Otimização do tampão de extração da amostra para a determinação de folatos por UPLC-MS/MS

Mota, Carla; Delgado, Inês; Santos, Mariana; André, Catarina; Castanheira, Isabel

http://hdl.handle.net/10400.18/2462

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Os folatos fazem parte de um grupo de vitaminas hidrossolúveis essenciais ao desenvolvimento e manutenção do organismo humano. O método de UPLC–MS/MS foi estabelecido como o método de eleição para a determinação simultânea dos diferentes folatos presentes na matriz alimentar. O objetivo deste trabalho foi otimizar o método de preparação de amostra para a determinação de 5 folatos, ácido fólico (FA), 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF), tetrahidrofolato (THF), 5-formiltetrahidrofolato (5-CHOTHF) e 10-formiltetrahidrofolato (10-CHOTHF) utilizando um cromatógrafo líquido de ultra eficiência com deteção por espectrometria de massa num triplo quadrupolo (UPLC-MS/MS). Para realizar a extração dos folatos da matriz é necessário dissolver a amostra em tampão, pH 6.9 para posterior tratamento trienzimático. O tratamento utilizado inclui α-amilase em banho de água, 1 hora a 75ºC, protease, 2 horas a 37ºC e soro de rato 2 horas a 37ºC, seguido de um processo de extração em fase sólida. Neste protocolo foram testados seis tampões, dois fosfato descritos em grande parte da literatura [1][2][3] e quatro tampões bicarbonato, voláteis e por isso recomendados pelo fabricante como preferencial em análise com detetores de massas. Os tampões foram usados para dissolução dos diferentes padrões e de amostras de cereais de pequeno-almoço e estão descritos na tabela 1. O cromatógrafo utilizado foi um AcQuity UPLC-TQD da Waters. O método cromatográfico utiliza uma coluna AcQuity HSS T3 1.8 μm 2.1 x 150 mm da Waters. Os solventes da fase móvel utilizados foram uma solução 0.1 % ácido fórmico (A) e acetonitrilo (B) em gradiente. A temperatura da coluna utilizada foi de 45 ˚C e o fluxo da fase móvel foi de 0.35 mL/min.Da análise dos espetros de massa respeitantes à infusão direta dos padrões é possível verificar que nos dissolvidos em tampão bicarbonato B1 existe maior intensidade de sinal e menor interferência, resultando numa linha de base quase sem ruído em todo o espetro. No tampão fosfato verificou-se que com A1 a interferência é maior que com A2 mas a existência no espetro de picos interferentes com intensidades elevadas dificulta a análise da massa pretendida. Na análise das áreas dos picos cromatográficos, quer dos padrões e padrões internos quer das amostras, verifica-se que os resultados com melhor resolução e intensidade obtêm-se com tampão bicarbonato B2 e B4. Calculando as taxas de recuperação com o padrão interno obtêm-se maiores recuperações nos mesmos tampões. A alteração do tampão preconizado na literatura pelo tampão que melhor se adequa ao detetor de massas revelou-se uma alternativa válida a ter em consideração. Os resultados obtidos validam a utilização deste tampão que para além de diminuir a interferência na deteção aumenta a vida útil do detetor.

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Abstract "Otimização do tampão de extração da amostra para a determinação de folatos por UPLC-MS/MS”. In: Book of Abstracts" do "12th Meeting on Food Chemistry – Bridging traditional and novel foods: composition, structure and functionality, (ref.:S9-PP12).