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- Analysis of Genes Involved in Oxidative Stress and Iron Metabolism in Heart Failure: A Step Forward in Risk StratificationPublication . Silva, Pedro X.; Aguiar, Laura; Gaspar, Marcos; Faustino, Paula; Falcão, Luiz M.; Barbosa, Mário; Bicho, Manuel; Inácio, ÂngelaIntroduction: Heart failure (HF) is a clinical syndrome characterized by cardinal symptoms that may be accompanied by signs. It results from structural and/or functional abnormalities of the heart leading to elevated intracardiac pressures and/or inadequate cardiac output at rest and/or during exercise. The prevalence of iron deficiency and anemia justifies the current guidelines recommendation of screening. Genes HP, ACE, MTHFR, HFE, and CYBA are involved in oxidative mechanisms, iron metabolism, and hematologic homeostasis. This study investigates the contribution of variants Hp1/2 (HP), I/D (ACE), C677T (MTHFR), C282Y and H63D ( HFE), and C242T (CYBA) to the development of HF, either independently or in epistasis. Methods: We used a database of 389 individuals, 143 HF patients, and 246 healthy controls. Genotypes were characterized through PAGE electrophoresis, PCR, PCR-RFLP, and multiplex-ARMS. Data analysis was performed with the SPSS® 26.0 software (IBM Corp., Armonk, NY). Results: We observed a significant association between the MTHFR gene and HF predisposition. The presence of allele T and genotype CT constituted risk, while genotype CC granted protection. Epistatic interactions revealed risk between genotype II of the ACE gene and genotypes CC (C282Y) or HH (H63D) of the HFE gene. Risk was also observed for interactions between genotype CC (CYBA) and genotypes 2-2 (HP), CT (MTHFR), or HH (HFE-H63D). Conclusion: We concluded that genes HP, ACE, MTHFR, HFE, and CYBA contribute to the susceptibility for HF, individually or in epistasis. This study contributes to the clarification of the role that genes involved in oxidative mechanisms and iron metabolism play in the physiopathology of HF. It is, therefore, a step forward in risk stratification and personalized medicine.
- Contribution of HFE and HPSE genes and methaemoglobin reductase activity to heart failurePublication . Gaspar, Marcos A.; Aguiar, Laura; Ferreira, Joana; Faustino, Paula; Mascarenhas, Mário Rui; Menezes Falcão, Luiz; Bicho, Manuel; Inácio, ÂngelaIntroduction: Heart failure can be defined as a syndrome caused by a structural anomaly and/or by a committed cardiac function, which leads to an inadequate cardiac output unable to meet the metabolic necessities of the organism. We aim to understand if HFE and HPSE genes as well as methaemoglobin reductase activity, may influence the development of heart failure. Methodology: It was performed a case-control study, in which 252 DNA samples from Portuguese individuals were analysed, 143 derived from subjects with heart failure, and 109 from healthy controls. For HPSE genotyping (rs4693608), we performed endpoint PCR analysis. A multiplex ARMS (Amplification-Refractory Mutation System) assay was used for the simultaneous detection of two HFE polymorphisms (C282Y and H63D). Reductase methaemoglobin activity was determined by spectrophotometric methods. All statistical tests were performed with IBM® SPSS® Statistics 26.0 software. Statistical significance was defined as a p-value < 0.05. Results: Regarding the H63D polymorphism, results show the CG genotype as a risk factor [OR (95% CI) = 2.889 (1.041-8.018); p=0.042]. In what concerns HPSE gene, the GG genotype was found to have a protective effect [OR (95% CI) = 0.435 (0.193-0.982); p=0.045] while the presence of the A allele is a risk factor [OR (95% CI) = 2.297 (1.018-5.179); p=0.045. Considering methaemoglobin reductase, its activity was lower in patients than in healthy controls (p=0.019). Discussion: Intravenous iron supplementation is sometimes considered in heart failure treatment, emphasizing the results presented in the present study. Considering the high prevalence of heart failure in Portugal (400.000 individuals, according to Sociedade Portuguesa de Cardiologia), it is important to identify iron-related markers, since it may allow an earlier and more expert approach, which may provide better prevention and therapeutic strategies for this pathology.
- Contributo dos genes NOS e ECA para a suscetibilidade de elevar a glicemia em hipertensosPublication . Aguiar, Laura; Semente, Ildegário; Ferreira, Joana; Matos, Andreia; Mascarenhas, Mário Rui; Menezes Falcão, Luíz; Faustino, Paula; Bicho, Manuel; Inácio, ÂngelaIntrodução: A Hipertensão Arterial (HTA) é um fator de risco cardiovascular muito prevalente em Portugal. Esta patologia é multifatorial, envolvendo fatores genéticos e ambientais. A resistência à insulina e a hipertensão são componentes do síndroma metabólico e frequentemente coexistem. Níveis aumentados de glicemia associados a hipertensão aumentam significativamente o risco de doença cardiovascular. Objetivo: Este estudo teve como objetivo investigar a potencial implicação de polimorfismos genéticos nos genes da sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS) e da enzima conversora da angiotensina (ECA) no desenvolvimento da HTA e hiperglicemia, na população portuguesa. Material e métodos: Foi realizado um estudo de caso-controlo para uma amostra de 377 indivíduos portugueses, dos quais 243 hipertensos e 134 normotensos. As análises polimórficas do número variável de repetições em tandem (VNTR) no intrão 4 (repetição em tandem de 27 pb) do gene eNOS e do polimorfismo ECA I/D (inserção/ deleção) foram realizadas por reação em cadeia da polimerase (PCR). Todas as análises estatísticas foram realizadas recorrendo ao software SPSS, versão 24.0, sendo o nível de significância estatística estabelecido para p <0,05. Resultados: Encontrou-se uma associação entre o alelo 4a do gene eNOS com a hipertensão (p =0,001), verificando-se ainda que na hipertensão, a presença do alelo 4a está associada a valores superiores de HbA1c (p=0,031). Em relação ao gene ECA, não se encontram diferenças estatisticamente significativas entre doentes e controlos, contudo verificou-se que a presença do alelo D em hipertensos está associada a níveis mais elevados de glicemia (p=0,017). Conclusão: Os nossos resultados mostram uma associação entre os genes eNOS e ECA com fenótipos clínicos associados a hiperglicemia, na população portuguesa. Indivíduos com níveis elevados de glicemia têm maior risco de desenvolver hipertensão. A identificação de polimorfismos genéticos que possam influenciar o desenvolvimento e gravidade da HTA, pode permitir um diagnóstico mais precoce e específico, que pode proporcionar melhores estratégias terapêuticas e de prevenção, para esta doença tão prevalente em Portugal.
- Diferenças genotípicas entre o sudoeste da Europa e África: um estudo comparativo em genes relacionados com a hipertensãoPublication . Aguiar, Laura; Semente, Ildegário; Carvalho, Andreia; Ferreira, Joana; Caria, Helena; Damasceno, Albertino; Faustino, Paula; Inácio, Ângela; Bicho, ManuelIntrodução: Desde o surgimento do género Homo, os hominídeos ocuparam uma grande variedade de ambientes com relação ao clima. Assim, espera-se que as pressões seletivas variem amplamente entre diferentes regiões geográficas. Objetivo: O objetivo do presente trabalho foi comparar a frequência genotípica em genes que têm sido propostos como potenciais moduladores da hipertensão arterial (HTA), uma doença multifatorial cujo contributo genético é importante, no sudoeste da Europa e em África. Os genes analisados foram: sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS), glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), alfa-globina (HBA) e enzima conversora da angiotensina (ECA). Material e métodos: Foram analisadas 224 amostras de DNA de Portugal e 202 amostras de África (24 amostras de DNA de Moçambique e 178 amostras de DNA de São Tomé e Príncipe). Para o gene eNOS, a análise polimórfica do número variável de repetições em tandem (VNTR) no intrão 4 (repetição em tandem de 27 pb) foi realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR). A caracterização do SNP rs1050829 no gene G6PD foi obtida por PCR seguida de análise do comprimento do fragmento de restrição. Para a pesquisa da deleção α-talassémica de -3,7kb no agrupamento génico da α-globina foi usada uma metodologia de Gap-PCR. A genotipagem do polimorfismo da ECA I/D (inserção/ deleção) foi realizada por PCR. Todas as análises estatísticas foram realizadas recorrendo ao software SPSS, versão 24.0, sendo o nível de significância estatística estabelecido para p <0,05. Resultados: Os resultados mostram que, em relação ao gene eNOS, os genótipos que apresentam o alelo 4a (quatro cópias de repetições de 27 pb) têm uma frequência menor em Portugal do que em África (p <0,001). Curiosamente, apenas em África encontramos os alelos raros 4c, 4d e 4y. Para o gene G6PD (cromossoma X) há uma menor frequência dos genótipos com o alelo G em Portugal, comparado com a população africana (p <0,001). A presença da deleção α-talassémica de -3,7kb é comum em África, mas rara em Portugal (p <0,001). Em relação ao gene ECA, não se encontram diferenças estatisticamente significativas entre as populações estudadas (p =0,151). Conclusão: Os nossos resultados mostram diferenças na distribuição geográfica de três polimorfismos que potencialmente influenciam o desenvolvimento da HTA. Estas diferenças podem estar relacionadas com diferentes pressões seletivas proporcionadas pelos diferentes climas no sudoeste da Europa e na África equatorial e subequatorial. De facto, condições como o calor e a humidade estão associadas a maior perda de sódio.
- Differences in the genotype frequencies of genes related to blood pressure regulation - a comparative study between South-West Europe and Peri-equatorial AfricaPublication . Aguiar, Laura; Semente, Ildegário; Ferreira, Joana; Carvalho, Andreia; Silva, Alda P.; Caroça, Cristina; Caria, Helena; Damasceno, Albertino; Laires, Maria J.; Sardinha, Luís; Monteiro, Cristina; Mascarenhas, Mário R.; Faustino, Paula; Inácio, Ângela; Bicho, ManuelBackground: Since the emergence of the genus Homo, hominids have occupied a wide variety of environments, facing different selective pressures. Objectives: The aim this study is to compare genotype frequencies between South-West Europe and Peri-equatorial Africa in genes potentially modulators of blood pressure. Methods: The analyzed sample consisted of 325 individuals from Portugal and 226 individuals from Africa (48 from Mo zambique and 178 from São Tomé and Príncipe). The following genetic variants were analyzed: intron 4 VNTR in eNOS, rs1050829 in G6PD, -3.7kb α-thalassemic deletion in HBA, rs1800457 in CYB5R3, Hp 1/2 genotype/phenotype in Hp and intron 16 I/D in ACE. Results: Frequencies of genotypes with the 4a allele in eNOS (p<0.001), the G allele in G6PD (p<0.001), the α-3.7 kb in HBA (p <0.001), the C allele in the CYB5R3 (p<0.001) were higher in Peri-equatorial Africa. The Hp 1.1 genotype of Hp has a higher frequency in Peri-equatorial Africa (p=0.002). ACE shows no significant differences. Conclusion: Results show differences in five genetic variants. Conditions of extreme heat and humidity, characteristic of Peri-equatorial Africa, have been associated with increased sodium loss. This study suggests that selected compensatory mechanisms printed in the genome, are nowadays risk factors for hypertension in Peri-equatorial Africa.
- Estudo da interação entre moduladores da homeostasia do ferro e o gene ECA na insuficiência cardíacaPublication . Gaspar, Marcos A.; Aguiar, Laura; Ferreira, Joana; Faustino, Paula; Mascarenhas, Mário Rui; Menezes Falcão, Luís; Bicho, Manuel; Inácio, ÂngelaIntrodução: A insuficiência cardíaca (IC) diz respeito a um síndrome clínico composto por um conjunto de sintomas e/ou sinais com origem numa anomalia cardíaca estrutural e/ou funcional e que dá origem à inabilidade de bombear sangue em quantidade suficiente, de forma a preencher as necessidades metabólicas do organismo. No presente trabalho, pretendemos perceber como a interação entre a variação I/D no gene ECA e possíveis moduladores da homeostasia do ferro (Fe) influenciam a IC. Os moduladores em estudo foram: a atividade da redutase da metahemoglobina, o gene Hfe e o gene da heparanase (HPSE) Metodologia: Foi efetuado um estudo de caso-controlo, no qual foram utilizadas 252 amostras de portugueses, 143 indivíduos com IC e 109 controlos saudáveis. Para analisar o polimorfismo no gene HPSE (rs4693608) foi feita a genotipagem por endpoint (LightCycler480). Para analisar os polimorfismos no gene Hfe (H63D e C282Y) recorreu-se à técnica de ARMS Multiplex. Para a análise do polimorfismo no gene ECA (rs4646994 - I/D) realizou-se um PCR. A atividade da redutase da metahemoglobina foi obtida por testes espetrofotométricos. Todos os testes estatísticos necessários foram realizados no software IBM® SPSS® Statistics 26.0, tendo os valores sido considerados significativos para um p < 0,05. Resultados: Verificou-se uma associação entre a IC e: 1) a presença do alelo D do gene HFe (HH vs HD; p=0,049); 2) a presença do alelo A do gene HPSE (AA + GA vs GG; p=0,045; 3) níveis mais baixos da atividade da redutase da metahemoglobina (p=0.019). Verificou-se ainda que as epistasias entre a presença do alelo H ou C do gene Hfe e o alelo D do gene ECA são protetores na IC (p=0,041 para ambas). Conclusão: Os resultados deste estudo evidenciam o papel da homeostasia do ferro e da sua interação com a ECA na IC. O ferro é um componente essencial para o bom funcionamento das mitocôndrias, as quais têm um papel importante no fornecimento de energia ao musculo cardíaco. O conhecimento do perfil genótipo dos doentes em genes moduladores da homeostasia do ferro em interação com o gene ECA, poderá ser uma vantagem na aplicação de uma medicina mais personalizada, permitindo um aconselhamento preventivo e uma terapêutica mais dirigidos.
- Fatores genéticos e bioquímicos moduladores do fenótipo da anemia das células falciformesPublication . Aguiar, Laura; Inácio, Ângela; Dias, Deodália; Faustino, Paula[PT] A anemia das células falciformes (ACF) é uma anemia hereditária autossómica recessiva caracterizada pela presença de hemoglobina S (HbS). Esta doença é causada por uma mutação no gene da beta-globina o que provoca uma substituição de um aminoácido na sexta posição da cadeia beta-globínica. A vaso-oclusão e a anemia hemolítica são as principais características desta doença, contudo os doentes com ACF apresentam uma variabilidade clínica e hematológica que não pode ser explicada apenas pela mutação no gene da beta-globina. Outros moduladores genéticos e efeitos ambientais são importantes no fenótipo desta doença. Terapias específicas são necessárias para as diferentes manifestações clínicas da anemia das células falciformes, tais como a hidroxiureia, profilaxia com penicilina e vacinação, administração de analgésicos e transfusões sanguíneas. Estas terapias têm vários riscos associados. Os indivíduos com ACF também apresentam uma deficiência em arginina que contribui para uma perda da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO - Nitric Oxide). A suplementação oral em citrulina aumenta os níveis de arginina mais eficientemente que a própria arginina, aumentando assim a produção de NO. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a associação entre parâmetros hematológicos ou bioquímicos e variantes em genes candidatos. Este estudo teve também como objetivo estudar os efeitos da suplementação oral de citrulina na ACF. O estudo foi realizado em 26 doentes em idade pediátrica. Os parâmetros analisados foram hemoglobina total, HbS, bilirrubina, lactato desidrogenase (LDH), red cell distribution width (RDW), reticulócitos, leucócitos, neutrófilos, fosfatase ácida, mieloperoxidase, redutase da metahemoglobina e redutase transmembranar e a genética inclui-o o gene HBA, o agrupamento génico HBB e os genes BCL11A, eNOS, HMOX-1, MTHFR e MPO. Os resultados deste estudo mostram uma associação estatisticamente significativa entre alguns parâmetros estudados e variantes genéticas, nomeadamente: 1) níveis mais elevados nas concentrações da mieloperoxidase e o haplótipo Senegal, 2) níveis mais elevados da atividade da fosfatase ácida e a deleção alfa-talassémica -3.7, 3) níveis mais elevados de reticulócitos e o genótipo TT do rs2070744 no gene eNOS, 4) níveis mais elevados de LDH e o genótipos TT do rs2070744 no gene eNOS, 5) níveis mais elevados de reticulócitos e o genótipo GG do rs1799983 no gene eNOS, 6) níveis mais elevados de LDH e o genótipo GG do rs1799983 no gene eNOS e 7) níveis mais elevados de neutrófilos e o alelo 4a do VNTR do intrão 4 no gene eNOS. Existe ainda uma diferença significativa nas concentrações de MPO entre os doentes estudados e o grupo controlo. Relativamente aos efeitos da suplementação oral com citrulina nestes doentes, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros hematológicos ou bioquímicos estudados entre os meses da toma do suplemento. Contudo, foi relatada uma melhoria clínica nos doentes. Os resultados deste estudo reforçam a importância do NO na ACF. Pode presumir-se que o NO e possivelmente os seus percursores, como a citrulina, possam ser utilizados como terapia nestes doentes. Contudo, os resultados deste estudo deverão ser confirmados num maior grupo de doentes.
- Genetic modifiers of the intermediate phenotypes in sickle cell anemiaPublication . Aguiar, Laura; Matos, Ângela; Gil, Ângela; Ferreira, Joana; Braga, Lígia; Almeida, Salomé; Kjollerstrom, Paula; Faustino, Paula; Bicho, Manuel; Inácio, ÂngelaSickle cell anemia (SCA) is an inherited blood disorder characterized by the presence of hemoglobin S (HbS). This disease is caused by a single point mutation in the beta-globin gene with a corresponding amino acid substitution at the sixth position of the beta-globin chain. Vaso-occlusion and hemolytic anemia are the major features of this disease, however, SCA patients present clinical and hematologic variability that cannot be only explained by the single mutation. Others genetic modifiers and environmental factors are important for the clinical phenotype. We studied the association between several hematological and biochemical parameters and a set of genetic variants in 26 pediatric SCA patients. Myeloperoxidase (MPO) and placental growth factor (PlGF) were determined by ELISA (R&D Systems Inc.). Amplification of DNA samples for the rs1050829 characterization, in the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) gene, was performed by PCR followed by restriction fragment length analysis. A multiplex PCR assay was used for simultaneous amplification of glutathione S-transferases mu (GSTM1) and theta (GSTT1). All statistical tests were performed with SPSS 24.0 software. Our results show higher levels of MPO (p<0.001) and PlGF (p=0.048) in SCA patients, compared with healthy adult controls. Moreover, in these patients we found associations between: 1) lower levels of total hemoglobin and the GSTM1 null genotype (p=0.044); 2) higher levels of HbS with the rs1050829_G genotype (hemizygous males) in the G6PD gene (p=0.026). We suggest that the mentioned polymorphisms in GSTM1 and G6PD genes may act as genetic modifiers in SCA, which could be useful for the prediction of increased susceptibility to complications. Furthermore, our results reinforce the importance to study biochemical parameters for a better understanding of the clinical outcome of this disease.
- Genetic susceptibility for hypertension development in the Portuguese populationPublication . Semente, Ildegário; Ferreira, Joana; Aguiar, Laura; Matos, Andreia; Bicho, Manuel; Faustino, Paula; Inácio, ÂngelaHypertension is a multifactorial disease involving both environmental and genetic factors. It is characterized by the presence of elevated arterial tension levels and is frequently found in association with metabolic and hormonal disturbances, cardiac hypertrophy and high vascular toning. This study aimed to investigate the potential implication of common polymorphisms located in NOS3, HBA and G6PD genes in hypertension development in the Portuguese population.
- Genetic variants in endothelial nitric oxide synthase gene are modifiers of the hemolysis phenotype in Sickle Cell AnemiaPublication . Aguiar, Laura; Matos, Andreia; Gil, Ângela; Afonso, Conceição; Braga, Lígia; Lavinha, João; Kjollerstrom, Paula; Faustino, Paula; Bicho, Manuel; Inácio, ÂngelaSickle Cell Anemia (SCA) is an autosomal recessive hereditary anemia characterized by the presence of hemoglobin S (Hb S). This disease is caused by a single mutation in beta-globin gene with a corresponding amino acid substitution at the sixth position of the beta-globin chain. The easily ability of Hb S to polymerize in deoxygenated conditions gives rise to abnormal sickled red blood cells. Vaso-occlusion and hemolytic anemia are the major features of this disease, however SCA patients present clinical and hematologic variability that cannot be only explained by the single mutation in the beta-globin gene. Others genetic modifiers and environmental effects are important in the clinical phenotype. We have studied the association between hematological and biochemical parameters (Hb S, total Hb, red cell distribution width (RDW), neutrophils, transmembrane reductase, methemoglobin reductase, serum lactate dehydrogenase (LDH), total bilirubin and reticulocyte count) and some genetic variants, from several candidate genes, in 26 paediatric SCA patients. Our results show a significant statistical association between two endothelial nitric oxide synthase (eNOS) single nucleotide polymorphisms (SNPs) and two haemolysis parameters. Both the rs2070744_TT and the rs1799983_GG genotypes are associated with an increased reticulocyte count (p =0.02 and 0.01, respectively) and higher serum LDH level (p = 0.04 and 0.04, respectively). Our findings suggest that polymorphisms in the eNOS gene may act as genetic modifiers of the haemolysis process that could provide utility for the prediction of increased susceptibility to haemolysis-related complications. Furthermore, our results reinforce the importance of nitric oxide (NO) bioactivity in SCA. We presume that NO, and possible its precursors such as L-arginine or L-citrulline, might be used as pharmacological tools to improve the quality of life of these patients.
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