DSA - Dissertações de mestrado
Permanent URI for this collection
Browse
Browsing DSA - Dissertações de mestrado by Subject "Agentes Microbianos e Ambiente"
Now showing 1 - 6 of 6
Results Per Page
Sort Options
- Avaliação da influência de fatores ambientais na expressão de genes de saxitoxina de cianobactériasPublication . Reis, Marta; Valério, Elisabete; Rebelo, TeresaAs cianobactérias são seres procariotas fotossintéticos com uma longa história evolutiva, o que possibilitou o desenvolvimento de várias características que permitem a sua adaptação perante as alterações climáticas e as modificações antropogénicas que se verificam nos sistemas aquáticos. Algumas cianobactérias, perante condições favoráveis, atingem elevadas densidades celulares originando os blooms. Este fenómeno está frequentemente associado à produção de toxinas. Dentro do grupo das cianotoxinas, a saxitoxina (STX) e os seus análogos têm ganho algum destaque uma vez que a sua ocorrência nos corpos de água doce representa um fenómeno mundial com um número crescente de casos nos últimos dez anos. A STX e os seus análogos são um grupo de alcalóides que são conhecidos por bloquear principalmente os canais de sódio das membranas dos axónios dos neurónios, afetando assim o sistema nervoso de vários animais, incluindo o Homem. Pode causar severas paralisias, levando inclusivé a uma falha respiratória, e consequentemente provocar a morte. Estas toxinas são produzidas por uma via biossintética única, sendo o cluster sxt responsável por codificar as proteínas que permitem a síntese e o transporte das toxinas SXTs para o meio extracelular. A presença destas toxinas nos corpos de água representa uma ameaça para a saúde humana, para a estabilidade do ecossistema e economia em todo o mundo. Muitos estudos laboratoriais têm mostrado que vários fatores ambientais afetam de diferentes formas a síntese de STXs. Perante o atual contexto de aquecimento global, as temperaturas médias das águas estão a aumentar pelo que muitas cianobactérias estão a expandir a sua distribuição geográfica, especialmente algumas espécies produtoras de STXs. Neste contexto torna-se particularmente importante perceber de que modo a temperatura pode influenciar o crescimento de cianobactérias produtoras de STXs e a sua respetiva síntese. A nível molecular, os efeitos que a própria temperatura tem sobre os níveis de transcrição de genes pertencentes ao cluster sxt encontram-se ainda pouco elucidados, estando descritos apenas numa espécie. De modo a providenciar novos conhecimentos nesta área, este trabalho teve como objetivo avaliar a relação entre três temperaturas diferentes (10, 20 e 30 °C) e parâmetros relacionados com o crescimento [taxa de crescimento, densidade celular e formação de células especializadas (heterócitos e acinetos)], a produção de STXs, e os níveis de expressão de genes que permitem sua síntese (sxtA) e o transporte de SXTs (sxtM e sxtPer) em duas estirpes de cianobactérias, Aphanizomenon gracile LMECYA40 e Cuspidothrix issatschenkoi LMECYA31, isoladas em albufeiras portuguesas. Os resultados obtidos permitiram estabelecer, para ambas as estirpes, uma relação entre as taxas de crescimento e a temperatura, sendo que este primeiro parâmetro foi menor nas culturas que cresceram a 10 °C e maior a 20 °C. A 30 °C nenhuma das culturas de A. gracile LMECYA40 e C. issatschenkoi LMECYA31 cresceu. À temperatura de 20 °C, também se verificou que C. issatschenkoi LMECYA31 produziu duas vezes mais STXs totais (toxin quota cell) ao longo das fases do crescimento do que A. gracile LMECYA40. Em ambas as espécies, a maior produção de STXs ocorreu a 20 °C na fase exponencial final. Em A. gracile LMECYA40, a formação de um elevado número de heterócitos ocorreu nas fases antecedentes às fases de maior produção de SXTs totais. Detetou-se a formação de acinetos nas duas estirpes a 10 °C, e no que diz respeito a C. issatschenkoi LMECYA31, a formação de acinetos com grandes volumes coincidiu com uma menor produção de STXs. Os níveis de expressão génica de sxtM e sxtPer foram influenciados pela temperatura e pela fase de crescimento correspondente nas duas estirpes. De uma forma geral, os dados obtidos sugerem que há uma regulação positiva destes genes à temperatura de 10 °C que foi acompanhada por o aumento de
- Avaliação das propriedades antibacterianas de cianobactérias de água doce para aplicação em antibióticos naturaisPublication . Dias, Iara; Dias, Elsa; Dias, Deodália Maria AntunesA descoberta dos antibióticos revolucionou a medicina, mas a sua eficácia está comprometida devido à disseminação de mecanismos de resistência a antibióticos, sendo urgente pesquisar novos compostos antibacterianos. As cianobactérias têm sido estudadas quanto à produção de metabolitos secundários com atividade antibacteriana. Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade antibacteriana de vinte e cinco estirpes de cianobactérias pertencentes à coleção ESSACC. Para tal, foram produzidos extratos de hexano, diclorometano:metanol (2:1), metanol 70% e água destas estirpes, em duas extrações sequenciais com estes solventes: (I) do menos polar para o mais polar; (II) do mais polar para o menos polar. O fenótipo de suscetibilidade de nove bactérias patogénicas a esses extratos foi avaliado pelos métodos da Difusão em Disco e da Microdiluição. Pelo método da Difusão em Disco nenhum dos extratos inibiu totalmente o crescimento bacteriano. No entanto, houve um decréscimo do crescimento de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 quando exposta aos extratos de hexano (I) de Aphanizomenon flos-aquae (LMECYA 088), metanol (II) de Oscillatoria limosa (SAG 42.87), diclorometano:metanol (I)/ metanol (I) de Arthrospira platensis (SAG 85.79) e diclorometano:metanol (I)/(II) de Nostoc sp. (LMECYA 330). Pelo teste da Microdiluição verificou-se que o extrato metanólico (I) de A. platensis (SAG 85.79), a 25% v/v, inibiu totalmente o crescimento de P. aeruginosa. Adicionalmente, analisou-se a atividade adjuvante destes extratos em antibióticos de referência para a P. aeruginosa e observou-se que todos potenciaram a atividade de aztreonam e piperaciclina/tazobactam, excetuando o extrato de diclorometano:metanol (I) de A. platensis (SAG 85.79) que apenas potenciou a atividade de aztreonam. O extrato de diclorometano:metanol (I) de Nostoc sp. (LMECYA 330) apresentou também atividade sinérgica com o ertapenem. Os resultados obtidos neste estudo permitiram identificar quatro estirpes cianobacterianas como potenciais fontes de compostos antibacterianos, o que pode contribuir para a mitigação do fenómeno da resistência a antibióticos.
- Avaliação dos efeitos citotóxicos em Saccharomyces cerevisiae exposta a cianotoxinasPublication . Rodrigues, Sara; Valério, Elisabete; Barata, MargaridaAs cianobactérias são microrganismos procariotas que se encontram maioritariamente em comunidades fitoplantónicas. Sob condições favoráveis, estas são capazes de atingir grandes densidades celulares (blooms). Algumas espécies de cianobactérias produzem cianotoxinas que podem ser prejudiciais para a saúde pública e animal. Das cianotoxinas conhecidas, foram escolhidas a Microcistina-LR (MC-LR) e a Cilindrospermopsina (CYL) para desenvolver este trabalho. Tendo em conta a frequente ocorrência e a elevada toxicidade da MC-LR, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estabeleceu um valor limite de concentração desta toxina na água potável de 1 μg/L. Para a CYL ainda não há um valor guia, pelo que não está controlada. Os ensaios de viabilidade celular são muito usados para procurar moléculas com efeitos na proliferação celular ou efeitos tóxicos que possam levar à morte celular. Para realizar estes ensaios, foi selecionada a levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), já anteriormente usada para investigar mecanismos moleculares de toxicidade da Microcistina-LR (MC-LR). Neste estudo foi usado o ensaio de Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), após exposição das leveduras a diferentes concentrações das cianotoxinas. Neste ensaio, células viáveis com metabolismo ativo convertem o reagente MTT num produto de cor roxa, que nos permite quantificar a viabilidade das células testadas, enquanto que células mortas não conseguem fazer essa conversão. Testou-se ainda uma enzima lítica, a Liticase, a qual vai atuar e digerir a camada externa da parede celular. Para além do ensaio MTT, foi também testado o ensaio de coloração com Azul Tripano (AT), que é usado para determinar o número de células viáveis (que excluem o corante) presentes numa suspensão, onde é feita a contagem das células por observação direta ao microscópio em Câmara de Neubauer. Este trabalho permitiu dar uma contribuição numa área ainda pouco explorada, referente ao uso de métodos de análise de viabilidade celular para detetar efeitos citotóxicos provocados por duas cianotoxinas, utilizando S. cerevisiae como organismo eucariota modelo. Como conclusões, dos dois métodos usados neste estudo, o ensaio MTT é o mais fiável na medida em que o comportamento dos controlos reflete claramente o que está descrito na literatura para os mesmos (p ≤ 0,05). Contudo, o método AT revelou ser bastante reprodutível. No que diz respeito às toxinas, não se observam efeitos citotóxicos significativos em S. cerevisiae (p > 0,05) com nenhuma das duas toxinas testadas. Quando foi usada liticase de forma a facilitar a entrada das toxinas nas células, estes ensaios também não refletiram efeitos citotóxicos significativos (p > 0,05).
- Caraterização do perfil antioxidante de cianobactérias e seleção de estirpes com potencial biotecnológicoPublication . Guerreiro, Adriana Soares; Dias, Elsa; Rebelo, TeresaAs cianobactérias são organismos fotossintéticos procarióticos que apresentam grande diversidade em relação à sua morfologia, fisiologia e metabolismo. São um grupo abundante no planeta Terra, com elevada capacidade de adaptação e sobrevivência e são encontrados em habitats com condições ambientais variadas e até extremas. As cianobactérias produzem metabolitos secundários (ácidos gordos, carotenóides, vitaminas, toxinas, entre outros), que exibem vários tipos de bioatividade com potencial biotecnológico, designadamente atividade antioxidante. Um antioxidante é definido como um agente com a capacidade de quebrar ou impedir a proliferação de reações de oxidação lipídica, algo que ocorre naturalmente nos tecidos. Na indústria alimentar, os compostos com essa atividade são importantes porque atrasam e/ou inibem a degradação dos alimentos. No entanto, alguns dos antioxidantes sintéticos disponíveis no mercado são suspeitos de ter atividade carcinogénica e de serem tóxicos para os seres humanos. Portanto, é de grande importância identificar fontes naturais de compostos com atividade antioxidante Este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil antioxidante de estirpes de cianobactérias isoladas de águas doces. Prepararam-se extratos etanólicos e metanólicos de oito estirpes de cianobactérias (Aphanizomenon gracile, Aphanizomenon flos-aquae, Microcystis aeruginosa, Leptolyngbya sp., Anabaena flos-aquae, Planktothrix mougeotii, Nostoc sp. e Planktothrix agardhii) e a sua atividade antioxidante foi avaliada pelo ensaio do sistema de inibição do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) e pelo ensaio de branqueamento do β-caroteno. Foi também determinado o conteúdo total em compostos fenólicos, pelo ensaio de Folin-Ciocalteu e o conteúdo total em flavonóides pelo ensaio do cloreto de alumínio. Os perfis antioxidantes variaram com a estirpe e com o solvente de extração. Os extratos etanólicos de Aphanizomenon gracile (LMECYA 009) e Aphanizomenon flos-aquae (LMECYA 088) apresentaram os valores mais elevados no ensaio de branqueamento β-caroteno (690,47 e 828,94 AAC respetivamente) e no conteúdo total de compostos fenólicos (102,32 e 123,16 mg EAG/g de extrato, respetivamente) e flavonóides (605,58 e 900,60 mg EQR/g de extrato, respetivamente). Os extratos metanólicos de Microcystis aeruginosa (LMECYA 127), Anabaena flos-aquae (LMECYA 180) e Planktothrix agardhii (LMECYA 257) apresentaram a maior percentagem de inibição do radical DPPH (10,65%, 10,20% e 10,59%, respetivamente). Neste trabalho foi também avaliado o efeito protetor dos extratos etanólicos das oito estirpes contra a citotoxicidade induzida por H2O2 na linha celular humana HEK293T através do ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio tetrazólio (MTT). A pré-exposição destas células a todos os extratos conferiram proteção contra o H2O2, salientando-se os extratos das estirpes Leptolyngbya sp. (LMECYA 173), Nostoc sp. (LMECYA 291) e Planktothrix mougeotii (LEGE 06224), que conferiram às células tratadas com H2O2 uma taxa de sobrevivência de 47%, 25% e 53%, respetivamente numa exposição de uma hora aos extratos e vinte e três horas ao H2O2, em relação ás células expostas apenas ao H2O2. Das cianobactérias estudadas, selecionaram-se as estirpes Aphanizomenon gracile (LMECYA 009), Aphanizomenon flos-aquae (LMECYA 088), Leptolyngbya sp. (LMECYA 173), Nostoc sp. (LMECYA 291) e Planktothrix mougeotii (LEGE 06224) como as mais promissoras para estudos futuros sobre aplicações biotecnológicas na área dos antioxidantes.
- Evaluation of the physiologic response of heterotrophic bacteria present in aquatic environments to the presence of microcystinsPublication . Andrade, Joana; Valério, Elisabete; Reis, Ana Maria GonçalvesMicrocystins (MC) are the hepatotoxins produced by cyanobacteria, which are photosynthetic organisms that usually colonize aquatic environments. Climate change has had a significant impact on the increased frequency of cyanobacterial blooms, which are often associated with the production of cyanotoxins. Studies show that the growth of aquatic heterotrophic bacteria that co-occur with cyanobacteria may not be affected by the presence of MC, or, on the other hand they may present a reduction in growth, never being totally inhibited by their presence (Miguéns, 2013; Pinto, 2016). The aim of this study was to examine the effects of three microcystin variants (MCLR, MCRR, MCYR) on heterotrophic aquatic bacteria living in the same ecosystem as cyanobacteria. In particular, (1) to observe the impact of microcystins on the growth of heterotrophic bacteria, (2) the impact on the enzymes of the antioxidant system of these bacteria and (3) to screen the presence of mlr genes. For this purpose, we performed the morphological and molecular characterization of 22 bacteria isolated from two reservoirs. It was intended to analyze the growth of bacterial isolates exposed to different concentrations of extract of each variant of MCs, and also to two concentrations of pure microcystin-LR. The search for the presence of MCs degradation genes (mlrA-D), was done using PCR. In order to analyze the effect of microcystins on the antioxidant system of the isolates, catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD1 and SOD2) activities were determined spectrophotometrically, at 240 nm and 550 nm, respectively, in the cells exposed to the different variants of microcystin. None of the isolates grown in liquid medium was completely inhibited by the exposure to microcystins, however, it was found that MCs can reduce the growth of most bacteria tested. While some bacteria grew without any induced effect, others reacted differently according to the variant and the concentration (in the same isolate). In some cases a slight growth stimulation was observed. In most cases the growth stimulation appears to be related with other molecules from the MC extracts. The results of the determination of CAT and SOD activities revealed that only three isolates have catalase, namely M17F, M17K and 594196, and only three isolates have superoxide dismutase, M17C, M17D and 594196. In this study, a heterotrophic bacteria, M17C, mlr+, was also isolated, mlr genes were amplified and sequenced. A new primer pair for the mlrA was also proposed in this study. In summary, the results from this study, showed that there is not a pattern characteristic of the species or genera analyzed, thus indicating that the response of the heterotrophic bacteria isolates to MCs is mainly related to strain characteristics. They corroborate previous studies, which indicate that the cluster of mlr genes is not the only cause to allow bacteria to grow in the presence of MC without being affected by them, even with no alteration in the main enzymes from the antioxidant system (CAT and SOD).
- Fungos em areias e águas costeiras e interiores em Portugal: relevância para a saúde humana e bem-estarPublication . Brito, Sara; Valério, Elisabete; Dias, DeodáliaOs fungos filamentosos e as leveduras são omnipresentes na natureza, incluindo nas zonas balneares. A areia frequentada por pessoas e por animais tem uma população crescente de fungos específicos de humanos e específicos de animais, em comparação com a areia não frequentada por pessoas e animais. Contudo, certas espécies de fungos podem causar infeções ou alergias em humanos. Estudos anteriores mostraram que existem microrganismos patogénicos ou patogénicos oportunistas que sobrevivem e crescem na areia. O conjunto de doenças resulta da inalação e da ingestão de esporos fúngicos e de células vegetativas, ou do contato direto com células fúngicas. Uma vez que as zonas balneares são locais frequentados por um elevado número de pessoas, especialmente no verão, a qualidade microbiológica das areias e das águas balneares é particularmente importante. Assim sendo, o objetivo deste estudo é a recolha de dados sobre as espécies de fungos existentes nas três zonas balneares em estudo – Carcavelos, Alburrica e Praia Verde. A identificação dos isolados foi realizada através da observação de caracteres morfológicos e através de ferramentas moleculares. Para isto, foram analisadas 18 amostras de areia e 18 amostras de água. No total, nas amostras de areia foram identificados 1 538 isolados, ao passo que nas amostras de água foram identificados 180 isolados. Os isolados fúngicos detetados com mais frequência foram Cladosporium sp. (na Praia Verde e em Alburrica) e Acremonium kiliense (em Carcavelos). Foram também identificadas algumas espécies responsáveis por causar alergias e infeções, tais como Exophiala dermatitidis, Alternaria alternata, Trematosphaeria grisea e Aspergillus nidulans. No entanto, não foi possível identificar 19 isolados presentes nas amostras. A realização desta dissertação permitiu identificar os isolados fúngicos presentes nos locais em estudo, assim como a frequência de cada uma das espécies presente nas amostras. Permitiu também verificar a presença de determinadas espécies que podem provocar doenças graves, o que representa um risco para a saúde dos utilizadores das praias.