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- The human mRNA decay machinery: an unexpected role for DIS3L2 over nonsense-mediated decay targetsPublication . da Costa, Paulo J.; Romão, Luísa; Carvalho, Margarida GamaThroughout its complex life, eukaryotic messenger RNAs (mRNAs) go through several processes both in the nucleus and the cytoplasm, from the moment they are transcribed until they are degraded. As during these process errors can occur, cells have several surveillance mechanisms that detect and degrade abnormal transcripts. Among these, we can find the nonsense-mediated mRNA decay (NMD), which is a surveillance mechanism that detects and degrades mRNAs carrying a premature translationtermination codon (PTC). However, it is known that NMD also regulates the abundance of a large number of physiological RNAs that encode full-length proteins. In human cells, NMD-targeted mRNAs are degraded by endonucleolytic cleavage and exonucleolytic degradation from both 5’ and 3’ ends. This is done by a process not yet completely understood that recruits decapping and 5’-to-3’ exonuclease activities, as well as deadenylating and 3’-to-5’ exonuclease exosome activities. The main objective of this PhD project was to unveil the role of the eukaryotic ribonucleases in the translation-dependent mRNA surveillance mechanisms of NMD and non-stop decay (NSD), and in normal mRNA turnover, with special focus in NMD. In this thesis, we studied the role of the exosome-associated DIS3, DIS3L1 and PM/Scl100, the major cytoplasmic 5’-to-3’ exoribonuclease XRN1, the endoribonuclease SMG6, and the exosome-independent 3’-to-5’ exoribonuclease DIS3L2. With this aim in mind, we divided this work in 3 sections. In the first section, the research goal was to unveil the role of ribonucleases in the different mRNA decay mechanisms. For that, we knockeddown distinct ribonucleases (endo- and exo-) in HeLa cells. In addition, cells were transiently transfected with constructs containing different human β-globin variants. The β-globin variants used in this study includes: the wild-type β-globin gene (βWT), a β-globin gene with a nonsense mutation at codon 15 (β15), which is NMD-resistant, two NMD-sensitive variants with nonsense mutations at codon 26 or 39 (β26 and β39) and a NSD-sensitive (βNS) variant. Then, we assessed by Reverse-transcription coupled with quantitative Polymerase chain reaction (RT-qPCR) the changes on the mRNA levels upon the different ribonucleases knockdown (KD). Our results show that in eukaryotic cells ribonucleases are not exclusive of any mRNA decay pathway. Also, we performed the ribonucleases KD and accessed by RT-qPCR the changes in the mRNA levels of several endogenous NMD targets. Our results point to a target specificity of ribonucleases in the regulation of NMD targets. Interestingly, we showed, for the first time, that DIS3L2 is implicated in the NMD targets degradation. In the second section, the research goal was to investigate how DIS3L2 functions in NMD. Here, we showed that DIS3L2 function in the same pathway as the canonical NMD factor UPF1. Moreover, we observed that DIS3L2 directly degrades several NMD targets independently of any other ribonuclease. Furthermore, the DIS3L2 degradation of NMD targets depends on the activity of the terminal uridyl transferases (TUTases) 4 and 7. Together, our findings establish a role for DIS3L2 and uridylation in NMD. In the third section, the research goal was to elucidate how DIS3L2 modulates the eukaryotic transcriptome. We performed a high-throughput total RNA sequencing in SW480 colorectal cancer (CRC) cell line. Considering the results we obtained in the previous sections, we perform a single DIS3L2 KD and a triple DIS3L2+TUT4+TUT7 KD, in the SW480 CRC cell line. This will allow to unveil how DIS3L2 and uridylation by TUT4-TUT7 modulates the transcriptome in a CRC cell line context. Together this work shed light on how ribonucleases are involved in general mRNA turnover, NMD and NSD. Our results emphasize that eukaryotic ribonucleases are target specific rather than pathway specific. This work also shows, for the first time, the involvement of DIS3L2 in NMD and, consequently in the gene expression regulation of NMD targets. Also, our results set, for the first time, uridylation as a mechanism involved in NMD. Together, our data unveil (possibly) a new branch of the NMD pathway. Thus, we place DIS3L2 “on the tail” of NMD targets. Taking into account that NMD pathway is involved in the expression regulation of several genes involved in many diseases (e.g. cancer), understanding how DIS3L2 regulates a subset of NMD targets could unveil new ways to address these diseases.
- Deciphering the role of cyanobacteria in water resistome: Hypothesis justifying the antibiotic resistance (phenotype and genotype) in Planktothrix genusPublication . Dias, Elsa; Oliveira, Micaela; Manageiro, Vera; Vasconcelos, Vitor; Caniça, ManuelaThe importance of environmental microorganisms in the emergence and dissemination of antibiotic resistance is an undeniable fact. However, cyanobacteria are not seen yet as putative players in the dynamic of environmental resistome, despite their ubiquity in water environments, where they are exposed to antibiotic pollution and in straight contact with native and pathogenic bacteria harboring antibiotic resistance genes (ARGs). In this work we evaluated the susceptibility of 8 strains of Planktothrix agardhii (from surface freshwaters reservoirs) and 8 strains of Planktothrix mougeotii (from a wastewater treatment plant) to several classes of antibiotics, using a microplate dilution method previously described by us. We also search for ARGs in those strains by molecular methods. None of the 16 tested strains were susceptible to trimethoprim, nalidixic acid and norfloxacin, from 0.0015–1.6 mg/L, but all were susceptible to streptomycin, gentamicin, kanamycin, ceftazidime and ceftriaxone. The minimum inhibitory concentrations (MICs) ranged between 0.05–0.8 mg/L for the aminoglycosides and 0.4–1.6 mg/L for the two β‑lactams. Major differences were found in the susceptibility to amoxicillin and tetracycline, with P. agardhii being susceptible (MIC of 0.05 mg/L and 0.4 mg/L, respectively) and P. mougeotii not susceptible. These distinct responses might be due to differences between species. However, the lower susceptibility of wastewater strains suggests that antibiotic resistance phenotype of cyanobacteria is related with their habitat. The failure to detect acquired genes conferring resistance to trimethoprim/quinolones, strongly supports the hypothesis that cyanobacteria are intrinsically resistant to these antibiotics. Interestingly, we detected a class-1-type integron and a sul1 gene in 3 strains of both P. agardhii and P. mougeotii, which supports the possibility of cyanobacteria to acquire and transfer antibiotic resistance determinants. In conclusion, the identification of ARGs and related integrons, as well as the reduced susceptibility to some antibiotics, suggests that cyanobacteria may play a role on environmental resistome.
- Programa Nacional de Vigilância da Gripe: relatório da época 2017/2018Publication . Pechirra, Pedro; Cristóvão, Paula; Costa, Inês; Conde, Patrícia; Guiomar, Raquel; Rodrigues, Ana Paula; Silva, Susana; Torres, Ana Rita; Machado, Ausenda; Direcção-Geral da Saúde, Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da GripeA vigilância da gripe em Portugal através do Programa Nacional de Vigilância da Gripe permite monitorizar, descrever a atividade gripal, detetar e identificar os vírus da gripe em circulação. O programa integra as componentes de vigilância clínica e laboratorial. A componente clínica possibilita o cálculo de taxas de incidência permitindo descrever a intensidade e evolução da epidemia no tempo. A componente virológica e laboratorial tem por base o diagnóstico laboratorial do vírus da gripe o que permite identificar e caraterizar os vírus da gripe em circulação em cada inverno. Durante o inverno 2017/2018, foi observada uma atividade gripal de intensidade baixa a moderada. O período epidémico ocorreu entre a semana 52/2017 (dezembro) e a semana 7/2018 (fevereiro) e o valor mais elevado da taxa de incidência semanal de síndrome gripal (78,8/105) ocorreu em dezembro, na semana 52/2017. O vírus da gripe foi detetado em co-circulação com os outros vírus respiratórios. O vírus da gripe do tipo B/Yamagata foi o predominante, tal como o observado nos restantes países europeus. Em Portugal foi identificado em 57,4% dos casos de gripe confirmados laboratorialmente. Foram também detetados em circulação, com menor frequência, os vírus da gripe A(H1)pdm09, A(H3) e B/Victoria. A caracterização genética demonstrou que os vírus B/Yamagata pertenciam ao clade 3 (representado pela estirpe vacinal B/Phuket/30173/2013) e os vírus B/Victoria pertenciam ao clade 1A (representados pela estirpe vacinal B/Brisbane/60/2008, presente na vacina trivalente 2017/2018). Cinco dos vírus B/Victoria pertenciam ao novo subgrupo, que se distingue da estirpe vacinal de 2017/2018, apresentando uma deleção dos aminoácidos 162-163 no gene da hemaglutinina. Este novo grupo surgiu em 2015/2016 e atualmente foi já detetado a nível mundial. Os vírus da gripe A(H3) continuam a apresentar uma grande diversidade genética. Na época 2017/2018 os vírus deste subtipo agruparam-se em 2 subgrupos genéticos: 3C.2a1b (A/England/74560298/2017) e 3C.2a2 (A/Norway/4465/2016). Os vírus A(H1)pdm09 pertenciam ao clade 6B.1, semelhantes à estirpe vacinal A/Michigan/45/2015. A avaliação da resistência aos antivirais inibidores da neuraminidase, revelou uma susceptibilidade normal dos vírus influenza A e B ao oseltamivir e zanamivir, com excepção de um vírus do tipo B/Yamagata que apresentou uma redução da susceptibilidade a ambos os inibidores da neuraminidase. Os vírus da gripe com diminuição da susceptibilidade aos antivirais foram detetados esporadicamente a nível europeu e mundial. A percentagem mais elevada de casos de gripe foi verificada nos indivíduos com idade inferior a 15 anos, no entanto devido ao número mais reduzido de casos estudados nesta faixa etária esta informação deverá ser analisada com cuidado. A nível hospitalar, a maior percentagem de casos de gripe foi também detetada no grupo das crianças entre os 5 e os 14 anos. Foi nos doentes com idade superior a 65 anos que se verificou a mais elevada taxa de internamento hospitalar e em unidades de cuidados intensivos. A febre, as cefaleias e a tosse foram os sintomas mais frequentemente associados a casos de gripe confirmados laboratorialmente. Foram estudados os grupos de risco para a maior gravidade da infeção pelo vírus da gripe: doentes crónicos e as mulheres grávidas. Foi nos doentes com obesidade, diabetes e com doença cardiovascular que se observou a maior proporção de casos de gripe confirmada laboratorialmente, seguindose dos indivíduos com doença respiratória crónica e imunodeficiência congénita ou adquirida. A proporção de casos de infeção pelo vírus da gripe foi similar nas mulheres grávidas e nas mulheres do mesmo grupo etário não grávidas. A vacina como a principal forma de prevenção da gripe é fortemente recomendada para pessoas com idade igual ou superior a 60 anos, doentes crónicos e imunodeprimidos, grávidas e profissionais de saúde. A vacinação foi reportada em 17,1% dos casos notificados, valor idêntico ao observado na época 2016/2017. A deteção do vírus da gripe ocorreu em 33,6% dos casos vacinados e sujeitos a diagnóstico laboratorial. A confirmação de gripe em indivíduos vacinados poderá estar relacionada com uma moderada efetividade da vacina antigripal. A pesquisa de outros vírus respiratórios nos casos de SG negativos para o vírus da gripe, veio revelar a circulação e o envolvimento de outros agentes virais respiratórios em casos de SG. Os vírus respiratórios foram detetados durante todo o período de vigilância da gripe, entre a semana 38/2017 e a semana 7/2018. O rinovírus e o coronavírus humano foram os mais frequentemente detetados. A deteção de vírus respiratórios atingiu proporções mais elevadas nas crianças até aos 4 anos e entre os 5-14 anos de idade. As infeções por dois ou mais agentes virais foram detetadas com baixa frequência. A Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da Gripe, efetuou o diagnóstico da gripe em 13885 casos de infeção respiratória tendo sido o vírus influenza detetado em 3722 destes casos. Em 55% dos casos de gripe foi detetado o vírus influenza B. Os vírus da gripe A(H3), A(H1)pdm09 e A (não subtipados) foram detetados em 14%, 12% e 19% dos casos de gripe, respetivamente. Em 1909 casos de infeção respiratória foram identificados outros vírus respiratórios sendo o RSV, os picornavírus (hRV, hEV e picornavírus) e os hMPV os mais frequentes e em co-circulação com o vírus da gripe. A grande maioria destes casos foi identificada nas crianças com idade inferior a 4 anos. Durante a época de gripe 2017/2018 observou-se um excesso de mortalidade por todas as causas entre as semanas 52/2017 e 9/2018 de cerca de 3,714 óbitos (15 % superior em relação ao esperado). Este excesso foi observado em ambos os sexos, a partir dos 65 anos de idade, em especial acima dos 85 anos. As regiões do Norte, Centro e Lisboa e Vale do Tejo foram aquelas em que se observaram excessos de mortalidade mais elevado. Durante toda a época, estimaram-se cerca de 3.700 atribuíveis à epidemia de gripe. Noutros países europeus foi igualmente observado um excesso de mortalidade por todas as causas, possivelmente atribuível à epidemia de gripe e à vaga de frio que se fez sentir na europa durante o mês de fevereiro. Na época 2017/2018 participaram na vigilância da gripe em Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) 33 UCI pertencentes a 24 hospitais. Durante a época foram reportados 220 casos de gripe. Verificou-se um aumento apreciável da proporção de casos de gripe admitidos em UCI entre as semanas 51 de 2017 e 01 de 2018, em que foi atingido o valor máximo (7,6%). A partir daí o valor decresceu, com algumas flutuações, aproximando-se progressivamente da linha de base até à semana 17 (0%), onde se manteve até ao final da época. Os vírus tipo A e B circularam em proporções semelhantes, tendo sido subtipadas 32,5% das amostras. Mais de metade dos doentes (56%) tinha idade superior a 65 anos, 88% dos quais com doença crónica, sendo a patologia cardiovascular reportada em 44%. A proporção de vacinados contra a gripe sazonal foi de 14% dos doentes, menos de metade do observado na época anterior. Foi prescrito oseltamivir a 92% dos doentes, 74% necessitaram de ventilação mecânica invasiva e 8% teve suporte de oxigenação por membrana extracorporal. O diagnóstico de gripe foi confirmado no próprio dia da admissão em UCI, em 52 % dos casos, sendo já conhecido previamente à admissão, em 21% dos casos. A duração da hospitalização foi inferior a 9 dias em cerca de metade dos doentes com alta para o domicílio e inferior a 8 dias para cerca de metade dos óbitos. A taxa de letalidade foi estimada em 26%, valor semelhante ao das três épocas anteriores. Este sistema de vigilância da gripe sazonal em UCI poderá ser aperfeiçoado nas próximas épocas, reduzindo a subnotificação e melhorando o preenchimento dos campos necessários ao estudo da doença. A época de vigilância da gripe 2017/2018 foi em muitas características comparável ao descrito na maioria dos países europeus. A situação em Portugal destacou-se pelo início do período epidémico mais tardio relativamente ao inverno anterior, mas de duração igualmente prolongada. De forma semelhante aos restantes países europeus o vírus da gripe predominante foi do tipo B/Yamagata associado a uma intensidade da epidemia baixa a moderada. Verificou-se um excesso de mortalidade por todas as causas, essencialmente no grupo dos indivíduos mais fragilizados e com idade acima dos 85 anos. O conhecimento das características da epidemia da gripe, do seu desenvolvimento e dos vírus da gripe circulantes são essenciais para a implementação de medidas de prevenção e de controlo da doença em cada inverno.
- Rastreio Pré-natal não-invasivo em cffDNA: Estudo Piloto da Unidade de Citogenética do DGH do INSAPublication . Ferreira, Cristina; Silva, Catarina; Vieira, Luís; Tarelho, Ana Rita; Marques, Bárbara; Duarte, Sílvia; Carocha, Ana; Ferreira, Leonor; Cruz, Jader; Cohen, Álvaro; Correia, HildebertoDesde que, em 1997, Dennis Lo descobriu a presença de cell-free DNA de origem fetal (cffDNA) na circulação materna muito se tem investido no desenvolvimento de testes de rastreio pré-natal não invasivo, sobretudo, para a Síndrome de Down (SD). Atualmente, encontram-se disponíveis no mercado variadíssimos testes que facultam este tipo de rastreio em cffDNA, com melhores performances de sensibilidade e especificidade, quando comparado ao rastreio pré-natal convencional. No entanto, e de acordo com a sua realidade, cada país tem optado por diferentes estratégias. A Unidade de Citogenética do Departamento de Genética Humana, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA, IP), como Laboratório de Estado e do Serviço Nacional de Saúde, iniciou em 2016, com o apoio da Unidade de Tecnologia e Inovação do mesmo departamento, a implementação de um teste de cffDNA (NIPT) com o objectivo de disponibilizar esta opção aos Centros de Diagnóstico Pré-Natal (CDPN) nacionais. De forma a validar a metodologia e capacitar tecnicamente os elementos participantes, para a realização dos procedimentos laboratoriais necessários, testaram-se inicialmente, cerca de 60 amostras de sangue materno. Estas amostras foram colhidas em paralelo com a realização do procedimento invasivo (Liquido Amniótico ou Biópsia de Vilosidade Coriónica), de forma a ser possível comparar ambos os resultados e inferir conclusões nesta amostragem inicial. Posteriormente, foi estabelecido um protocolo, com o CDPN da Maternidade Dr. Alfredo da Costa, para a realização de um estudo piloto, ao abrigo do qual foram analisados, até ao momento, cerca de 350 NIPT. Neste trabalho propomo-nos apresentar as dificuldades sentidas na implementação desta metodologia, a sua aceitação, bem como os resultados obtidos. Pretendemos ainda lançar as bases para uma discussão sobre o seu enquadramento no SNS em Portugal e critérios para a sua implementação.