DSA - Dissertações de mestrado
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Browsing DSA - Dissertações de mestrado by advisor "Dias, Deodália"
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- Avaliação da expressão de genes envolvidos na síntese de microcistinas em cianobactérias tóxicas sujeitas a diferentes intensidades de luzPublication . Salvador, Daniel; Valério, Elisabete; Dias, Deodália[PT] As cianobactérias são um grupo de microrganismos fitoplanctónicos, procariotas unicelulares, aeróbios e autotróficos. Encontram-se difundidos numa ampla variedade de habitats, ainda assim, são especialmente comuns em ambientes de água doce. A maioria das espécies existe normalmente em baixas concentrações no ambiente, no entanto, quando as condições ambientais são favoráveis, as células podem proliferar massivamente, levando à formação de florescências (blooms). Os blooms são um problema bastante actual e crescente em todo o mundo, dado que por vezes podem ser tóxicos e causar intoxicações e até a morte. A sua toxicidade resulta da capacidade que algumas espécies de cianobactérias produzirem toxinas. Dos vários grupos de cianotoxinas, as hepatotoxinas são umas das que mais frequentemente estão relacionadas com intoxicações. Deste grupo, as microcistinas são as mais comuns em corpos de água doce portugueses. A crescente consciencialização dos seus riscos tem resultado em vários estudos para compreender o seu mecanismo de síntese e os factores que podem regular/influenciar o mesmo. A síntese das microcistinas é não ribossomal, a partir de um mecanismo característico de tio-molde, e utilizando complexos multienzimáticos codificados pelos genes mcy. Relativamente aos factores regulatórios, diversos estudos têm vindo a demonstrar que os factores ambientais podem induzir alterações na concentração/produção de cianotoxinas, designadamente o pH, a concentração/proporção de nutrientes, a temperatura e a intensidade de luz. No entanto a informação existente não é consensual. Assim, este estudo tem como objectivo principal avaliar a influência da intensidade de luz na transcrição do gene mcyA e correspondente produção de microcistina em diferentes cianobactérias tóxicas. Simultaneamente pretendeu-se avaliar a influência das diferentes intensidades de luz na taxa de crescimento e ainda avaliar diferentes genes de referência para a normalização da expressão génica, obtida em RT-qPCR. Foram utilizados dois isolados produtores de microcistina - Microcystis aeruginosa (LMECYA 7) e Planktothrix agardhii (LMECYA 256). As culturas foram expostas durante 18 dias a três diferentes intensidades de luz (4, 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1) a uma temperatura de 20 ± 1ºC. Diariamente recolheram-se amostras para avaliar o crescimento das culturas, através da medição da densidade óptica. Em cada fase do crescimento colheram-se também amostras (três vezes) para efectuar a contagem celular, quantificação das microcistinas pela técnica de ELISA e extracção de RNA. Neste trabalho foi avaliada a expressão do gene mcyA pertencente ao cluster mcy, por RT-qPCR. Para além disso, foram ainda estudados genes de referência (rRNA 16S, gltA e rpoC1). Verificou-se uma correlação entre a taxa de crescimento e a intensidade de luz, quer em M. aeruginosa, quer em P. agardhii. As taxas de crescimento em ambas as espécies foram menores a 4 μmol de fotões m-2 s-1 e maiores a 30 μmol de fotões m-2 s-1. As diferenças foram mais acentuadas entre o crescimento na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1 e o crescimento nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre estas últimas duas intensidades a taxa foi bastante semelhante. O efeito das diferentes intensidades de luz foi mais acentuado em M. aeruginosa do que em P. agardhii. As concentrações de microcistina por célula em M. aeruginosa foram semelhantes entre intensidades de luz, sobretudo nas duas primeiras fases do crescimento. Apenas na fase estacionária as concentrações de toxina diferiram consideravelmente, tendo a maior produção ocorrido a 30 μmol de fotões m-2 s-1 e a menor a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii houve maiores diferenças na concentração de microcistina por célula entre intensidades de luz e fases do crescimento. A maior produção ocorreu a 4 μmol de fotões m-2 s-1 na fase estacionária e a menor a 20 μmol de fotões m-2 s-1 na fase exponencial de crescimento. Relativamente à estabilidade dos genes de referência, o gene rRNA 16S foi o menos estável em M. aeruginosa, mas o mais estável em P. agardhii, tendo em conta os algoritmos geNorm e NormFinder. O gene rpoC1 foi o mais estável em M. aeruginosa e o menos estável em P. agardhii, tendo em consideração os mesmos algoritmos. Usando o algoritmo BestKeeper, o gene gltA foi classificado como o mais estável em ambas as espécies. Utilizaram-se assim os genes rpoC1 e gltA em M. aeruginosa e os genes rRNA 16S e gltA em P. agardhii na normalização da expressão do gene mcyA. A expressão do gene mcyA nas três fases do crescimento em M. aeruginosa foi sempre significativamente diferente entre a intensidade 4 μmol de fotões m-2 s-1 e as intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1, sendo que entre estas duas últimas a expressão foi semelhante. A maior expressão deu-se na intensidade de 4 μmol de fotões m-2 s-1. Em P. agardhii, apenas nas duas últimas fases do crescimento a expressão do mcyA foi significativamente diferente entre as várias intensidades luz. Nas duas últimas fases, os níveis de expressão de mcyA nas intensidades de 20 e 30 μmol de fotões m-2 s-1 foram inferiores ao nível de expressão a 4 μmol de fotões m-2 s-1. Já entre as duas intensidades de luz mais altas a expressão foi muito idêntica. A análise da evolução temporal da expressão do gene mcyA em cada intensidade de luz mostrou que em M. aeruginosa, de uma forma geral, a expressão variou sobretudo entre a fase de adaptação e a fase exponencial de crescimento. Os níveis de expressão foram máximos na fase de adaptação nas três intensidades de luz. Em P. agardhii, os níveis de expressão de mcyA ao longo do tempo não variaram igualmente nas três intensidades de luz. Ainda assim, a maior expressão observou-se na fase exponencial de crescimento. Não se verificou correspondência entre a expressão génica e a quantidade de microcistina efectivamente produzida por célula em nenhuma das espécies, pois as alterações verificadas na expressão de mcyA ao longo do tempo não foram acompanhadas por variações no mesmo sentido da quantidade de microcistina por célula. Conclui-se assim, que as intensidades de luz testadas influenciaram tanto o crescimento, como a produção de microcistina, como a expressão do gene mcyA, ainda que de forma diferente em M. aeruginosa e P. agardhii. Revelando que ainda há muitas questões em aberto que necessitam de ser esclarecidas em estudos futuros.
- Avaliação da resistência a antibióticos em estirpes de cianobactérias isoladas de ambientes hídricosPublication . Oliveira, Micaela; Dias, Elsa; Dias, Deodália[PT] Os ambientes hídricos constituem veículos para a emergência e disseminação da resistência a antibióticos. As cianobactérias encontram-se amplamente distribuidas nestes ambientes, estando frequentemente expostas a antibióticos, bactérias resistentes e genes de resistência. Contudo, o seu papel no resistoma hídrico nunca foi investigado. Este trabalho pretendeu avaliar a susceptibilidade de oito estirpes de Microcystis aeruginosa, oito estirpes de Planktothrix agardhii e oito estirpes de Planktothrix mougeotii a diferentes antibióticos (amoxicilina, ceftazidima, ceftriaxona, canamicina, gentamicina, tetraciclina, ácido nalidíxico, norfloxacina e trimetoprim). Para tal, foi utilizado um procedimento baseado no método standard Broth Microdilution para bactérias, no qual as cianobactérias foram expostas a diluições sucessivas de cada antibiótico em meio Z8 (0,0015 mg/L – 1,6 mg/L) e mantidas numa câmara de culturas sob ciclos de 14 horas de luz – com uma intensidade de 16 ± 4 μEm-2 s-1 – e 10 horas de escuro, a uma temperatura de 20 ± 1ºC. O crescimento celular foi seguido durante 14 dias (observação macroscópica, microscópica e leitura da DO450nm) e as concentrações inibitórias mínimas de cada antibiótico (CIMs) foram calculadas para cada estirpe. Nenhuma das estirpes foi susceptível a qualquer das concentrações de ácido nalidíxico e de trimetoprim testadas. Adicionalmente, as estirpes de M. aeruginosa apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina, as estirpes de P. agardhii apresentaram uma susceptibilidade reduzida à norfloxacina e as estirpes de P. mougeotii não foram susceptíveis à amoxicilina nem à norfloxacina e apresentaram uma susceptibilidade reduzida à tetraciclina. Foi também pesquisada a presença de genes e de integrões associados à resistência a antibióticos nas cianobactérias em estudo por PCR e posterior sequenciação dos produtos obtidos. Foram encontrados genes de resistência à estreptomicina numa estirpe de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em quatro estirpes de P. mougeotii; genes de resistência às sulfonamidas em quatro estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em cinco estirpes de P. mougeotii; integrões de classe 1 em duas estirpes de M. aeruginosa, em três estirpes de P. agardhii e em três estirpes de P. mougeotii. Adicionalmente, o gene qacE foi encontrado numa estirpe de M. aeruginosa e numa estirpe de P. agardhii. Os resultados obtidos sugerem que as cianobactérias apresentam resistência intrínseca a alguns antibióticos e que, de acordo com o seu local de origem, podem apresentar resistência adquirida a outros. Assim, tudo indica que, de facto, as cianobactérias desempenham um papel importante no resistoma hídrico.
- Evaluation of cytotoxic and genotoxic effects of Microcystin-LR in Saccharomyces cerevisiaePublication . Barreiros, Sara; Valério, Elisabete; Dias, DeodáliaMicrocystins (MC) are hepatotoxins produced by cyanobacteria. Among the MCs, the microcystin-LR (MC-LR), produced by several cyanobacterial species, especially by the species Microcystis aeruginosa, is the most abundant and also the most well studied cyanotoxin. MCs are cyclic peptides which have high affinity for protein phosphatases Serine/Threonine (PPs), namely PP1 and PP2A, thus acting as their inhibitors, especially of the last one. It is from these interactions that a series of events occur which are responsible for the MCs cytotoxic and genotoxic effects on animal cells. It is also known that MCs induce oxidative stress in cells due to the production of reactive oxygen species (ROS), however a complete characterization of the effects of these toxins has not yet been obtained. This project intends to clarify some of the molecular mechanisms of MC-LR toxicity in animal cells using Saccharomyces cerevisiae as an eukaryotic organism model. To evaluate the cytotoxic effects of MC-LR, a cell viability assay was used to determine the functional capacity of the mitochondria, the MTT assay, after exposing the yeasts to different concentrations of MC-LR for 4 hours. Genotoxic effects were evaluated by gene expression studies for genes Rad27, Apn1, Apn2, Ntg1 and Ntg2 (from the BER DNA repair system) and Cdc55 gene which encodes the PP2A phosphatase protein, using the Real-Time qPCR technique. The reference genes used for expression normalization were Alg9 and Taf10. Furthermore, it was attempted to adapt the single cell gel electrophoresis assay (comet assay), conventionally performed on mammalian cells, to Saccharomyces cerevisiae cells, in order to quantify induced DNA breaks. MTT was optimized and successfully used in S. cerevisiae. Apparently, MC-LR is not cytotoxic for Saccharomyces cerevisiae, although these results should be confirmed with other methods that accessed cell viability. Regarding the Comet assay, the results were not conclusive, possibly due to the difficulty in optimizing the method when applied to yeast cells, particularly in the DNA migration on the electric field. However, the first two steps of the YCA protocol were optimized. Concerning the RTqPCR method it was possible to obtain tendencies in the gene expression levels, when compared with the control situation, thus revealing that MC-LR affects differently both BER pathways. Despite the difficulty of reproducing some methods in yeast cells, it appears that microcystin- LR plays a critical role in the toxicity of eukaryotic cells. This work allowed us to contribute with a little more information to a still relative unknown study field.
- Fungos em areias e águas costeiras e interiores em Portugal: relevância para a saúde humana e bem-estarPublication . Brito, Sara; Valério, Elisabete; Dias, DeodáliaOs fungos filamentosos e as leveduras são omnipresentes na natureza, incluindo nas zonas balneares. A areia frequentada por pessoas e por animais tem uma população crescente de fungos específicos de humanos e específicos de animais, em comparação com a areia não frequentada por pessoas e animais. Contudo, certas espécies de fungos podem causar infeções ou alergias em humanos. Estudos anteriores mostraram que existem microrganismos patogénicos ou patogénicos oportunistas que sobrevivem e crescem na areia. O conjunto de doenças resulta da inalação e da ingestão de esporos fúngicos e de células vegetativas, ou do contato direto com células fúngicas. Uma vez que as zonas balneares são locais frequentados por um elevado número de pessoas, especialmente no verão, a qualidade microbiológica das areias e das águas balneares é particularmente importante. Assim sendo, o objetivo deste estudo é a recolha de dados sobre as espécies de fungos existentes nas três zonas balneares em estudo – Carcavelos, Alburrica e Praia Verde. A identificação dos isolados foi realizada através da observação de caracteres morfológicos e através de ferramentas moleculares. Para isto, foram analisadas 18 amostras de areia e 18 amostras de água. No total, nas amostras de areia foram identificados 1 538 isolados, ao passo que nas amostras de água foram identificados 180 isolados. Os isolados fúngicos detetados com mais frequência foram Cladosporium sp. (na Praia Verde e em Alburrica) e Acremonium kiliense (em Carcavelos). Foram também identificadas algumas espécies responsáveis por causar alergias e infeções, tais como Exophiala dermatitidis, Alternaria alternata, Trematosphaeria grisea e Aspergillus nidulans. No entanto, não foi possível identificar 19 isolados presentes nas amostras. A realização desta dissertação permitiu identificar os isolados fúngicos presentes nos locais em estudo, assim como a frequência de cada uma das espécies presente nas amostras. Permitiu também verificar a presença de determinadas espécies que podem provocar doenças graves, o que representa um risco para a saúde dos utilizadores das praias.