DDI - Dissertações de mestrado
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Browsing DDI - Dissertações de mestrado by Author "Henriques, Camila Valadas"
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- Avaliação da resistência de Trichophyton rubrum ao antifúngico terbinafina e caracterização fenotípica e genotípica de fungos dermatófitosPublication . Henriques, Camila Valadas; Sabino, Raquel; Dias, DeodáliaOs dermatófitos são um grupo de fungos filamentosos com uma distribuição cosmopolita, que têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados (pele, cabelo e unhas) de humanos e outros animais e provocar uma infeção superficial denominada de dermatofitose. As dermatofitoses são responsáveis por 3 - 4% dos casos afeções dermatológicas, sendo a infeção superficial mais comum em humanos (com uma prevalência entre os 20-25%). No entanto, espera-se que a sua prevalência continue a aumentar devido ao aparecimento de novos fatores de risco. As espécies do género Trichophyton são os principais agentes causadores de patologias como pé de atleta e onicomicose nas mãos e pés e estima-se que afete ~1.000.000.000 de pessoas em todo o mundo. T. rubrum e T. interdigitale são os principais agentes etiológicos com prevalências de 80% e 20%, respetivamente. Em Portugal, é estimado que 1.510.391 de portugueses sofram de dermatofitoses, correspondendo a uma incidência de 14.300 infeções por dermatófitos por cada 1.000.000 de habitantes. Para o tratamento das dermatofitoses, a primeira terapia a ser prescrita é, na grande maioria dos casos, a terbinafina. Desde 2017 que os casos de resistência a este antifúngico por parte de T. rubrum e T. interdigitale têm vindo a aumentar gradualmente. Os mecanismos de resistência à terbinafina são, essencialmente, descritos como mutações pontuais no gene que codifica a esqualeno epoxidase. Assim, neste estudo, procurámos perceber se a problemática de resistência ao antifúngico terbinafina em T. rubrum e T. interdigitale estaria ou não negligenciada em Portugal. Cento e sessenta e quatro isolados de T. rubrum e T. interdigitale foram identificados até à espécie através de tecnologias moleculares e também com recurso a espectoctrometria de massa (MALDI-TOF). De seguida, verificámos a presença da resistência ao antifúngico terbinafina nestes isolados e pesquisámos as mutações associadas a essa mesma resistência. Para tal, procedemos à otimização e implementação de metodologias que permitiram efetuar a avaliação da resistência de isolados de T. rubrum e T. interdigitale, quer por método cultural quer por metodologias moleculares com sequenciação do gene da esqualeno epoxidase (SQLE) seguida de deteção de mutações neste gene que conferem resistência a este composto. A caracterização dos padrões de suscetibilidade ao antifúngico terbinafina foi feita recorrendo a meios de screening (agar suplementado com terbinafina) e ao método das microdiluições em caldo. Numa primeira abordagem, de 102 isolados de T. rubrum, apenas 1 isolado (nº126) revelou ser resistente á terbinafina por meio de screening e dos 17 isolados T. interdigitale, apenas 3 demonstraram ser resistentes à terbinafina por meio de screening em ambas as concentrações utilizadas definidas pela norma EUCAST (0.06 mg/L e 0.125 mg/L). De acordo com a metodologia das microdiluições, 2,44% dos isolados apresentaram menor suscetibilidade à terbinafina. Os nossos resultados demonstram que o isolado nº126 (T. rubrum) revelou ser bastante resistente à terbinafina com uma CMI de 8 mg/L, os isolados nº 63 e nº94 (T. interdigitale) apresentaram CMIs superiores a 8 mg/L o que representa uma baixa suscetibilidade à terbinafina. O isolado T. interdigitale nº 59 apresentou uma CMI igual a 1 mg/L o que revela uma resistência moderada à terbinafina. A otimização da PCR de amplificação e sequenciação do gene da SQLE de T. rubrum e T. interdigitale permitiu a deteção de mutações pontuais apenas num isolado de cada espécie num total de quatro isolados classificados como resistentes. O isolado T. rubrum nº126, após análise da sequência do gene da SQLE, apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE o que corresponde a uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma isoleucina. Apesar de as substituições mais comuns e que levam a uma maior resistência à terbinafina serem L393F e F397L, a substituição F397I detetada no isolado T. rubrum deste estudo, sugere causar uma elevada resistência à terbinafina. Relativamente aos isolados resistentes T. interdigitale, apenas o isolado nº 94 apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE, ocorrendo uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma leucina, o que confirma a sua CMI superior a 8 mg/L. Nos restantes isolados resistentes pertencentes à espécie T. interdigitale, não foram encontradas quaisquer mutações no gene que codifica a SQLE. Este estudo, permitiu-nos efetuar uma caracterização da população amostrada, das amostras biológicas e dos isolados do género Trichophyton obtidos por cultura destas amostras. Foi também possível detetar, pela primeira vez, isolados do género Trichophyton resistentes à terbinafina em Portugal. Foi ainda possível estimar, dentro dos isolados estudados, uma frequência de resistência de 2,44%. A resistência à terbinafina por parte de T. rubrum e T. interdigitale é um problema real em todo o mundo e estima-se que os casos continuem em aumentar e por isso acreditamos que, a aplicação do método de screening e das microdiluições bem como a implementação da reação de PCR para pesquisa de mutações que conferem essa mesma resistência será uma mais valia e um contributo importante no que toca ao diagnóstico e posterior terapia das dermatofitoses reportadas em Portugal.