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The human mRNA decay machinery: an unexpected role for DIS3L2 over nonsense-mediated decay targets
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Throughout its complex life, eukaryotic messenger RNAs (mRNAs) go through several processes both in the nucleus and the cytoplasm, from the moment they are transcribed until they are degraded. As during these process errors can occur, cells have several surveillance mechanisms that detect and degrade abnormal transcripts. Among these, we can find the nonsense-mediated mRNA decay (NMD), which is a surveillance mechanism that detects and degrades mRNAs carrying a premature translationtermination codon (PTC). However, it is known that NMD also regulates the abundance of a large number of physiological RNAs that encode full-length proteins. In human cells, NMD-targeted mRNAs are degraded by endonucleolytic cleavage and exonucleolytic degradation from both 5’ and 3’ ends. This is done by a process not yet completely understood that recruits decapping and 5’-to-3’ exonuclease activities, as well as deadenylating and 3’-to-5’ exonuclease exosome activities. The main objective of this PhD project was to unveil the role of the eukaryotic ribonucleases in the translation-dependent mRNA surveillance mechanisms of NMD and non-stop decay (NSD), and in normal mRNA turnover, with special focus in NMD. In this thesis, we studied the role of the exosome-associated DIS3, DIS3L1 and PM/Scl100, the major cytoplasmic 5’-to-3’ exoribonuclease XRN1, the endoribonuclease SMG6, and the exosome-independent 3’-to-5’ exoribonuclease DIS3L2. With this aim in mind, we divided this work in 3 sections. In the first section, the research goal was to unveil the role of ribonucleases in the different mRNA decay mechanisms. For that, we knockeddown distinct ribonucleases (endo- and exo-) in HeLa cells. In addition, cells were transiently transfected with constructs containing different human β-globin variants. The β-globin variants used in this study includes: the wild-type β-globin gene (βWT), a β-globin gene with a nonsense mutation at codon 15 (β15), which is NMD-resistant, two NMD-sensitive variants with nonsense mutations at codon 26 or 39 (β26 and β39) and a NSD-sensitive (βNS) variant. Then, we assessed by Reverse-transcription coupled with quantitative Polymerase chain reaction (RT-qPCR) the changes on the mRNA levels upon the different ribonucleases knockdown (KD). Our results show that in eukaryotic cells ribonucleases are not exclusive of any mRNA decay pathway. Also, we performed the ribonucleases KD and accessed by RT-qPCR the changes in the mRNA levels of several endogenous NMD targets. Our results point to a target specificity of ribonucleases in the regulation of NMD targets. Interestingly, we showed, for the first time, that DIS3L2 is implicated in the NMD targets degradation. In the second section, the research goal was to investigate how DIS3L2 functions in NMD. Here, we showed that DIS3L2 function in the same pathway as the canonical NMD factor UPF1. Moreover, we observed that DIS3L2 directly degrades several NMD targets independently of any other ribonuclease. Furthermore, the DIS3L2 degradation of NMD targets depends on the activity of the terminal uridyl transferases (TUTases) 4 and 7. Together, our findings establish a role for DIS3L2 and uridylation in NMD. In the third section, the research goal was to elucidate how DIS3L2 modulates the eukaryotic transcriptome. We performed a high-throughput total RNA sequencing in SW480 colorectal cancer (CRC) cell line. Considering the results we obtained in the previous sections, we perform a single DIS3L2 KD and a triple DIS3L2+TUT4+TUT7 KD, in the SW480 CRC cell line. This will allow to unveil how DIS3L2 and uridylation by TUT4-TUT7 modulates the transcriptome in a CRC cell line context. Together this work shed light on how ribonucleases are involved in general mRNA turnover, NMD and NSD. Our results emphasize that eukaryotic ribonucleases are target specific rather than pathway specific. This work also shows, for the first time, the involvement of DIS3L2 in NMD and, consequently in the gene expression regulation of NMD targets. Also, our results set, for the first time, uridylation as a mechanism involved in NMD. Together, our data unveil (possibly) a new branch of the NMD pathway. Thus, we place DIS3L2 “on the tail” of NMD targets. Taking into account that NMD pathway is involved in the expression regulation of several genes involved in many diseases (e.g. cancer), understanding how DIS3L2 regulates a subset of NMD targets could unveil new ways to address these diseases.
A expressão génica nos organismos eucariotas é um processo complexo, composto por inúmeros passos altamente regulados. A expressão génica depende muito da regulação feita ao nível do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA, do inglês messenger RNA). Em organismos eucariotas, o mRNA é a molécula responsável pela transferência de informação, desde o ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid) que se encontra no núcleo, até a produção de proteínas no citoplasma. O mRNA eucariótico passa por vários processos, tanto no núcleo como no citoplasma, desde o momento em que é transcrito até ser degradado. Durante esses processos o mRNA adquire algumas características/estruturas que lhe conferem mais estabilidade, protegendo-o da degradação por enzimas capazes de degradar o mRNA, as ribonucleases. Entre essas características/estruturas encontram-se a adição da estrutura cap na extremidade 5’ e a adição de até 200 adeninas (A), denominada cauda poli(A), na extremidade 3’. A estrutura cap e a cauda poli(A) protegem os mRNAs da degradação de 5’-3’ e de 3’-5’, respetivamente. Como durante todos esses processos podem ocorrer erros, as células têm vários mecanismos de vigilância, também denominados mecanismos de controlo de qualidade, que detetam e degradam mRNAs não-funcionais ou anómalos. Entre estes mecanismos de controlo de qualidade, destaca-se o decaimento de mRNA mediado por codões nonsense (NMD, do inglês nonsense mediated mRNA decay). Um codão nonsense é um codão que induz a terminação da tradução do mRNA. O NMD é um mecanismo de vigilância que deteta e degrada mRNAs que contêm um codão de terminação da tradução prematuro (PTC, do inglês premature translation-termination codon). Se não forem degradados, os mRNAs que contenham PTC levam a produção de proteínas truncadas, que para além de poderem não ser funcionais, podem ser prejudiciais para as células. No entanto, para além do papel do NMD como mecanismo de controlo da qualidade, sabe-se que o NMD também regula a abundância de um grande número de mRNAs fisiológicos, que codificam proteínas inteiras e funcionais. Em células humanas, sabe-se que os mRNAs degradados pelo NMD são degradados por clivagem endonucleolítica e/ou degradação exonucleolítica a partir de ambas as extremidades (5' e/ou 3'). Este processo ainda não é totalmente conhecido, sabendo-se que o NMD recruta, entre outras, as proteínas responsáveis por retirar a estrutura cap (processo denominado decapping) e pela degradação da cauda poli(A) (processo denominado desadenilação). Para além destas, o NMD também recruta as ribonucleases responsáveis por degradar os mRNAs de 5’-3’ e de 3’-5’. Tal como referido anteriormente, existem outros mecanismos de controlo de qualidade do mRNA. É o caso do mecanismo de controlo da qualidade do mRNA mediado pela ausência de um codão de terminação da tradução (NSD, do inglês nonstop decay). O NSD deteta e degrada mRNAs que não possuem qualquer codão de terminação da tradução. Este trabalho teve como principal objetivo desvendar o papel das ribonucleases eucarióticas no NMD e NSD, assim como na degradação do mRNA normal. Assim sendo, estudámos o papel das exoribonucleases DIS3, DIS3L1, DIS3L2 e PM/Scl100, que atuam de 3’-5’, XRN1, que atua de 5’-3’ e a endoribonuclease SMG6, que cliva o mRNA no interior da molécula. Com o objetivo de identificar o papel das ribonucleases nos diferentes mecanismos de degradação do mRNA,silenciaram-se as diferentes ribonucleases (endoe exo-) em células HeLa. Estas células foram também transfetadas transientemente com construções contendo diferentes variantes do gene da beta(β)-globina humana. Nas variantes do gene da β-globina utilizadas neste estudo incluem-se: β-globina normal (βWT, do inglês β-globin wild-type), β-globina com uma mutação nonsense no codão 15 (β15), que é resistente ao NMD, duas variantes sensíveis ao NMD com mutações nonsense no codão 26 ou 39 (β26 e β39) e uma variante sem qualquer codão nonsense, sensível ao NSD (βNS). Em seguida, avaliou-se por transcriptase-reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR, do inglês reverse-transcription followed by polymerase chain reaction) as alterações nos níveis de mRNA. Os nossos resultados mostram que em células eucarióticas as ribonucleases não são exclusivas de qualquer mecanismo de degradação do mRNA. Com o intuito de perceber de que maneira cada uma das ribonucleases estaria envolvida no NMD, realizámos o silenciamento (KD, do inglês knockdown) de cada uma das ribonucleases e medimos por RT-qPCR as alterações nos níveis de mRNA de alvos endógenos de NMD. Os nossos resultados apontam para que a atuação das ribonucleases varie consoante as características de cada um dos alvos de NMD. Curiosamente, mostrámos, pela primeira vez, que DIS3L2 está envolvida na degradação de alvos naturais do NMD. Com o intuito de perceber qual o mecanismo pelo qual a DIS3L2 atua na degradação de alvos naturais do de NMD, realizou-se o KD da DIS3L2 e da UPF1, fator essencial para o NMD, em separado e em conjunto. Verificou-se que o KD duplo não produzia um efeito aditivo, indicando que a degradação pela DIS3L2 não é independente da degradação promovida pela UPF1. Seguidamente, testou-se o tempo de meia-vida de alguns alvos endógenos de NMD com e sem o KD da DIS3L2, o que nos permitiu concluir que a DIS3L2 atua diretamente sobre os alvos do NMD. Recentemente foi descrito que a degradação de mRNAs pela DIS3L2 depende da adição de uridinas (U) por proteínas denominadas terminal urydil transferases (TUTases), mais particularmente as TUTases 4 (TUT4) e 7 (TUT7). Neste mecanismo as TUT4-TUT7, ao uridilar os mRNAs marcam-nos para degradação pela DIS3L2. Considerando estes dados, testámos a hipótese de os alvos de NMD poderem ser uridilados. Os nossos dados mostram que a acumulação dos alvos naturais de NMD observada após o KD da DIS3L2 é dependente da atividade das TUT4+TUT7, estabelecendo um papel para a uridilação na degradação de alvos do NMD pela DIS3L2. Com base nestes resultados estabelecemos como terceiro objetivo elucidar como a DIS3L2 modula o transcriptoma eucariótico. Com este objetivo, realizou-se sequenciação do RNA total (RNA-seq, do inglês RNA sequencing) na linha celular derivada de cancro colorretal (CRC, do inglês colorectal cancer) SW480. Para tal, efetuámos o KD da DIS3L2 e o KD triplo das DIS3L2+TUT4+TUT7. Isso permitirá descobrir como a DIS3L2, assim como a uridilação pelas TUT4-TUT7, modula(m) o transcriptoma num contexto de uma linha celular de CRC. Em suma, esta dissertação cumpriu os objectivos propostos, dado que demonstra de que maneira as ribonucleases estão envolvidas no turnover normal do mRNA, e nos mecanismos de controlo de qualidade NMD e NSD. Para além disso, este trabalho também mostra, pela primeira vez, o envolvimento da DIS3L2 no NMD e na regulação da expressão génica de alvos naturais do NMD. Ademais, mostra-se que a degradação dos alvos de NMD pela DIS3L2 é dependente da atividade das TUTases. Assim, este trabalho abre novos caminhos de investigação e revela (possivelmente) um novo ramo do mecanismo do NMD. Tendo em vista que o mecanismo do NMD está envolvido na regulação da expressão génica de vários genes envolvidos em diversas doenças (como o cancro, por exemplo), compreender o mecanismo pelo qual a DIS3L2 regula a expressão de um subconjunto de alvos naturais do NMD poderá revelar novas maneiras de abordar essas doenças.
A expressão génica nos organismos eucariotas é um processo complexo, composto por inúmeros passos altamente regulados. A expressão génica depende muito da regulação feita ao nível do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA, do inglês messenger RNA). Em organismos eucariotas, o mRNA é a molécula responsável pela transferência de informação, desde o ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid) que se encontra no núcleo, até a produção de proteínas no citoplasma. O mRNA eucariótico passa por vários processos, tanto no núcleo como no citoplasma, desde o momento em que é transcrito até ser degradado. Durante esses processos o mRNA adquire algumas características/estruturas que lhe conferem mais estabilidade, protegendo-o da degradação por enzimas capazes de degradar o mRNA, as ribonucleases. Entre essas características/estruturas encontram-se a adição da estrutura cap na extremidade 5’ e a adição de até 200 adeninas (A), denominada cauda poli(A), na extremidade 3’. A estrutura cap e a cauda poli(A) protegem os mRNAs da degradação de 5’-3’ e de 3’-5’, respetivamente. Como durante todos esses processos podem ocorrer erros, as células têm vários mecanismos de vigilância, também denominados mecanismos de controlo de qualidade, que detetam e degradam mRNAs não-funcionais ou anómalos. Entre estes mecanismos de controlo de qualidade, destaca-se o decaimento de mRNA mediado por codões nonsense (NMD, do inglês nonsense mediated mRNA decay). Um codão nonsense é um codão que induz a terminação da tradução do mRNA. O NMD é um mecanismo de vigilância que deteta e degrada mRNAs que contêm um codão de terminação da tradução prematuro (PTC, do inglês premature translation-termination codon). Se não forem degradados, os mRNAs que contenham PTC levam a produção de proteínas truncadas, que para além de poderem não ser funcionais, podem ser prejudiciais para as células. No entanto, para além do papel do NMD como mecanismo de controlo da qualidade, sabe-se que o NMD também regula a abundância de um grande número de mRNAs fisiológicos, que codificam proteínas inteiras e funcionais. Em células humanas, sabe-se que os mRNAs degradados pelo NMD são degradados por clivagem endonucleolítica e/ou degradação exonucleolítica a partir de ambas as extremidades (5' e/ou 3'). Este processo ainda não é totalmente conhecido, sabendo-se que o NMD recruta, entre outras, as proteínas responsáveis por retirar a estrutura cap (processo denominado decapping) e pela degradação da cauda poli(A) (processo denominado desadenilação). Para além destas, o NMD também recruta as ribonucleases responsáveis por degradar os mRNAs de 5’-3’ e de 3’-5’. Tal como referido anteriormente, existem outros mecanismos de controlo de qualidade do mRNA. É o caso do mecanismo de controlo da qualidade do mRNA mediado pela ausência de um codão de terminação da tradução (NSD, do inglês nonstop decay). O NSD deteta e degrada mRNAs que não possuem qualquer codão de terminação da tradução. Este trabalho teve como principal objetivo desvendar o papel das ribonucleases eucarióticas no NMD e NSD, assim como na degradação do mRNA normal. Assim sendo, estudámos o papel das exoribonucleases DIS3, DIS3L1, DIS3L2 e PM/Scl100, que atuam de 3’-5’, XRN1, que atua de 5’-3’ e a endoribonuclease SMG6, que cliva o mRNA no interior da molécula. Com o objetivo de identificar o papel das ribonucleases nos diferentes mecanismos de degradação do mRNA,silenciaram-se as diferentes ribonucleases (endoe exo-) em células HeLa. Estas células foram também transfetadas transientemente com construções contendo diferentes variantes do gene da beta(β)-globina humana. Nas variantes do gene da β-globina utilizadas neste estudo incluem-se: β-globina normal (βWT, do inglês β-globin wild-type), β-globina com uma mutação nonsense no codão 15 (β15), que é resistente ao NMD, duas variantes sensíveis ao NMD com mutações nonsense no codão 26 ou 39 (β26 e β39) e uma variante sem qualquer codão nonsense, sensível ao NSD (βNS). Em seguida, avaliou-se por transcriptase-reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR, do inglês reverse-transcription followed by polymerase chain reaction) as alterações nos níveis de mRNA. Os nossos resultados mostram que em células eucarióticas as ribonucleases não são exclusivas de qualquer mecanismo de degradação do mRNA. Com o intuito de perceber de que maneira cada uma das ribonucleases estaria envolvida no NMD, realizámos o silenciamento (KD, do inglês knockdown) de cada uma das ribonucleases e medimos por RT-qPCR as alterações nos níveis de mRNA de alvos endógenos de NMD. Os nossos resultados apontam para que a atuação das ribonucleases varie consoante as características de cada um dos alvos de NMD. Curiosamente, mostrámos, pela primeira vez, que DIS3L2 está envolvida na degradação de alvos naturais do NMD. Com o intuito de perceber qual o mecanismo pelo qual a DIS3L2 atua na degradação de alvos naturais do de NMD, realizou-se o KD da DIS3L2 e da UPF1, fator essencial para o NMD, em separado e em conjunto. Verificou-se que o KD duplo não produzia um efeito aditivo, indicando que a degradação pela DIS3L2 não é independente da degradação promovida pela UPF1. Seguidamente, testou-se o tempo de meia-vida de alguns alvos endógenos de NMD com e sem o KD da DIS3L2, o que nos permitiu concluir que a DIS3L2 atua diretamente sobre os alvos do NMD. Recentemente foi descrito que a degradação de mRNAs pela DIS3L2 depende da adição de uridinas (U) por proteínas denominadas terminal urydil transferases (TUTases), mais particularmente as TUTases 4 (TUT4) e 7 (TUT7). Neste mecanismo as TUT4-TUT7, ao uridilar os mRNAs marcam-nos para degradação pela DIS3L2. Considerando estes dados, testámos a hipótese de os alvos de NMD poderem ser uridilados. Os nossos dados mostram que a acumulação dos alvos naturais de NMD observada após o KD da DIS3L2 é dependente da atividade das TUT4+TUT7, estabelecendo um papel para a uridilação na degradação de alvos do NMD pela DIS3L2. Com base nestes resultados estabelecemos como terceiro objetivo elucidar como a DIS3L2 modula o transcriptoma eucariótico. Com este objetivo, realizou-se sequenciação do RNA total (RNA-seq, do inglês RNA sequencing) na linha celular derivada de cancro colorretal (CRC, do inglês colorectal cancer) SW480. Para tal, efetuámos o KD da DIS3L2 e o KD triplo das DIS3L2+TUT4+TUT7. Isso permitirá descobrir como a DIS3L2, assim como a uridilação pelas TUT4-TUT7, modula(m) o transcriptoma num contexto de uma linha celular de CRC. Em suma, esta dissertação cumpriu os objectivos propostos, dado que demonstra de que maneira as ribonucleases estão envolvidas no turnover normal do mRNA, e nos mecanismos de controlo de qualidade NMD e NSD. Para além disso, este trabalho também mostra, pela primeira vez, o envolvimento da DIS3L2 no NMD e na regulação da expressão génica de alvos naturais do NMD. Ademais, mostra-se que a degradação dos alvos de NMD pela DIS3L2 é dependente da atividade das TUTases. Assim, este trabalho abre novos caminhos de investigação e revela (possivelmente) um novo ramo do mecanismo do NMD. Tendo em vista que o mecanismo do NMD está envolvido na regulação da expressão génica de vários genes envolvidos em diversas doenças (como o cancro, por exemplo), compreender o mecanismo pelo qual a DIS3L2 regula a expressão de um subconjunto de alvos naturais do NMD poderá revelar novas maneiras de abordar essas doenças.
Description
Tese de doutoramento em Biologia (Biologia de Sistemas), apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018
Keywords
Nonsense-mediated mRNA Decay DIS3L2 mRNA Decay Uridylation Ribonucleases Degradação de mRNA Mediada por Mutações nonsense DIS3L2 Degradação do mRNA Uridilação Ribonucleases Genómica Funcional Genómica Funcional e Estrutural