DPSPDNT - Dissertações de mestrado
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- APOB Variants Spectrum and Functional Characterization in Portuguese Patients with Familial Hypercholesterolaemia PhenotypePublication . Ferreira, Maria Rafael Simões do Carmo; Alves, Ana Catarina; Rebelo, Maria TeresaFamilial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal semi dominant disorder of lipid metabolism clinically characterized by increased levels of circulating LDL cholesterol and associated with elevated cardiovascular risk. The genetic diagnosis is usually based on the analysis of LDLR, APOB, and PCSK9 genes. APOB variants are responsible for 5-10% of FH cases, and the variant spectrum of APOB has increased due to sequencing of the whole gene through Next Generation Sequencing, consequently increasing the number of variants that need to be functionally assessed. This dissertation aimed to verify the correlation between phenotype and genotype in individuals from the Portuguese FH Study, as well as create a database including all APOB variants found up to date in this study. Moreover, it was intended to characterize two APOB variants identified in subjects from this cohort. Graphics regarding LDL cholesterol levels were designed for index cases FH positive and negative and relatives FH positive. The variants previously detected by NGS were confirmed by PCR and Sanger sequencing, and cascade screening was carried out in families. All APOB variants with MAF <1% were gathered into a database. LDL from index cases and relatives was separated using sequential ultracentrifugation and labelled with FITC for uptake assessment by flow cytometry in CHO-ldlA7 cells, and proliferation assays were performed with U937 cells. A definite diagnosis was possible for 4 individuals carrying known pathogenic variants, and c.6639_6641del/p.(Asp2213del) and c.10121T>C/p.(Ile3374Thr) alterations from exon 26 were functionally assessed. In vitro studies showed a neutral effect on the apoB function for these variants. Furthermore, 143 different variants were discovered located throughout the whole gene, of which more than 90% were variants of uncertain significance. Functional studies, combined with the association between phenotype and genotype, allow a better and more personalized treatment according to the needs of each individual.
- Estudos Funcionais de Variantes no Gene APOB em Doentes com Diagnóstico Clínico de Hipercolesterolemia FamiliarPublication . Ramos, Diana Catarina Fernandes; Bourbon, Mafalda; Alves, Ana CatarinaA hipercolesterolemia familiar (FH) é uma doença caracterizada por níveis elevados de colesterol LDL, que se acumulam nas artérias, promovendo o desenvolvimento precoce de eventos cardiovasculares. Geneticamente, a FH é transmitida de forma autossómica semi-dominante, sendo causada por variantes nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As variantes no gene APOB afetam a ligação do colesterol LDL ao seu recetor, representando 5 a 10% dos casos de FH. No entanto, para a maioria das variantes identificadas, o efeito funcional na proteína ainda não está determinado. Esta dissertação teve como objetivo principal investigar a correlação entre fenótipo e genótipo, além de caracterizar funcionalmente variantes identificadas no gene APOB em indivíduos com diagnóstico clínico de FH na população portuguesa. Como objetivo secundário, foi desenvolvida uma base de dados que reúne todas as variantes deste gene com estudos funcionais realizados até ao momento. A identificação das variantes foi realizada por sequenciação de nova geração (NGS) e confirmada por PCR e sequenciação de Sanger, seguida da pesquisa da variante nos familiares dos casos index. As variantes em estudo foram identificadas no âmbito do projeto EPHF. O LDL dos participantes foi isolado por ultracentrifugação a partir do soro de casos index e familiares com variantes no gene APOB, bem como de indivíduos normolipidémicos. Este LDL foi marcado com fluorescência e incubado em células CHO-ldlΔ7 para avaliar a capacidade de ligação e internalização do LDL. A caracterização funcional, realizada por citometria de fluxo com LDL fluorescente, revelou que as variantes p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu) e p.(Arg4519Thr) apresentavam ligação e internalização normais do LDL, indicando que estas variantes não comprometem a função da proteína. Este trabalho destaca a importância de caracterizar funcionalmente as variantes no gene APOB para melhorar o diagnóstico dos indivíduos com FH, possibilitando tratamentos mais adequados a cada caso e contribuindo para a redução do risco cardiovascular.