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- 3-Oxo-β-Sultams and 4-Oxo-β-Lactams as Chemical Tools for Activity-based Protein Profiling of Serine HydrolasesPublication . Carvalho, Luis Miguel Afonso; Moreira, Rui; Lucas, Susana; Penque, DeborahActivity-based protein profiling (ABPP) is a technique that analyzes the dynamics in enzymatic activity in complex proteomes by using small molecular probes, deemed activity-based probes (ABPs), containing a reactive group to covalently bind enzyme catalytic residues, a tag for detection of labeled targets and a linker as a spacer and also specificity-enhancing. Different warheads have been developed to engage a wide range of enzymatic families but there is a constant need to create new chemical tools to expand the pool of engageable targets. In this work we evaluated two 4-membered ring warheads as new warheads for ABPP of serine hydrolases. The 3-Oxo-β-Sultam warhead was revealed to be a highly reactive chemotype which labels a wide range of proteins with limited target occupancy. A crystallographic analysis of the reaction of 3-Oxo-β-Sultams with elastase enzymes revealed a previously unknown mechanism of inhibition of these enzymes by sulfonylation, suggesting 3-Oxo-β-Sultam compounds could be used to expand the pool of available sulfonylating tools in chemical biology. 4-Oxo-β-Lactams were shown to potently hit a selected group of serine hydrolase with high target occupancy, including human neutrophil elastase (HNE) and members of the ABHD and DPP families of enzymes. A competitive-ABPP approach revealed high potency of a library of 4-Oxo-β-Lactams to target these enzymes. 4-Oxo-β-Lactams were identified used as a new chemotype for DPP8 and DPP9 inhibition. Crystallography experiments revealed a new binding mode of these enzymes with 4-Oxo-β-Lactams, highlighting that these compounds could be used to pursue selective DPP8 or DPP9 inhibitors, a highly pursued field in current medicinal chemistry.
- Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural watersPublication . Churro, Catarina; Vasconcelos, Vitor Manuel de OliveiraThe most common cyanotoxins in Portuguese freshwaters are microcystins and their occurrence has been mainly attributed to cyanobacteria from the Microcystis genus. However, most recently, it has been described the production of these toxins by species of the Planktothrix, suggesting that this genus is also a major producer of microcystin in Portuguese surface waters. Nevertheless, and conversely to the Microcystis species, the knowledge on the occurrence, distribution and toxigenesis of Planktothrix is still limited. Planktothrix species exhibits some particularities that difficult their sampling, identification, quantification and toxigenic characterization in natural samples - Chapter 2. Particularly, the morphology of Planktothrix colonies does not allow distinguishing easily the individual cells. This makes their identification and quantification by optical microscopy a very difficult task, although this is the method generally used in cyanobacteria monitoring. Moreover, the most common methods for the detection of microcystins (ELISA, HPLC) do not identify the producer strains. These strains can be identified by conventional PCR, but this method doesnt enable to quantify them. In resume, there is not yet available a method that allow simultaneously identify and quantify microcystin-producing strains. This work aimed to develop a method based on Real-Time PCR applied to the monitoring of toxic species of Planktothrix in surface freshwater reservoirs used as drinking water supply and for recreational activities. The experimental work was developed according to several phases that are listed and explained below. In a first approach, field surveys were conducted to access the occurrence and distribution of Planktothrix – Chapter 3. It was observed that Planktothrix has a wide distribution in Portuguese lakes and that Planktothrix agardhii is the most commonly found specie. Furthermore microcystin production was detected in isolates from this species. In a second stage, it was developed a method based on real-time PCR to detect and quantify Planktothrix agardhii - Chapter 4. The real-time PCR is a promising technique for cyanobacteria research and monitoring. The main advantage of real-time PCR over conventional PCR is the ability to quantify the target gene copy numbers on a sample. Thus, in addition to identifying Planktothrix strains, the real-time PCR also enables to quantify those strains, which constitutes an advantage over the procedures used in the routine monitoring of cyanobacteria. It should be noted that the determination of the cell FCUP Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters vii density is critical in the risk assessment of toxic cyanobacteria, as the guideline values for cyanotoxins are based on cyanobacterial concentrations as well as on toxin cell quota. Another important aspect in cyanobacteria monitoring is the use of preserved samples. Preservation is used to maintain the morphologic features of cyanobacterial cells to further be used in their identification/quantification and also to avoid sample degradation during transport. In this work, the applicability of the real-time technique in the amplification of DNA from preserved samples was evaluated, by using the method previously developed for cell quantification – Chapter 5. The results indicate that real-time PCR is a robust technique applicable to those types of samples but that the most common preservation methods (Lugol’s solution, formaldehyde, glutaraldehyde) reduce the DNA quantity and quality. Since DNA degrades fast in those samples, the applicability of real-time PCR on preserved samples was tested using other preservation procedure – Chapter 6. The preservation in methanol 100% at -20ºC allowed maintaining the integrity of the samples both for morphologic and molecular analysis up to two years after preservation. The last chapter of this thesis reports the result of two years of monitoring of a reservoir having a persistent bloom of toxic P. agardhii (Appendix A) - Chapter 7. In this reservoir, high cell densities did not always correspond to high amounts of toxin and vice versa. Using the real-time PCR it was demonstrated that both toxic and non-toxic strains are present within the reservoirs and that they can flourish at different times. It was also detected a specie from another genus that also contributes to the production of microcystins. During the monitoring it was observed a chytrid parasite that infected the filaments of Planktothrix (Appendix A). The density of this parasite was also quantified by real-time PCR and the results showed that its development coincides with the increase of toxic Planktotrhix strains and of microcystin levels in the reservoir.
- Analysis of translation of 5’ untranslated regions in cancerPublication . Silva, Joana; Romão, Luísa; Luchessi, AugustoShort upstream open reading frames (uORFs) are cis-acting elements located within the 5'- leader sequence of transcripts. Recent genome-wide ribosome profiling (RiboSeq) studies have demonstrated the widespread presence of uORFs in the transcriptome and have shown that many uORFs can initiate with non-AUG codons. uORFs can impact gene expression of the downstream main open reading frame (mORF) by triggering messenger RNA (mRNA) decay or by regulating translation. Thus, disruption, elimination or creation of uORFs can elicit the development of several genetic diseases, such as cancer. The ATP-binding cassette subfamily E member 1 (ABCE1) gene, belongs to the ABC gene family of transporters. However, it does not behave as a drug transporter like the other members of this family. ABCE1 actively participates in the different stages of the translation process and is involved in cell proliferation and anti-apoptotic signaling processes, associating ABCE1 to a potential oncogenic function. RiboSeq occupancy profiles of the ABCE1 mRNA 5’-leader sequence indicate an active translation associated with the presence of uORFs, which is suggestive of a high translational regulation. Our aim was to study the translational regulation mediated by the five AUG and five non- AUG uORFs present in the human ABCE1 5’-leader sequence in colorectal cancer. With this purpose, we constructed a set of Firefly luciferase (FLuc) reporter vectors derived from the wild-type one containing the native configuration of the human ABCE1 5’-leader sequence upstream of the FLuc ORF, and transiently transfected colorectal cancer HCT116 cells. Here we show that ABCE1 mORF expression is regulated by its uORFs. Our results are consistent with a model wherein uORF1 recruits ribosomes onto the mRNA, behaving like a ribosomal barrier. The ribosomes that efficiently bypass uORF1 and/or uORF2, must probably reinitiate at uORF3 and/or uORF5, while uORF4 is greatly bypassed. uORF3 and uORF5 function as repressive uORFs that may cooperate to reach a maximum repression of the mORF. Thus, both bypass and reinitiation events of the AUG uORFs within ABCE1 5’-leader sequence contribute for the translational control of the mORF. In constrast, the non-AUG uORFs seem to be devoided of a significant inhibitory activity. The AUG uORF-mediated translational control is maintained in normal and in endoplasmic reticulum (ER) stress conditions, which keeps the expression level of ABCE1 at a minimum, showing that ABCE1 is a resistant transcript whose functions are equally essential in normal and in coditions of global translation impairment. In addition, we show that ABCE1 uORF-mediated translational regulation is preserved in non-tumorigenic and cancerous cells, which is consistent with a lack of an oncogenic function by the uORFs, as well as ABCE1 himself, in the colorectal cancer cell line tested. This study contributes with an additional example of how uORF-mediated translational regulation can occur. In addition, it reveals how important is to screen the 5’-leader sequence of the transcripts in search for potential disease-related variants. This information might be relevant for the implementation of new diagnostic and/or therapeutic tools for diseases associated with the deregulation of uORF-mediated translational control.
- Antimicrobial Resistance and Zoonotic Bacteria: Assessing interventions, risk factors and the occurrence of antimicrobial resistance in the food chain production in PortugalPublication . Costa, Miguel Mendes da; Leite, Andreia; d'Anjo, Maria CaraBackground: Resistant microorganisms that spread in the food system are a major threat to animal health and public health since they are a potential pathway of transmission to humans. This thesis evaluates: (i) antimicrobial resistance (AMR) prevalence and associated risk factors in the Portuguese food system (ii) effectiveness of interventions designed to reduce and adequate antimicrobial usage in animal production and tackle AMR. Methods: Portuguese AMR surveillance program on animals and food products data, 2014-2019, were used to estimate prevalence of AMR in Escherichia coli, Campylobacter and Salmonella samples, factors associated with Salmonella resistance, and AMR profiles. Logistic regression and clustering methods were applied. Effectiveness was assessed in a systematic review with meta-analysis. Articles were identified on PubMedTM, ScopusTM, The Cochrane LibraryTM, Web of ScienceTM, and grey literature on DANS EASYTM, WorldCatTM, RCAAPTM. Effectiveness was estimated by intervention, bacterial species, production type and population through fixed and random-effects models. Results: High prevalence of Salmonella resistance was observed, especially during summer and in post farm-stages to most antimicrobials and in summer and farms to fluoroquinolones and quinolones-F(Q). Salmonella F(Q) resistance was associated with broilers. Clusters suggested an escalating multi-drug resistance (MDR) behavior from farm to post-farm stages. Our review indicates that organic and antimicrobial-free farms, and group treatment restrictions lead to AMR reduction. Conclusions: Further attention is needed in the Portuguese food system regarding AMR behavior in particular in post-farm stages due to the potential source of MDR bacteria. Our findings support policy- and decision-making on effective interventions to reduce AMR. Keywords: food-producing animals; antimicrobial resistance; zoonotic bacteria; surveillance; food security; One Health.
- Aspergillus no contexto “One Health”: Epidemiologia molecular, resistência a azóis e novos compostos com atividade antifúngica frente a isolados clínicos de humanos e de aves aquáticasPublication . Melo, Aryse Martins; Xavier, Melissa Orzechowski; Sabino, RaquelO contexto "One health" considera a saúde em três pilares: saúde animal, saúde humana e saúde do ecossistema. Nesta abordagem, evidencia-se o papel das mudanças ambientais na emergência de doenças crônicas e infecciosas, e, como forte aliada no desenvolvimento de estratégias de prevenção de doenças. Fungos do gênero Aspergillus se enquadram substancialmente nesta abordagem, tendo em vista sua ubiquidade, bem como sua importância como potenciais patógenos animais e humanos. Além da resistência intrínseca apresentada por algumas espécies, a emergência da resistência a azóis adquirida por isolados de Aspergillus fumigatus sensu stricto é uma preocupação da comunidade científica a nível global. Este trabalho teve como objetivo a avaliação da epidemiologia molecular de isolados clínicos de Aspergillus de aves e humanos do sul do Rio Grande do Sul, Brasil, e avaliar perfil de suscetibilidade e mecanismos de resistência aos azóis. Como resultados, realizamos uma ampla revisão de literatura no contexto One Health, com enfoque no papel da aves como indicador ambiental e na dispersão de cepas de Aspergillus; descrevemos pela primeira vez a aspergilose em albatrozes durante a reabilitação; e descrevemos casos de aspergilose em aves aquáticas de vida livre. Também obtivemos importantes resultados in vitro sobre a atividade antifúngica do composto disseleneto de difenila sozinho e em combinação com antifúngicos clássicos. Em relação a pesquisa de resistências aos azóis em A. fumigatus, não foram detectadas mutações relacionadas ao contexto ambiental da emergência da resistência nessa espécie fúngica na região estudada no Brasil. Além disso, a pesquisa de diversidade genética demonstrou elevada diversidade nos isolados estudados, pelo que se conclui que a técnica utilizada é de grande valia para o acompanhamento clínico dos pacientes, além de permitir confirmar que o ambiente de recuperação de animais é uma potencial fonte de infecção para aves (no caso estudado, pinguins) durante reabilitação. A detecção de um mesmo genótipo em estirpe de A. fumigatus isolado em um paciente humano e um pinguim de vida livre demonstraram a importância de uma abordagem One Health do Aspergillus e da aspergilose, uma vez que uma mesma estirpe possui potencial de colonização/infecção tanto em animais como em humanos. Por fim, como resultado da parceria internacional estabelecida durante o desenvolvimento desse trabalho, tivemos o primeiro reporte da mutação de resistência TR34/L98H em ambiente indoor em Portugal, e o resultado da vigilância em Aspergillus realizada por um laboratório de referência em Portugal, no qual encontrou-se grande prevalência de espécies crípticas de Aspergillus em isolados clínicos e ambientais, além de resistência panazol em estirpes de A. fumigatus, confirmando-se os mecanismos moleculares envolvidos com a resistência antifúngica no gene cyp51A. Os resultados obtidos neste trabalho mostram a importância da abordagem multidisciplinar do Aspergillus e da aspergilose, e a necessidade de ampliar a vigilância de Aspergillus no contexto One Health, com objetivo de entender melhor os mecanismos envolvidos na dispersão de estirpes, e na adoção de medidas mais efetivas de monitoramento da emergência da resistência, bem como para adoção de estratégias de controle do crescimento desse problema global.
- Assessing antibiotic resistance in Gram negative bacteria from animals and the wider environmentPublication . Jones-Dias, Daniela; Caniça, Manuela; Nogueira, IsabelThe alarming increase in the levels of antibiotic resistant bacteria in clinical practice launched the call for a broader understanding of this event. This Ph.D. thesis aimed to unravel the main mobile antibiotic resistance determinants circulating in Gram negative bacteria from non-human sources, showing the contribution of mobile genetic elements for the overall process. The susceptibility and molecular epidemiological studies performed on different collections of bacterial isolates showed the predominance of multidrug resistant Escherichia coli in animals of different origins, soil and vegetables. E. coli and other species of Gram negative bacteria were related with carriage of diverse antibiotic resistance genes [e.g. blaCTX-M-1, blaCTX-M-15, blaCMY-2, blaGES-11, qnrS1, aac(6’)-Ib-cr, strAB, tet, drfA, aadA, mcr-1] that were associated with a transferable genetic support. Indeed, an assortment of mobile genetic elements (e.g. IncI1 and IncF plasmids, ISEcp1 insertion sequences, Tn402 and Tn7 transposons and class 1, 2 and 3 integrons) was detected in the genetic proximity of those antibiotic resistance genes, suggesting their profound involvement, not only in interspecies dispersion, but also in the movement of the genes within the cell. Specific genomic investigation of two Enterobactericeae isolates and the proteomic study of a third, underscored the potential of massive omic approaches to study antibiotic resistance as a global process. One of the key findings released from these studies is that antibiotic resistance is not only linked to virulence and pathogenicity, but can also be connected to core bacterial metabolic processes. The results obtained throughout this thesis extend our knowledge on the distribution of mobile antibiotic resistance genes in animals, environment and, ultimately, in the food chain. If the gathered results increased our concerns towards the current distribution of antibiotic resistant bacteria, they can also be an encouragement to address this problem at a global scale.
- Assessing the in vitro toxicity of engineered and airborne nanoceramics: contribution to the safe production and use of nanomaterials in the ceramic industryPublication . Bessa, Maria João; Fraga, Sónia; Teixeira, João Paulo; Laffon, Blanca LageAdvanced ceramic technologies have a strong potential for airborne (nano)particle formation and emission, meaning that workers of those industries are at great risk of exposure to these particles. However, toxicological data of these (nano)particles is lacking, particularly for airborne particles released within sectors such as the ceramic industry. To address this relevant topic, the present work aimed to assess the toxicity of occupationally relevant doses of industrially process-generated particles emitted during two industrial thermal spraying technologies [atmospheric plasma spraying (APS) and high velocity oxy-fuel (HVOF)], as well as of four engineered nanoparticles [ENP; tin oxide (SnO2), antimony-tin oxide (ATO; Sb2O3●SnO2), cerium oxide (CeO2) and zirconium oxide (ZrO2)] used as raw materials for ceramics manufacture. Two human respiratory in vitro systems, either conventional alveolar epithelial A549 cultures under submerged or air-liquid interface (ALI) conditions, or advanced three-dimensional (3D) upper airway epithelium (MucilAirTM) cultures at ALI were exposed to the selected particles. Major toxicity endpoints including plasma membrane integrity, metabolic activity, oxidative stress, inflammatory response, and genotoxicity were assessed. Overall, the tested process-generated particles seem to be more toxic compared to the ENP, most likely due to their higher chemical complexity and composition [elevated levels of metallic elements like chromium (Cr) and nickel (Ni)]. Among the two evaluated thermal spraying processes, particles derived from HVOF were more cytotoxic than those emitted from APS. Either fine (PGFP) and ultrafine (PGNP) particles from both spraying processes were able to induce measurable genotoxic effects. While APS particles lead to increased levels of histone 2AX (H2AX) phosphorylation, HVOF particles caused 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxo-G) oxidative DNA lesions. ENP were more toxic to human alveolar epithelial cultures when aerosolised than in liquid suspension, particularly ZrO2 NP. On the other hand, advanced MucilAirTM cultures, that better mimic in vivo physiological features, such as the mucociliary defence mechanisms, were quite resistant to both HVOF-derived particles and ENP aerosols. Thus, while 3D human upper airway epithelial cultures exhibited attenuated responses, the conventional A549 cultures were more sensitive to the studied (nano)particles.The present work highlights the hazard of industrially derived (nano)particles, either intentionally used or incidentally released into the workplace air during advanced ceramic processes. Importantly, particles’ physicochemical properties alongside the testing conditions (cell model and type of exposure) played a determinant role in the observed biological responses. These findings reinforce the importance of using physiologically relevant in vitro models in (nano)particle toxicity studies, for better data extrapolation to humans.
- Assessment methodologies for food safety: agglomerated cork stopperssPublication . André, Catarina; Bordado, João Carlos Moura; Castanheira, IsabelA cortiça é uma matéria-prima nobre, cuja principal aplicação é a rolha de cortiça. O trabalho desta tese fez parte do projeto LIRACork cujo objetivo foi a introdução de rolhas de cortiça aglomerada com ligantes inócuos nos mercados europeu e americano. Existem poucos estudos científicos com estes materiais, a sua utilização e a sua importância económica. No entanto, novos materiais que utilizam desperdícios de cortiça têm sido desenvolvidos com variadas aplicações. Pré-polímeros de isocianato, precursores de poliuretanos, são utilizados para ligar os grânulos de cortiça, originando os aglomerados de cortiça. Para determinar e quantificar isocianatos livres foi desenvolvido um método utilizando a técnica de UPLC-PDA-Flu com pré derivatização. A cura incompleta de isocianatos monoméricos presentes nos ligantes pode originar aminas aromáticas primárias que foram determinadas por UPLC-MS / MS. A avaliação de contaminantes inorgânicos em rolhas de cortiça e rolhas de cortiça aglomerada, é também uma questão importante sobre a segurança alimentar. No entanto, há poucos regulação e estudos sobre esta questão. Assim, todos os passos do processo foram estudados. Antes deste projeto não existia nenhuma entidade em Portugal, capaz de realizar análises que garantissem a segurança alimentar de cortiça aglomerada. Após esse projeto, e com o trabalho desta tese, o INSA é agora capaz de efetuar as referidas análises. Assim, não é necessário aos fabricantes de rolhas técnicas enviarem os seus produtos para analisar no exterior.
- Avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas (cianotoxinas)Publication . Dias, Elsa; Batoréu, Maria Camila Canteiro; Jordan, Peter; Silva, Maria JoãoAs microcistinas são metabolitos secundários produzidos por cianobactérias de água doce e constituem um risco para a saúde pública uma vez que a ingestão de água contaminada com microcistinas tem sido associada a episódios de hepatotoxicidade humana aguda e crónica. As cianobactérias são constituintes naturais do fitoplâncton de água doce e proliferam massivamente em condições ambientais favoráveis. Porém, a pressão antropogénica sobre os recursos hídricos tem contribuído para o aumento deste fenómeno a nível global, designadamente através da contaminação das massas de água com resíduos urbanos, industriais e agrícolas, cujo conteúdo enriquecido em azoto e fosfatos constitui um estímulo para o crescimento cianobacteriano. A proliferação intensa de cianobactérias (florescência) tem como consequência a acumulação de densidades elevadas de biomassa que, após a fase de senescência, liberta para a água níveis potencialmente nocivos de cianotoxinas. Uma proporção elevada das florescências é composta por cianobacterianas tóxicas e as cianotoxinas mais frequentes são as microcistinas. As microcistinas são um conjunto de aproximadamente 60 variantes estruturais partilhando a estrutura heptapeptídica cíclica comum ciclo(-D-alanina1-L-x2-D-eriro- - iso-aspartato3-L-z4-Adda5-D-glutamato6-N-metil-desidroalanina7) em que x e z são aminoácidos-L variáveis e Adda é o ácido (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8- trimetil-10-decafenil-4,6-dienóico. A MCLR (com leucina e arginina nas posições variáveis) é a variante mais tóxica e mais comum. O órgão-alvo principal das microcistinas é o fígado uma vez que os hepatócitos expressam ao nível da membrana citoplasmática polipéptidos transportadores dos aniões orgânicos, através dos quais as microcistinas entram na célula. Assim, a maioria dos estudos toxicológicos com microcistinas tem sido conduzida no fígado in vivo e em células hepáticas in vitro. Com base em estudos de toxicidade aguda em animais, foi estabelecido em 1998 pela Organização Mundial de Saúde o valor-guia de 1 nM para a MCLR em água de consumo. Porém, este valor constitui uma medida preventiva parcial, uma vez que não contempla efeitos noutros órgãos nem efeitos crónicos, nomeadamente efeitos cancerigénicos. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a MCLR apresenta toxicidade noutros órgãos tais como os intestinos, os rins, o cérebro, pulmões e sistema reprodutor. Por outro lado, e embora a informação disponível sobre a toxicidade crónica ii não permita ainda a revisão daquele valor, a MCLR está actualmente classificada pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como um composto potencialmente cancerigénico (classe 2B). Alguns estudos epidemiológicos associaram o aumento da incidência de hepatocarcinoma e cancro do cólon em populações humanas ao consumo de água contaminada regularmente com microcistinas. Por outro lado, estudos de carcinogenicidade em ratinhos revelaram que a MCLR é um promotor tumoral no fígado, pele e cólon. Recentemente tem sido descrita a actividade genotóxica da MCLR em diferentes tipos celulares. Contudo este é ainda um assunto alvo de alguma controvérsia na comunidade científica e não é ainda claro que a MCLR tenha, per si, capacidade de iniciação tumoral. Portanto, o conhecimento dos mecanismos subjacentes a uma eventual acção cancerigénica das microcistinas apresenta imensas lacunas. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi a avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas. Numa fase inicial seleccionou-se um modelo experimental in vitro (trabalho apresentado no capítulo 2). Para tal avaliou-se o efeito de extractos semi-purificados de duas estirpes de Microcystis aeruginosa, uma produtora de MCLR e outra não produtora de cianotoxinas, no crescimento e viabilidade de linhas celulares de hepatócitos humanos (HepG2) e de ratinho (AML12) e numa linha celular de rim de macaco (Vero-E6), através de testes de citotoxicidade (MTT e LDH). A escolha dos hepatócitos é óbvia, uma vez que o fígado é o órgão-alvo das microcistinas. Usaram-se hepatócitos humanos e de ratinho porque a sensibilidade à MCLR pode depender da espécie. Usou-se também uma linha celular de rim, com o intuito, à data do planeamento do trabalho, de incluir nos ensaios um modelo celular não hepático como controlo negativo. As estirpes de M. aeruginosa foram isoladas de florescências naturais colhidas na albufeira de Montargil e são actualmente mantidas na colecção de algas “Estela Sousa e Silva” do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA). A caracterização da produção de cianotoxinas pelas estirpes usadas neste trabalho foi elaborada previamente no âmbito de outros trabalhos de investigação decorridos no Departamento de Saúde Ambiental do INSA. A utilização da estirpe de M. aeruginosa não tóxica teve como finalidade assegurar que os efeitos observados se deviam à MCLR e não a qualquer efeito da matriz do extracto cianobacteriano. Contrariamente ao esperado, a linha celular de rim Vero-E6 apresentou uma sensibilidade similar ou até ligeiramente superior à dos hepatócitos (HepG2 e AML12). Por outro lado, o extracto da estirpe produtora de MCLR induziu um efeito genotóxico (aumento da frequência de iii micronucleos) nas células Vero-E6. Perante estes resultados inesperados e considerando o desconhecimento ainda existente acerca da toxicidade das microcistinas em células não hepáticas, seleccionou-se este modelo celular para a avaliação dos potenciais efeitos genotóxicos da MCLR. Para tal, a citotoxicidade da MCLR nas células Vero-E6 foi confirmada através da comparação dos efeitos de extractos de M. aeruginosa e MCLR pura (capítulo 3) e o limiar de citotoxicidade (25 μM) foi determinado, usando os testes MTT, LDH e Neutral Red. Os resultados deste trabalho demonstraram que a citotoxicidade da MCLR apresenta uma forte dependência do binómio dose/tempo de exposição e indiciaram que poderá manifestar-se primeiramente ao nível lisossomal e, sequencialmente, ao nível da mitocôndria e da membrana citoplasmática. Essa hipótese foi comprovada pelas metodologias de microscopia electrónica de transmissão e de imunofluorescência (capítulo 4). Estas metodologias permitiram identificar os alvos intracelulares da MCLR (retículo endoplasmático, lisosomas, citosqueleto, mitocôndria e membrana citoplasmática) e concluir que, de acordo com a dose e tempo de exposição, a MCLR desencadeia uma resposta autofágica nas células Vero, seguida da morte celular por apotose e necrose à medida que a dose e o tempo de exposição aumentam. Muitos destes resultados haviam sido já descritos para hepatócitos, mas apenas muito pontualmente para outros tipos celulares. Caracterizados os efeitos citotóxicos da MCLR, foram avaliados os efeitos genotóxicos nas células Vero e nas células HepG2 (capítulo 5) através do teste do Cometa e do ensaio dos micronúcleos (MN). O primeiro permite detectar quebras na cadeia de ADN, enquanto que o segundo avalia efeitos ao nível cromossómico, designadamente efeitos resultantes da quebra de cromossomas (clastogénese) ou da perda de cromossomas (aneugénese). Os resultados obtidos comprovaram que a MCLR (em doses subcitotóxicas, 5-20 μM) induz o aumento da frequência de micronúcleos em ambas as linhas celulares, mas não induz danos na molécula de ADN. A semelhança dos resultados obtidos com as células Vero e HepG2 sugerem que a MCLR actua através de um mecanismo genotóxico comum nas células hepáticas e renais, muito possivelmente através de um mecanismo aneugénico. A distinção entre actividade clastogénica e aneugénica poderá ser importante para a avaliação do risco, uma vez que para os agentes aneugénicos pode ser possível estabelecer um limiar de exposição abaixo do qual não decorrem riscos de efeitos genotóxicos, o que não é aplicável aos agentes clastogénicos. A identificação do tipo de micronúcleos pela técnica de FISH iv recorrendo a uma sonda pancentromérica permitirá esclarecer qual o mecanismo associado a este efeito genotóxico da MCLR. Com o intuito de avaliar o efeito da MCLR na proliferação da linha celular Vero-E6, utilizou-se o teste de incorporação de BrdU, que avalia a transição G1/S do ciclo celular (capítulo 6). Os resultados permitem concluir que a exposição a doses muito baixas (1-10 nM) de MCLR estimula a proliferação das células Vero-E6. Note-se que a dose de 1nM correspondente ao valor-guia da MCLR em água de consumo definido pela OMS e está contemplado na legislação portuguesa (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto) como valor paramétrico de referência. A análise por Western-blot da expressão de cinases proteicas activadas por mitogénicos (ERK1/2, JNK, p38) revelou que a MCLR estimula a proliferação da linha celular Vero-E6 através da activação da via de sinalização ERK1/2. Integrando os resultados apresentados nesta dissertação, poder-se-à concluir que a MCLR desencadeia uma multiplicidade de efeitos nas células Vero, sugerindo que estas poderão constituir um modelo celular adequado para o estudo dos efeitos nefrotóxicos das microcistinas. Embora o fígado seja o principal órgão de acumulação e eliminação da MCLR, cerca de 10% é excretada pela urina, pelo que os rins poderão também estar expostos a esta toxina. É de particular importância a avaliação dos efeitos decorrentes da exposição continuada a baixas doses, atendendo ao potencial cancerigénico da MCLR. Os resultados aqui apresentados acerca do efeito genotóxico e da capacidade da MCLR estimular a proliferação nas células Vero contribuem para o conhecimento dos efeitos e mecanismos subjacentes à eventual acção cancerigénica das microcistinas, sobretudo porque os estudos nesta área têm sido conduzidos maioritariamente em modelos hepáticos. Os resultados salientam, também, a necessidade de rever o valor-guia estabelecido para as microcistinas.
- Avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas (cianotoxinas)Publication . Dias, Elsa; Batoréu, Maria Camila Canteiro; Jordan, Peter; Silva, Maria JoãoAs microcistinas são metabolitos secundários produzidos por cianobactérias de água doce e constituem um risco para a saúde pública uma vez que a ingestão de água contaminada com microcistinas tem sido associada a episódios de hepatotoxicidade humana aguda e crónica. As cianobactérias são constituintes naturais do fitoplâncton de água doce e proliferam massivamente em condições ambientais favoráveis. Porém, a pressão antropogénica sobre os recursos hídricos tem contribuído para o aumento deste fenómeno a nível global, designadamente através da contaminação das massas de água com resíduos urbanos, industriais e agrícolas, cujo conteúdo enriquecido em azoto e fosfatos constitui um estímulo para o crescimento cianobacteriano. A proliferação intensa de cianobactérias (florescência) tem como consequência a acumulação de densidades elevadas de biomassa que, após a fase de senescência, liberta para a água níveis potencialmente nocivos de cianotoxinas. Uma proporção elevada das florescências é composta por cianobacterianas tóxicas e as cianotoxinas mais frequentes são as microcistinas. As microcistinas são um conjunto de aproximadamente 60 variantes estruturais partilhando a estrutura heptapeptídica cíclica comum ciclo(-D-alanina1-L-x2-D-eriro- -iso-aspartato3-L-z4-Adda5-D-glutamato6-N-metil-desidroalanina7) em que x e z são aminoácidos-L variáveis e Adda é o ácido (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-decafenil-4,6-dienóico. A MCLR (com leucina e arginina nas posições variáveis) é a variante mais tóxica e mais comum. O órgão-alvo principal das microcistinas é o fígado uma vez que os hepatócitos expressam ao nível da membrana citoplasmática polipéptidos transportadores dos aniões orgânicos, através dos quais as microcistinas entram na célula. Assim, a maioria dos estudos toxicológicos com microcistinas tem sido conduzida no fígado in vivo e em células hepáticas in vitro. Com base em estudos de toxicidade aguda em animais, foi estabelecido em 1998 pela Organização Mundial de Saúde o valor-guia de 1 nM para a MCLR em água de consumo. Porém, este valor constitui uma medida preventiva parcial, uma vez que não contempla efeitos noutros órgãos nem efeitos crónicos, nomeadamente efeitos cancerigénicos. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a MCLR apresenta toxicidade noutros órgãos tais como os intestinos, os rins, o cérebro, pulmões e sistema reprodutor. Por outro lado, e embora a informação disponível sobre a toxicidade crónica não permita ainda a revisão daquele valor, a MCLR está actualmente classificada pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como um composto potencialmente cancerigénico (classe 2B). Alguns estudos epidemiológicos associaram o aumento da incidência de hepatocarcinoma e cancro do cólon em populações humanas ao consumo de água contaminada regularmente com microcistinas. Por outro lado, estudos de carcinogenicidade em ratinhos revelaram que a MCLR é um promotor tumoral no fígado, pele e cólon. Recentemente tem sido descrita a actividade genotóxica da MCLR em diferentes tipos celulares. Contudo este é ainda um assunto alvo de alguma controvérsia na comunidade científica e não é ainda claro que a MCLR tenha, per si, capacidade de iniciação tumoral. Portanto, o conhecimento dos mecanismos subjacentes a uma eventual acção cancerigénica das microcistinas apresenta imensas lacunas. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi a avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas. Numa fase inicial seleccionou-se um modelo experimental in vitro (trabalho apresentado no capítulo 2). Para tal avaliou-se o efeito de extractos semi-purificados de duas estirpes de Microcystis aeruginosa, uma produtora de MCLR e outra não produtora de cianotoxinas, no crescimento e viabilidade de linhas celulares de hepatócitos humanos (HepG2) e de ratinho (AML12) e numa linha celular de rim de macaco (Vero-E6), através de testes de citotoxicidade (MTT e LDH). A escolha dos hepatócitos é óbvia, uma vez que o fígado é o órgão-alvo das microcistinas. Usaram-se hepatócitos humanos e de ratinho porque a sensibilidade à MCLR pode depender da espécie. Usou-se também uma linha celular de rim, com o intuito, à data do planeamento do trabalho, de incluir nos ensaios um modelo celular não hepático como controlo negativo. As estirpes de M. aeruginosa foram isoladas de florescências naturais colhidas na albufeira de Montargil e são actualmente mantidas na colecção de algas “Estela Sousa e Silva” do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA). A caracterização da produção de cianotoxinas pelas estirpes usadas neste trabalho foi elaborada previamente no âmbito de outros trabalhos de investigação decorridos no Departamento de Saúde Ambiental do INSA. A utilização da estirpe de M. aeruginosa não tóxica teve como finalidade assegurar que os efeitos observados se deviam à MCLR e não a qualquer efeito da matriz do extracto cianobacteriano. Contrariamente ao esperado, a linha celular de rim Vero-E6 apresentou uma sensibilidade similar ou até ligeiramente superior à dos hepatócitos (HepG2 e AML12). Por outro lado, o extracto da estirpe produtora de MCLR induziu um efeito genotóxico (aumento da frequência de micronucleos) nas células Vero-E6. Perante estes resultados inesperados e considerando o desconhecimento ainda existente acerca da toxicidade das microcistinas em células não hepáticas, seleccionou-se este modelo celular para a avaliação dos potenciais efeitos genotóxicos da MCLR. Para tal, a citotoxicidade da MCLR nas células Vero-E6 foi confirmada através da comparação dos efeitos de extractos de M. aeruginosa e MCLR pura (capítulo 3) e o limiar de citotoxicidade (25 μM) foi determinado, usando os testes MTT, LDH e Neutral Red. Os resultados deste trabalho demonstraram que a citotoxicidade da MCLR apresenta uma forte dependência do binómio dose/tempo de exposição e indiciaram que poderá manifestar-se primeiramente ao nível lisossomal e, sequencialmente, ao nível da mitocôndria e da membrana citoplasmática. Essa hipótese foi comprovada pelas metodologias de microscopia electrónica de transmissão e de imunofluorescência (capítulo 4). Estas metodologias permitiram identificar os alvos intracelulares da MCLR (retículo endoplasmático, lisosomas, citosqueleto, mitocôndria e membrana citoplasmática) e concluir que, de acordo com a dose e tempo de exposição, a MCLR desencadeia uma resposta autofágica nas células Vero, seguida da morte celular por apotose e necrose à medida que a dose e o tempo de exposição aumentam. Muitos destes resultados haviam sido já descritos para hepatócitos, mas apenas muito pontualmente para outros tipos celulares. Caracterizados os efeitos citotóxicos da MCLR, foram avaliados os efeitos genotóxicos nas células Vero e nas células HepG2 (capítulo 5) através do teste do Cometa e do ensaio dos micronúcleos (MN). O primeiro permite detectar quebras na cadeia de ADN, enquanto que o segundo avalia efeitos ao nível cromossómico, designadamente efeitos resultantes da quebra de cromossomas (clastogénese) ou da perda de cromossomas (aneugénese). Os resultados obtidos comprovaram que a MCLR (em doses subcitotóxicas, 5-20 μM) induz o aumento da frequência de micronúcleos em ambas as linhas celulares, mas não induz danos na molécula de ADN. A semelhança dos resultados obtidos com as células Vero e HepG2 sugerem que a MCLR actua através de um mecanismo genotóxico comum nas células hepáticas e renais, muito possivelmente através de um mecanismo aneugénico. A distinção entre actividade clastogénica e aneugénica poderá ser importante para a avaliação do risco, uma vez que para os agentes aneugénicos pode ser possível estabelecer um limiar de exposição abaixo do qual não decorrem riscos de efeitos genotóxicos, o que não é aplicável aos agentes clastogénicos. A identificação do tipo de micronúcleos pela técnica de FISH recorrendo a uma sonda pancentromérica permitirá esclarecer qual o mecanismo associado a este efeito genotóxico da MCLR. Com o intuito de avaliar o efeito da MCLR na proliferação da linha celular Vero-E6, utilizou-se o teste de incorporação de BrdU, que avalia a transição G1/S do ciclo celular (capítulo 6). Os resultados permitem concluir que a exposição a doses muito baixas (1-10 nM) de MCLR estimula a proliferação das células Vero-E6. Note-se que a dose de 1nM correspondente ao valor-guia da MCLR em água de consumo definido pela OMS e está contemplado na legislação portuguesa (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto) como valor paramétrico de referência. A análise por Western-blot da expressão de cinases proteicas activadas por mitogénicos (ERK1/2, JNK, p38) revelou que a MCLR estimula a proliferação da linha celular Vero-E6 através da activação da via de sinalização ERK1/2. Integrando os resultados apresentados nesta dissertação, poder-se-à concluir que a MCLR desencadeia uma multiplicidade de efeitos nas células Vero, sugerindo que estas poderão constituir um modelo celular adequado para o estudo dos efeitos nefrotóxicos das microcistinas. Embora o fígado seja o principal órgão de acumulação e eliminação da MCLR, cerca de 10% é excretada pela urina, pelo que os rins poderão também estar expostos a esta toxina. É de particular importância a avaliação dos efeitos decorrentes da exposição continuada a baixas doses, atendendo ao potencial cancerigénico da MCLR. Os resultados aqui apresentados acerca do efeito genotóxico e da capacidade da MCLR estimular a proliferação nas células Vero contribuem para o conhecimento dos efeitos e mecanismos subjacentes à eventual acção cancerigénica das microcistinas, sobretudo porque os estudos nesta área têm sido conduzidos maioritariamente em modelos hepáticos. Os resultados salientam, também, a necessidade de rever o valor-guia estabelecido para as microcistinas.