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- Fatores genéticos e bioquímicos moduladores do fenótipo da anemia das células falciformesPublication . Aguiar, Laura; Inácio, Ângela; Dias, Deodália; Faustino, Paula[PT] A anemia das células falciformes (ACF) é uma anemia hereditária autossómica recessiva caracterizada pela presença de hemoglobina S (HbS). Esta doença é causada por uma mutação no gene da beta-globina o que provoca uma substituição de um aminoácido na sexta posição da cadeia beta-globínica. A vaso-oclusão e a anemia hemolítica são as principais características desta doença, contudo os doentes com ACF apresentam uma variabilidade clínica e hematológica que não pode ser explicada apenas pela mutação no gene da beta-globina. Outros moduladores genéticos e efeitos ambientais são importantes no fenótipo desta doença. Terapias específicas são necessárias para as diferentes manifestações clínicas da anemia das células falciformes, tais como a hidroxiureia, profilaxia com penicilina e vacinação, administração de analgésicos e transfusões sanguíneas. Estas terapias têm vários riscos associados. Os indivíduos com ACF também apresentam uma deficiência em arginina que contribui para uma perda da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO - Nitric Oxide). A suplementação oral em citrulina aumenta os níveis de arginina mais eficientemente que a própria arginina, aumentando assim a produção de NO. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a associação entre parâmetros hematológicos ou bioquímicos e variantes em genes candidatos. Este estudo teve também como objetivo estudar os efeitos da suplementação oral de citrulina na ACF. O estudo foi realizado em 26 doentes em idade pediátrica. Os parâmetros analisados foram hemoglobina total, HbS, bilirrubina, lactato desidrogenase (LDH), red cell distribution width (RDW), reticulócitos, leucócitos, neutrófilos, fosfatase ácida, mieloperoxidase, redutase da metahemoglobina e redutase transmembranar e a genética inclui-o o gene HBA, o agrupamento génico HBB e os genes BCL11A, eNOS, HMOX-1, MTHFR e MPO. Os resultados deste estudo mostram uma associação estatisticamente significativa entre alguns parâmetros estudados e variantes genéticas, nomeadamente: 1) níveis mais elevados nas concentrações da mieloperoxidase e o haplótipo Senegal, 2) níveis mais elevados da atividade da fosfatase ácida e a deleção alfa-talassémica -3.7, 3) níveis mais elevados de reticulócitos e o genótipo TT do rs2070744 no gene eNOS, 4) níveis mais elevados de LDH e o genótipos TT do rs2070744 no gene eNOS, 5) níveis mais elevados de reticulócitos e o genótipo GG do rs1799983 no gene eNOS, 6) níveis mais elevados de LDH e o genótipo GG do rs1799983 no gene eNOS e 7) níveis mais elevados de neutrófilos e o alelo 4a do VNTR do intrão 4 no gene eNOS. Existe ainda uma diferença significativa nas concentrações de MPO entre os doentes estudados e o grupo controlo. Relativamente aos efeitos da suplementação oral com citrulina nestes doentes, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros hematológicos ou bioquímicos estudados entre os meses da toma do suplemento. Contudo, foi relatada uma melhoria clínica nos doentes. Os resultados deste estudo reforçam a importância do NO na ACF. Pode presumir-se que o NO e possivelmente os seus percursores, como a citrulina, possam ser utilizados como terapia nestes doentes. Contudo, os resultados deste estudo deverão ser confirmados num maior grupo de doentes.
- Validação de potenciais biomarcadores proteómicos na Síndrome da Apneia Obstrutiva do SonoPublication . Coelho, Cristina Valentim; Penque, Deborah; Rebelo, Maria Teresa[PT] A Síndrome da Apneia Obstrutiva do Sono (SAOS) é um distúrbio respiratório muito prevalente na população em geral, com graves repercussões na saúde e na qualidade de vida dos doentes. A Proteómica tem vindo a ser aplicada no estudo da SAOS na pesquisa de novos biomarcadores de diagnóstico, prognóstico, monitorização e/ou alvo terapêutico para esta doença. Estudos preliminares realizados no Laboratório de Proteómica do INSARJ revelaram a existência de proteínas diferencialmente moduladas em glóbulos vermelhos (GVs) de doentes com SAOS comparados com roncadores simples. Algumas destas proteínas, como a catalase (CAT) e a peroxiredoxina 2 (Prx2), estão envolvidas em processos antioxidantes, e este mecanismo parece estar significativamente comprometido nos doentes com SAOS. O principal objectivo deste trabalho foi a validação da CAT e da Prx2 por técnicas ortogonais à Proteómica, como o western blotting (WB) e/ou por estudos de cinética enzimática em amostras de GVs de doentes com SAOS, antes e após seis meses de tratamento CPAP (Continuous Positive Airway Pressure), e em indivíduos roncadores simples como controlos. Dois tipos de amostras de GVs foram avaliadas por doente, amostra recolhida no final da tarde antes do exame de polissonografia – PSG (denominadas de “Noite”) e amostra recolhida na manhã seguinte ao exame (denominadas de “Manhã”). Após tratamento CPAP, apenas as amostras de GVs “Manhã” foram preparadas e, portanto, consideradas no estudo. O estudo da CAT, por cinética enzimática, revelou que a actividade da CAT é significativamente menor nos GVs “Manhã” em comparação com as amostras “Noite”, sejam de doentes SAOS ou de controlos (Anova p<0,05). Contudo, esta diminuição da actividade da CAT durante a manhã em relação à noite estava significativamente (T Student, p<0,05) mais acentuada nos doentes com SAOS do que nos controlos. Após seis meses de tratamento com CPAP, observou-se um aumento muito significativo da actividade da CAT nos GVs “Manhã”. Surpreendentemente, constatou-se por WB, não haver diferenças quantitativas e significativas dos níveis de expressão da CAT entre os grupos de doentes/condições analisados, e tão pouco havia, nos doentes SAOS, antes e após o tratamento CPAP. Estes resultados sugerem que a modulação da atividade da CAT nos GVs está essencialmente associada a modificações pós-traducionais da XI proteína, o que corrobora com os resultados obtidos pela Proteómica, que identificou oito proteoformas para a CAT nestas células. A avaliação do estado redox/oligomérico da Prx2 nos GVs por WB em SDS-PAGE não reduzido, utilizando anticorpos específicos para a Prx2 e para formas hiperoxidadas da Prx (PrxSO2/3), revelou que as formas monoméricas e diméricas da Prx2 estavam significativamente hiperoxidadas nos GVs “Manhã” ou “Noite” de doentes com SAOS. O tratamento CPAP diminui esta hiperoxidação nos monómeros e dímeros da Prx2. Contudo, as formas multiméricas da Prx2 hiperoxidadas, descritas com actividade chaperone/transdução de sinal associadas à protecção celular, surgiram quase que exclusivamente nos doentes SAOS após CPAP. A forma dissulfídica oxidada/hiperoxidada da Prx2 está associada a inativação da sua actividade peroxidática, e por conseguinte, a estado de stresse oxidativo. A conversão entre as diferentes funções da Prx2, ou seja, entre a actividade peroxidática antioxidante e a atividade chaperone/transdução de sinal, é regulada pelo seu estado redox/oligomérico na célula. Em resumo, os resultados deste trabalho validaram os resultados anteriormente obtidos por Proteómica, indicando nos GVs de doentes com SAOS, existência de desregulação no seu sistema redox-homeostase envolvendo a CAT e a Prx2. Este trabalho propõe ainda, a CAT e a Prx2, como fortes candidatos a biomarcadores de gravidade e/ou de monitorização do tratamento CPAP. Contudo, serão necessários mais estudos para consolidar este resultados e contribuir para uma melhor compreensão acerca do diagnóstico, monitorização e tratamento para a SAOS.
- Proteómica da Apneia Obstrutiva do Sono para a descoberta de biomarcadoresPublication . Silva, Ana Rita; Penque, Deborah; Rebelo, Maria Teresa[PT] A síndrome da apneia obstrutiva do sono (SAOS) é um importante problema de saúde pública, não só por comprometer o estilo de vida e bem-estar do doente, mas também por ser um factor de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, metabólicas e carcinogénicas. Apesar de grandes avanços nos métodos de diagnóstico e tratamento da SAOS, permanecem ainda por esclarecer os mecanismos moleculares que levam ao seu desenvolvimento e às patologias associadas. A avaliação do perfil proteómico do plasma sanguíneo que possa estar associado à SAOS, aos vários estadios da doença ou à resposta/eficácia do tratamento com pressão positiva contínua das vias aéreas (CPAP), foi o objectivo último deste estudo. As proteínas constituintes deste perfil, uma vez validadas, são potenciais biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e/ou de monitorização terapêutica da SAOS. Numa primeira fase foi necessária a optimização da preparação de amostras de plasma e sua análise por electroforese bidimensional (2DE) em mini-géis, para futura identificação de proteínas diferencialmente expressas na doença/condição, por espectrometria de massa. Este objectivo do projecto foi concluído com sucesso, pois mostrou que a utilização de 2DE em minigeis é possível em análises futuras com uma boa relação custo-eficácia. Em paralelo, investigou-se se o estado redox-oligomérico da proteína peroxiredoxina 2 (Prx2) (um biomarcador de inflamação/stress oxidativo), encontrava-se alterado no plasma de doentes com SAOS e, se esta alteração, era parcialmente revertida após tratamento CPAP, tal como vem sendo observado nos eritrócitos destes doentes (dados preliminares do laboratório). A validação em plasma dos dados de proteómica obtidos em eritrócitos, poderá contribuir para uma melhor compreensão da relevância do papel da Prx2 na SAOS. Para isso, selecionaram-se amostras de plasma ‘noite’, recolhidas na noite anterior ao diagnóstico polissonográfico e ‘manhã’, recolhidas na manhã seguinte para cada indivíduo roncador (controlo) e doente SAOS (ligeira, moderada e grave). Para estes últimos, foram também recolhidas amostras matinais ‘CPAP’, após seis meses de tratamento. As amostras de plasma foram analisadas por 1DE SDS-PAGE reduzido e não-reduzido (com ou sem agente redutor), seguido de western blotting com anticorpo específico para a Prx2 ou PrxSO2/3 (formas hiperoxidadas da Prx2). Os resultados indicaram que as formas hiperoxidadas estavam aumentadas nos doentes 3 SAOS, mais significamente (p≤0,05) à noite, em relação aos indivíduos controlo. O tratamento CPAP pareceu reduzir esta hiperoxidação. Estes resultados corroboram os resultados obtidos nos eritrócitos destes doentes. No entanto, formas da Prx2, possivelmente com outras modificações pós-traducionais, que não a hiperoxidação, também mostraram uma tendência para um aumento matinal nos doentes SAOS. Esta tendência foi significativamente (p≤0.05) reduzida após tratamento. Estes resultados, embora preliminares, são interessantes dado que a presença desta proteína no meio extra celular ser reconhecida como uma sinalizadora de stress/inflamação. Em suma, os dados obtidos são motivadores para se prosseguir com a investigação no plasma, no desenvolvimento futuro de novas ferramentas de diagnóstico, prognóstico e/ou monitorização terapêutica da SAOS.