DDI - Dissertações de mestrado
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Browsing DDI - Dissertações de mestrado by advisor "Crespo, Ana"
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- Desenvolvimento de um ensaio para genotipagem do vírus da Hepatite C numa população de infectados em ambiente prisionalPublication . Avó, Ana Patricia; Pádua, Elizabeth; Crespo, Ana[PT] O vírus da hepatite C (VHC) é caracterizado por uma elevada variabilidade genética traduzida na sua classificação em 6 diferentes genótipos, e em mais de 80 subtipos com distintos padrões de distribuição epidemiológica no mundo. Os vários genótipos estão associados a uma diferente evolução da infecção e progressão da doença, sendo por isso a classificação do VHC a principal ferramenta do clínico para a determinação da dosagem e duração do tratamento dos doentes. O presente estudo pretendeu desenvolver um método alternativo de genotipagem e subtipagem do VHC, no contexto de um laboratório de referência, que permitisse por um lado, reduzir os custos, e por outro lado, obter uma melhoria na classificação do vírus. No presente trabalho foram analisadas amostras de referência e amostras clínicas de 72 reclusos infectados por VHC, com resultados previamente conhecidos dos níveis de RNA e de genotipagem obtidos pelo método comercial LiPA. As amostras foram sujeitas a extracção de RNA e síntese de cDNA, amplificação por heminested PCR e sequenciação, e ainda, a análise filogenética de sequências nucleotídicas das regiões C/E1 e NS5B do VHC. Os resultados foram comparados com os previamente conhecidos obtidos pelo método LiPA. Independentemente das regiões genómicas, a subtipagem do VHC pelo método desenvolvido foi conseguida em 95,8% (69/72) dos casos, uma proporção bastante superior comparativamente à obtida no método LiPA (47,2%, 34/72), mostrando assim um melhor desempenho em identificar ou discriminar o subtipo VHC. Informação molecular conjunta para as duas regiões genómicas foi obtida em 88,9% (64/72) dos casos com identificação de um recombinante intergenótipo 1b/2k e um recombinante intragenótipo 2q/2k para a região C/E1 e 2k/2a para a região NS5B. Adicionalmente, 2 casos apresentaram uma classificação de VHC discordante, 1b/4a e 3a/4a, respectivamente para as regiões C/E1 e NS5B analisadas. Contudo, nestes casos não foi possível descartar a hipótese de possíveis infecções mistas. O elevado desempenho do método desenvolvido na detecção e classificação do VHC pode possibilitar de um modo mais preciso uma correlação clínica com os subtipos virais do VHC, e deste modo viabilizar um melhor entendimento do papel da variabilidade genómica na história natural e progressão da infecção do VHC.
- Desenvolvimento de uma técnica de PCR em Tempo Real para deteção do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1Publication . Almeida, Vanessa; Pádua, Elizabeth; Crespo, Ana[PT] As crianças verticalmente infetadas por VIH-1 têm elevado risco de progressão para SIDA nos primeiros anos de vida. Por um lado, este facto evidencia a importância do diagnóstico precoce da infeção permitindo tratamento atempado, e por outro lado, fundamenta ainda a procura constante da melhoria dos ensaios experimentais de diagnóstico. A técnica de nested PCR implementada no laboratório para diagnóstico precoce é sensível e específica, mas obriga a uma manipulação de produtos amplificados com maior risco da ocorrência de contaminações. É também considerado um método moroso já que associa a duas reações de amplificação sequenciais uma eletroforese em gel de agarose para deteção dos produtos amplificados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio experimental sensível e específico, alternativo à técnica de nested PCR, que pudesse conduzir à obtenção de ganhos no tempo de saída de resultados e na redução do risco de ocorrência de contaminações. Diferentes ensaios experimentais de PCR em Tempo Real foram desenvolvidos para a amplificação de fragmentos do VIH-1 (região LTR e pol) e efetuada uma avaliação prévia de resultados com a utilização de 3 grupos de amostras de referência: amostras positivas (n=15), amostras com ADN VIH-1 quantificado (n=8) e amostras negativas (n=11, positivas para VIH-2). Nos ensaios, foram diretamente testadas amostras de ADN viral extraído de CMSP ou sintetizado a partir de plasma, e também, amostras correspondentes a produtos de PCR gerados por uma prévia amplificação do ADN através de PCR Convencional. Foi selecionado o algoritmo experimental que revelou melhor desempenho na deteção da infeção VIH-1 para análise de amostras clinicas. Estas amostras foram obtidas entre 2009 e 2011, e correspondem a amostras colhidas a mães infetadas (positivas VIH-1, n=149) e a filhos em que não ocorreu a transmissão do vírus (amostras negativas, n=20). O algoritmo experimental em Tempo Real escolhido correspondeu à amplificação de fragmentos de VIH-1 (região LTR) utilizando a combinação dos primers HL456N e HL602C com a sonda TaqMan SHL478N, a partir de amostras de ADN previamente submetidas a PCR Convencional com os primers externos HL456N e HL650C. Em resultado da prévia avaliação com amostras de referência, este algoritmo revelou sensibilidade de 86,7% e um limite de deteção ADN VIH-1 de 0,8 cópias/amostra. Com amostras clínicas foi obtida uma sensibilidade de 75,2 % e de especificidade de 100%. A confirmação da infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 87,5% dos casos (112 casos positivos entre 128 estudados). Foi também obtido um valor de Kappa de 0,417 que mostrou uma concordância moderada entre resultados esperados e obtidos. Comparativamente, na técnica de nested PCR eram conhecidos valores de sensibilidade e especificidade respetivamente de 81,9% e 100% e uma concordância estimada pelo valor de Kappa de 0,565. A confirmação dos casos de infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 95,3% dos casos (122 casos positivos entre 128 estudados). Embora se tenha conseguido informação útil e obtido ganhos em tempo através do algoritmo experimental desenvolvido, este apresenta sensibilidade inferior à técnica de nested PCR utilizada no laboratório. Deste modo, para além do aumento da população/amostras em estudo, que se concluiu ser necessário para melhor tratamento estatístico dos resultados, será também essencial um incremento da sensibilidade dos ensaios que poderá ser obtido explorando outras regiões genómicas alvo alternativas às utilizadas no presente estudo.