Browsing by Author "Rebelo, Maria Teresa"
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- APOB Variants Spectrum and Functional Characterization in Portuguese Patients with Familial Hypercholesterolaemia PhenotypePublication . Ferreira, Maria Rafael Simões do Carmo; Alves, Ana Catarina; Rebelo, Maria TeresaFamilial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal semi dominant disorder of lipid metabolism clinically characterized by increased levels of circulating LDL cholesterol and associated with elevated cardiovascular risk. The genetic diagnosis is usually based on the analysis of LDLR, APOB, and PCSK9 genes. APOB variants are responsible for 5-10% of FH cases, and the variant spectrum of APOB has increased due to sequencing of the whole gene through Next Generation Sequencing, consequently increasing the number of variants that need to be functionally assessed. This dissertation aimed to verify the correlation between phenotype and genotype in individuals from the Portuguese FH Study, as well as create a database including all APOB variants found up to date in this study. Moreover, it was intended to characterize two APOB variants identified in subjects from this cohort. Graphics regarding LDL cholesterol levels were designed for index cases FH positive and negative and relatives FH positive. The variants previously detected by NGS were confirmed by PCR and Sanger sequencing, and cascade screening was carried out in families. All APOB variants with MAF <1% were gathered into a database. LDL from index cases and relatives was separated using sequential ultracentrifugation and labelled with FITC for uptake assessment by flow cytometry in CHO-ldlA7 cells, and proliferation assays were performed with U937 cells. A definite diagnosis was possible for 4 individuals carrying known pathogenic variants, and c.6639_6641del/p.(Asp2213del) and c.10121T>C/p.(Ile3374Thr) alterations from exon 26 were functionally assessed. In vitro studies showed a neutral effect on the apoB function for these variants. Furthermore, 143 different variants were discovered located throughout the whole gene, of which more than 90% were variants of uncertain significance. Functional studies, combined with the association between phenotype and genotype, allow a better and more personalized treatment according to the needs of each individual.
- Epidemiologia e frequência de Aspergillus em doentes com suspeita de patologia respiratória fúngicaPublication . Oliveira, Mariana; Sabino, Raquel; Rebelo, Maria TeresaO género Aspergillus é composto por centenas de espécies de fungos ubíquos que são agentes patogénicos oportunistas do ser humano, particularmente dos indivíduos imunocomprometidos e/ou com danos estruturais nos pulmões resultado de patologias prévias como tuberculose pulmonar. Aspergilose é o nome dado ao espetro de patologias causadas por Aspergillus e que se estendem desde a reação hipersensível do hospedeiro aos fungos até à infeção invasiva cuja taxa de letalidade é elevada. O tratamento destas patologias depende essencialmente dos antifúngicos da classe dos azóis, contudo a emergência de resistência por A. fumigatus sensu stricto assim como a resistência intrínseca das espécies crípticas pode comprometer esta terapêutica. O diagnóstico de aspergilose está dependente da deteção laboratorial direta e/ou indireta de Aspergillus nas amostras biológicas dos pacientes através das técnicas culturais e imunoenzimáticas, mas a sensibilidade e a especificidade destas técnicas varia amplamente. Posto isto, este trabalho foi realizado com os seguintes objetivos: (i) a vigilância de Aspergillus em pacientes com sintomas de patologia respiratória fúngica, nomeadamente em grupos de risco de aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia) e (ii) a otimização da deteção molecular de Aspergillus e/ou de outros fungos potencialmente patogénicos através de PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e de técnicas de next generation sequencing, respetivamente. No âmbito do estudo da epidemiologia de aspergilose em doentes com suspeita de infeção fúngica do trato respiratório foram analisadas retrospetivamente as amostras respiratórias de 146 pacientes que se encontravam conservadas no Laboratório Nacional de Referência de Infeções Parasitárias e Fúngicas. Cinquenta e sete destes pacientes (39,0%) foram positivos para Aspergillus através das técnicas cultural, imunoenzimática e molecular. Cinquenta e oito colónias de Aspergillus foram isoladas e identificadas através de sequenciação dos genes para a calmodulina ou a β-tubulina e por PCR em tempo real. Detetaram-se 6 secções de Aspergillus distintas, sendo a mais frequente a Nigri (42,1%) seguida de Fumigati (33,3%) e de Flavi (8,6%). Quanto às espécies, as mais frequentemente identificadas foram A. niger sensu stricto (33,9%) seguida de A. fumigatus sensu stricto (32,1%). Identificaram-se também 9 espécies crípticas cuja frequência foi 21,4%. Paralelamente ao estudo epidemiológico indicado, analisou-se o perfil de suscetibilidade aos azóis de Aspergillus da secção Fumigati que haviam sido isolados de produtos respiratórios e conservados em coleção de culturas no âmbito do programa de Vigilância em Aspergillus. Os isolados identificados como Aspergillus fumigatus sensu stricto (n=45), A. lentulus (n=4), A. udagawae (n=2) e A. pseudofelis (n=1) foram inoculados em meios de screening com voriconazol, itraconazol e posaconazol e o seu crescimento foi caracterizado. Os resultados foram corroborados pelas técnicas de E-test e através de PCR multiplex em tempo real para deteção de mutações no gene Cyp51A. Nenhum isolado de A. fumigatus sensu stricto revelou resistência aos azóis, mas foi detetada menor suscetibilidade ao voriconazol num isolado da espécie A. udagawae e ao voriconazol (CMI = 1 μg/ml) e ao itraconazol (CMI = 2 μg/ml) em A. pseudofelis. Com o objetivo de comparar os resultados obtidos por técnicas convencionais com os das técnicas moleculares, o DNA extraído do sobrenadante de 44 amostras respiratórias que haviam sido previamente analisadas através de ELISA para deteção de galactomanano e/ou pela técnica cultural foi sujeito ao PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e compararam-se os resultados obtidos pelas várias técnicas. Verificou-se que o PCR multiplex em tempo real permitiu obter uma taxa de positividade superior à das técnicas convencionais de diagnóstico de aspergilose, particularmente nos pacientes em risco de desenvolver aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia). Procedeu-se também à otimização da amplificação e vii sequenciação por técnicas de next generation sequencing da região ITS e do gene calmodulina do DNA extraído de amostras respiratórias. Este estudo piloto de análise metagenómica permitiu detetar os fungos Pneumocystis e Cryptococcus mo micobioma dos pacientes VIH positivo que frequentemente desenvolvem pneumocistose e criptococose. Detetaram-se também outros fungos potencialmente patogénicos nomeadamente dos géneros Aspergillus, Trichosporon, Saccharomyces e Schizophyllum. Conclui-se assim que a distribuição de Aspergillus é complexa e diversa e que a resistência aos azóis não aparenta ser um problema nas estirpes analisadas, contudo a monitorização contínua é fundamental. Essa monitorização deve incluir não só as técnicas de determinação do perfil de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos como a identificação molecular das espécies, particularmente devido à elevada frequência com que as espécies crípticas foram detetadas neste trabalho assim como a resistência intrínseca aos antifúngicos que algumas delas apresentaram. Conclui-se também que as técnicas moleculares têm uma grande capacidade de detetar rápida e eficazmente fungos potencialmente patogénicos nas amostras biológicas humanas pelo que esforços para a sua otimização, padronização e validação clínica devem ser realizados no futuro.
- Strategies for Monitoring Microbial Life in Beach Sand for Protection of Public HealthPublication . Brandão, João; Valério, Elisabete; Weiskerger, Chelsea; Veríssimo, Cristina; Sarioglou, Konstantina; Novak Babič, Monika; Solo-Gabriele, Helena M.; Sabino, Raquel; Rebelo, Maria TeresaThe 2021 revised guidelines of the World Health Organization recommend monitoring the quality of sand in addition to water at recreational beaches. This review provides background information about the types of beaches, the characteristics of sand, and the microbiological parameters that should be measured. Analytical approaches are described for quantifying fungi and fecal indicator bacteria from beach sand. The review addresses strategies to assess beach sand quality, monitoring approaches, sand remediation, and the proposed way forward for beach sand monitoring programs. In the proposed way forward, recommendations are provided for acceptable levels of fungi given their distribution in the environment. Additional recommendations include evaluating FIB distributions at beaches globally to assess acceptable ranges of FIB levels, similar to those proposed for fungi.