Browsing by Author "Oliveira, Beatriz"
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- Análise molecular de genes implicados no desenvolvimento sexual do Homem por Sequenciação de Nova GeraçãoPublication . Oliveira, Beatriz; Gonçalves, João; Martins, Francisco PinaAs doenças/patologias do desenvolvimento sexual, por definição, correspondem a manifestações clínicas congénitas nas quais o sexo cromossómico, gonadal ou anatómico é atípico. Neste âmbito, existe um largo espectro de indivíduos com um diagnóstico clínico provável onde, utilizando a abordagem analítica clássica baseada em PCR e Sequenciação de Sanger, em muitos doentes não se encontra a causa genética. Nestas situações, os indivíduos afetados poderão permanecer numa situação indefinida por muitos anos, não sendo possível receberem a orientação clínica e o tratamento mais adequados, nem o melhor aconselhamento genético, tanto o próprio indivíduo como os seus progenitores/familiares. A incidência das doenças em causa é muito variável, podem compreender situações raras (ex. Disgenesia Gonadal Completa) com incidência inferior a 1/50 000 nascimentos, ou manifestações de criptorquidismo e de hipospádias cuja incidência ao nascimento varia entre ~1,5% a ~9% . Face ao conhecimento atual sobre o genoma humano, aos múltiplos genes que se conhecem associados às patologias do desenvolvimento sexual, e ao desenvolvimento da tecnologia de Sequenciação de Nova Geração (NGS), este estudo teve como objetivos: i) Encontrar o defeito molecular/genético que estará na base de diversas patologias do desenvolvimento sexual presentes em doentes 46,XX ou 46,XY; ii) Validar a análise por NGS de um painel alargado de genes associados a patologias do desenvolvimento sexual; iii) Proporcionar um diagnóstico molecular mais célere e com custo significativamente menor que a análise convencional baseada em PCR-sequenciação de Sanger, iv) Contribuir para um diagnóstico mais efetivo e de suporte a um melhor aconselhamento genético. Com base nas características das referidas doenças, desenhou-se um painel com pelo menos 40 genes, e analisou-se um conjunto de amostras de DNA de 59 doentes com diferentes DDS, para as quais, embora já tendo sido analisadas para alguns genes, não tinha sido ainda possível identificar a alteração molecular determinante da sua patologia. As amostras foram analisadas por NGS utilizando a tecnologia Ampliseq da Illumina. Esta tecnologia compreende, sucintamente, a seleção dos genes alvo a analisar, preparação do painel de sondas/amplicões específicos, preparação da biblioteca baseada em PCR-multiplex, sequenciação no equipamento MiSeq®(Illumina) e análise in silico dos resultados utilizando software específico (Variant Interpreter da Illumina). Complementarmente, realizou-se a visualização e interpretação dos resultados usando o software Integrative Genomics Viewer e, sempre que aplicável, procedeu-se à análise in silico de variantes relevantes para avaliação das suas consequências funcionais, frequência de alelos na população, conservação de aminoácidos, consulta de bases de dados e interpretação biopatológica dos resultados. Através desta abordagem, e no contexto deste estudo foram submetidas 39 amostras e 90 alterações para validação. Foi possível validar em 35 amostras um conjunto de 86 variantes em 18 genes (DDS e outras patologias), obteve-se uma taxa de validação de variantes de 95.6%. Para duas das amostras em estudo e resultando do alargamento da análise molecular a vários genes, foi possível identificar o defeito genético mais provável que constituirá a causa da doença. Na amostra PSU26, foi possível encontrar duas alterações, presumivelmente em heterozigotia composta, no gene HSD17B3 (c.876_877dupAA e c.645A>T) associadas ao fenótipo de deficiência enzimática em 17-beta-hidroxiesteróide desidrogenase. Na amostra PSU55 foi possível encontrar uma variante, em homozigotia, também no gene HSD17B3: c.277+4A>T, também associada à referida deficiência enzimática. Por último foi também possível encontrar uma alteração na amostra PSU53, NOBOX:c.1354G>A, associada a insuficiência ovárica prematura. IV Assim este estudo permitiu-nos inferir que a análise molecular que compreenda um número alargado de genes contribui para aumentar a taxa de deteção de alterações patogénicas e permite, em alguns casos, encontrar a causa da doença.
- Importância do estudo multigénico no diagnóstico molecular de doenças raras por sequenciação de nova geraçãoPublication . Gonçalves, João; Rodrigues, Pedro; Oliveira, Beatriz; Pereira Caetano, Iris; Theisen, PatríciaIntrodução: A sequenciação de nova geração (NGS) revolucionou o diagnóstico molecular das doenças raras (DR) proporcionando a análise de um maior número de genes, resultados mais rápidos e custos reduzidos. A NGS usando diferentes abordagens, possibilita o estudo do genoma (WGS), do exoma (WES), de genes individuais ou de painéis multigénicos (NGS-PMG). Objetivos: Aplicação de NGS-PMG no estudo de doenças raras específicas. Métodos: Preparação de bibliotecas de sequências-alvo a partir de DNA genómico, utilizando a captura com sondas (Trusight Cancer-Rapid Capture, Illumina) ou amplicões (painéis customizados - AmpliSeq, Illumina). Sequenciação no MiSeq (Illumina) e análise bioinformática usando software da Illumina e programas disponíveis on line. Validação de alterações pontuais por sequenciação de Sanger. Resultados: A utilização da metodologia Trusight-Cancer, que inclui a sequenciação de 94 genes de suscetibilidade para cancro hereditário (CH), permite-nos a análise seletiva de PMG, aplicados ao estudo de por ex., síndrome de Lynch, Polipose Adenomatose Familiar, cancro Hereditário da Mama e Ovário). A aplicação de PMG por AmpliSeq a um painel de genes desenhado in silico e específico de patologias do desenvolvimento sexual (PDS), permite-nos a análise molecular de 40 genes associados a hipogonadismo, Síndrome de Kallmann, insensibilidade aos androgénios, androgenização precoce, ciliopatias, falância ovárica prematura. Os resultados obtidos (sem falsos negativos), permitiram detetar diferentes tipos de alterações moleculares em doentes com diferentes DR, proporcionando em muitos um diagnóstico definitivo. Destaca-se que a estratégia de NGS implementada para o CH, integra também a avaliação de variações do número de cópias (deleções e duplicações) e a validação destes resultados por metodologia diferente - MLPA. Conclusões: A utilização de NGS-PMG possibilitando a identificação de novas variantes em novos genes, permite confirmar o diagnóstico clínico e contribuir para um melhor acompanhamento dos doentes e prevenção da doença genética hereditária. No caso de doenças cujo fenótipo não permite inferir um PMG a analisar, o alargamento ao WES ou ao WGS, para além de poder contribuir para o diagnóstico, gerará novo conhecimento e eventualmente o desenvolvimento de terapias inovadores.
- Protective effect of Crataegus monogyna Jacq. ethanolic extracts in oxidant-induced DNA damage evaluated through comet assay with human peripheral lymphocytesPublication . Barreira, Joao; Costa, Carla; Teixeira, João Paulo; Ferreira, Isabel; Oliveira, BeatrizMuch attention of preventive medicine research is focused on natural antioxidants. This interest refers not only to isolation and identification of new biologically active molecules for the pharmaceutical industry, but also because of the emergent public interest in using crude plant extracts, such as infusions for self-medication (Krishnaiah et al., 2011). The use of antioxidants, such as the well-known polyphenolic compounds, to prevent genetic damage induced by physical or chemical agents is of considerable interest. This bioactivity might be related to their anticlastogenic effect, due to the presence of specific functional groups. Other antioxidant compounds, such as vitamins C and D, were reported for their DNA-damage decreasing effect, suggesting that reactive oxygen species may be involved in this activity (Benavente-García et al., 2004). Evaluating the antioxidant activity of natural matrices represents one of our primary research challenges (Ferreira et al., 2009). Among hundreds of studied species, Crataegus monogyna Jacq. stood out as being one of the most promising plants due to its high bioactivity. Besides the antioxidant activity, C. monogyna was also studied for the human tumour cells growth inhibitory capacity of its phenolic extracts; furthermore, individual phenolic compounds were fully characterized by high performance liquid chromatography-photo diode array detection-electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-DAD-ESI/ MS), revealing high levels of flavonols, flavones, hydroxycinnamic acid derivatives and anthocyanins (Rodrigues et al., 2012). However, there is a high limitation in examining if the detected bioactivity is actually transferred from in vitro to in vivo systems (Carocho and Ferreira, 2013).