho foi dar início ao estudo funcional in vitro da variante p.P124L da proteína HJV em células eucarióticas. Para tal procedeu-se à clonagem do cDNA wild-type HJV no vetor de expressão pEGFP-N1, originando uma proteína de fusão constituída por HJV e GFP (Green Fluorescent Protein). Posteriormente, e recorrendo a microscopia confocal e western-blot será analisada a sua distribuição intracelular na linha celular HeLa transfetada e o seu efeito no processamento da HJV.
- Next Generation Sequencing of six iron-metabolism related genes in Portuguese patients with iron overload and a negative Hereditary Hemochromatosis-first level genetic test: a pilot studyPublication . Faria, Ricardo; Silva, Bruno; Silva, Catarina; Vieira, Luís; Loureiro, Pedro; Gomes, Susana; Gonçalves, João; Fleming, Rita; Faustino, PaulaIntroduction: Hereditary Hemochromatosis (HH) is an autosomal recessive disorder characterized by excessive intestinal iron absorption and iron deposition in several organs leading to cardiac failure, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Molecular diagnosis of HFE-related HH is typically made by searching for specific genotypes (C282Y homozygosity or C282Y/H63D compound heterozygosity), denominated the “first level genetic test”. However, in the Mediterranean area, up to one third of patients with a clinical diagnosis of hemochromatosis do not present those mutations. This pilot study was designed to develop a “second level genetic test” based on next generation sequencing (NGS) for rapid and simultaneous analysis of 6 HH-related genes (HFE, TfR2, HJV, HAMP, SLC40A1 and FTL). A second objective was to establish genotype/phenotype associations. Patients and Methods: A TruSeq Custom Amplicon (TSCA, by Illumina) kit was designed in order to generate 97 amplicons covering exons, intron/exon junctions and UTRs of the mentioned genes with a cumulative target sequence of 12115bp. Amplicons were sequenced in the MiSeq instrument (IIlumina) using 250bp pared-end reads. Sequences were aligned against human genome reference hg19 using alignment and variant caller algorithms in the MiSeq reporter software. Firstly, some controls presenting known mutations were sequenced in order to validate the test. Subsequently, 88 iron overload patients with a negative first level test were studied according to previous conditions. Results: We found a total of 55 variants in the 6 selected genes. These include novel missense and splicing variants, a mutation that originates a novel translation initiation codon, among others. Novel potentially pathogenic variants were validated by Sanger sequencing and their functional significance are currently under study. An unusual clinical case will be presented. Discussion: The merger between TSCA methodology and NGS technology appears to be an appropriate tool for simultaneous and fast analysis of HH-related genes in a large number of samples. However, establishing the clinical relevance of NGS-detected variants for HH development remains a hard-working task, requiring further functional studies.
- Next-generation sequencing of hereditary hemochromatosis-related genes: novel likely pathogenic variants found in the Portuguese populationPublication . Faria, Ricardo; Silva, Bruno; Silva, Catarina; Loureiro, Pedro; Queiroz, Ana; Fraga, Sofia; Esteves, Jorge; Mendes, Diana; Fleming, Rita; Vieira, Luís; Gonçalves, João; Faustino, PaulaHereditary hemochromatosis (HH) is an autosomal recessive disorder characterized by excessive iron absorption resulting in pathologically increased body iron stores. It is typically associated with common HFE gene mutation (p.Cys282Tyr and p.His63Asp). However, in Southern European populations up to one third of HH patients do not carry the risk genotypes. This study aimed to explore the use of next-generation sequencing (NGS) technology to analyse a panel of iron metabolism-related genes (HFE, TFR2, HJV, HAMP, SLC40A1, and FTL) in 87 non-classic HH Portuguese patients. A total of 1241 genetic alterations were detected corresponding to 53 different variants, 13 of which were not described in the available public databases. Among them, five were predicted to be potentially pathogenic: three novel mutations in TFR2 [two missense (p.Leu750Pro and p.Ala777Val) and one intronic splicing mutation (c.967-1GNC)], one missense mutation in HFE (p.Tyr230Cys), and one mutation in the 5′-UTR of HAMP gene(c.-25GNA). The results reported here illustrate the usefulness of NGS for targeted iron metabolism-related gene panels, as a likely cost-effective approach for molecular genetics diagnosis of non-classic HH patients. Simultaneously, it has contributed to the knowledge of the pathophysiology of those rare iron metabolism-related disorders.
- Next-generation sequencing of iron-metabolism related genes in Portuguese patients with iron overload: novel pathogenic genetic variantsPublication . Faria, Ricardo; Silva, Bruno; Silva, Catarina; Vieira, Luis; Loureiro, Pedro; Gomes, Susana; Gonçalves, João; Rivera, Isabel; Fraga, Sofia; Fleming, Rita; Faustino, PaulaObjective: In Southern European countries up to one-third of the patients with hereditary hemochromatosis (HH) do not present the common HFE risk genotype. In order to investigate the molecular basis of these cases we have designed a gene panel for rapid and simultaneous analysis of 6 HH-related genes (HFE, TFR2, HJV, HAMP, SLC40A1 and FTL) by next-generation sequencing (NGS). Materials and Methods: Eighty-eight iron overload Portuguese patients, negative for the common HFE mutations, were analysed. A TruSeq Custom Amplicon kit (TSCA, by Illumina) was designed in order to generate 97 amplicons covering exons, intron/exon junctions and UTRs of the mentioned genes with a cumulative target sequence of 12115bp. Amplicons were sequenced in the MiSeq instrument (IIlumina) using 250bp paired-end reads. Sequences were aligned against human genome reference hg19 using alignment and variant caller algorithms in the MiSeq reporter software. Novel variants were validated by Sanger sequencing and their pathogenic significance were assessed by in silico studies. Results: We found a total of 55 different genetic variants. These include novel pathogenic missense and splicing variants (in HFE and TFR2), a very rare variant in IRE of FTL, a variant that originates a novel translation initiation codon in the HAMP gene, among others. Conclusion: The merging of TSCA methodology and NGS technology appears to be an appropriate tool for simultaneous and fast analysis of HH-related genes in a large number of samples. However, establishing the clinical relevance of NGS-detected variants for HH development remains a hard-working task, requiring further functional studies.
- Variantes genéticas do gene IFITM3 revelam um potencial modificador da gravidade sintomática da gripePublication . David, Susana; Correia, Vanessa; Antunes, Liliana; Faria, Ricardo; Ferrão, José; Faustino, Paula; Nunes, Baltazar; Maltez, Fernando; Lavinha, João; Andrade, Helena Rebelo deAs epidemias de gripe representam um sério problema de saúde pública com elevados custos económicos. Foi sugerido que um dos alelos do gene IFITM3 (rs12252-C) constitui um impor tante fator de risco de base populacional para as formas graves da gripe por infeção pelo vírus A(H1N1)pdm09. Analisámos variantes do IFITM3 associadas à gravidade da doença em doentes por tugueses (n=41). Foram identificados sete SNPs no amplicão de 352bp do IFITM3 em torno do rs12252. De acordo com HapMap, o SNP rs34481144 per tence ao mesmo bloco de desequilíbrio de ligação (LD) que rs12252, e está em LD com rs6421983. A associação negativa com formas sintomáticas graves em relação a ligeiras obser vada para o alelo rs34481144-A é sugestiva de um efeito protetor no modelo de hereditariedade dominante. Para além disso, o haplótipo Hap4 com rs34481144-A, e sem o rs12252-C, mostrou estar significativamente associado a gripe sintomaticamente ligeira. Por outro lado, apesar de a um nível de significância limiar, o haplótipo Hap1 com rs34481144-G, sem rs12252-C, mostrou-se associado à gripe com sintomatologia grave. Em comparação com a população por tuguesa em geral, foram obser vadas diferenças significativas nas frequências do alelo possivelmente protetor rs34481144-A no grupo com sintomatologia grave, do Hap1 deletério no grupo com sintomatologia ligeira e do Hap4 protetor no grupo com doença grave. A proporção de casos com sintomas graves que poderiam ser evitados se todos os indivíduos da população apresentassem o alelo protetor rs34481144-A foi estimada em 56% e 64%, respetivamente na população em geral e no grupo de indivíduos com doença ligeira. A implicação destas variantes nos fenótipos da doença necessita de estudos de validação, nomeadamente de natureza funcional.