Browsing by Author "Melo Pires, Manuel"
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- Complexo distrofina-gllcoproteínas - a propósito de um doente com distrofia de BeckerPublication . Monteiro, Cecília; Taipa, Ricardo; Melo Pires, Manuel; Guimarães, António; Gonçalves, Ana Rita; Vieira, Emília; Santos, Rosário; Santos, ManuelaIntrodução: A distrofina faz parte do complexo distrofina-glicoproteínas (DAG - dystrophin associated glicoproteins) que inclui as sarcoglicanos α, β, y e δ, bem com as distroglicanos α e β. O estudo imunohistoquímico da biopsia muscular das distrofinopatias pode assim mostrar alterações na marcação não só da distrofina, como também das outras proteínas associadas. Caso clínico: Apresentamos um doente do sexo masculino com quadro clínico caracterizado por cãibras e dores musculares desencadeadas pelo esforço, com início aos 3 anos. É filho de pais não consanguíneos e não tem história familiar de doenças neuromusculares. Na primeira observação objectivou-se fraqueza muscular proximal. O valor de CK era 16700 U/L e a biópsia muscular mostrou uma distrofia muscular com diminuição grave das marcações para Dys-2, Dys-3, α-, y-sarcoglicanos e α-distroglicano; as marcações para Dys 1, β- e δ-sarcoglicano apresentavam-se ligeiramente deficitárias, e a disferlina era normal. Efectuou estudo genético com multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) para distrofinopatias que não mostrou delecções ou duplicações, e o estudo para sarcoglicanos não mostrou alterações patogénicas. Aos 6 anos foi referenciado para a consulta de doenças neuromusculares pediátrica do CHP: apresentava tetraparésia de predomínio proximal, com um envolvimento marcado cintura escapular, e hipertrofia dos deltóides e gemelar. Por sequenciação detalhada foi encontrada uma mutação no intrão 26 do gene da dístrofina (c.3603+3A>T). Em estudo do RNA obtido a partir do músculo, foram observados dois transcritos alternativos: um normal e um que inclui parte do intrão 26, resultando num mensageiro out-of-frame. Actualmente, com 11 anos e após início da fisioterapia houve uma melhoria clínica e funcional mantendo a fraqueza das cinturas com um envolvimento escapular marcado nomeadamente com atrofia. Não tem envolvimento cardíaco nem contracturas musculares. Comentários A mutação detectada, sendo out-of-frame, prevê um fenótipo de distrofia de Duchenne; no entanto, a produção residual de transcritos normais explica a apresentação como distrofia de Becker. Este doente tem a particularidade de ter uma distribuição da fraqueza pouco usual, sendo fenotipicamente semelhante às "distrofias das cinturas". As alterações marcadas no estudo imunohístoquimico podem fazer sugerir que existe uma maior agravamento do défice de força muscular dos 4 membros mais acentuada à direita, hiperreflexia OT, emagrecimento marcado (>20Kg), fasciculações, caimbras, dispneia e disfagia para líquidos. As provas de provas de função respiratória revelaram um compromisso dos grupos musculares inspiratórios e restrição volumétrica discreta. A reavaliação electromiográfica identificou lesão neurogénia crónica com aspectos de desinervação/reinervação, fasciculações nos 4 membros e músculos bulbares; coexistindo alguns aspectos miopáticos nos músculos mais proximais. A pesquisa de neoplasia oculta foi realizada anualmente, sendo persistentemente negativa. Uma segunda biopsia muscular realizada 9 anos após o início do quadro revelou a existência de aspectos compatíveis com Miosite Necrotizante. Discussão A probabilidade de coexistência de critérios clínicos e neurofisiológicos de DNM/ELA e Miosite Necrotizante versus uma única entidade clínica, numa mesma doente é discutida.
- Expanding the MTM1 mutational spectrum: novel variants including the first multi-exonic duplication and development of a locus-specific databasePublication . Oliveira, Jorge; Oliveira, Márcia E.; Kress, Wolfram; Taipa, Ricardo; Melo Pires, Manuel; Hilbert, Pascale; Baxter, Peter; Santos, Manuela; Buermans, Henk; den Dunnen, Johan; Santos, RosárioMyotubular myopathy (MIM#310400), the X-linked form of Centronuclear myopathy (CNM) is mainly characterized by neonatal hypotonia and inability to maintain unassisted respiration. The MTM1 gene, responsible for this disease, encodes myotubularin – a lipidic phosphatase involved in vesicle trafficking regulation and maturation. Recently, it was shown that myotubularin interacts with desmin, being a major regulator of intermediate filaments. We report the development of a locus-specific database for MTM1 using the Leiden Open Variation database software (http://www.lovd.nl/MTM1), with data collated for 474 mutations identified in 472 patients (by June 2012). Among the entries are a total of 25 new mutations, including a large deletion encompassing introns 2–15. During database implementation it was noticed that no large duplications had been reported. We tested a group of eight uncharacterized CNM patients for this specific type of mutation, by multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA) analysis. A large duplication spanning exons 1–5 was identified in a boy with a mild phenotype, with results pointing toward possible somatic mosaicism. Further characterization revealed that this duplication causes an in-frame deletion at the mRNA level (r.343_444del). Results obtained with a next generation sequencing approach suggested that the duplication extends into the neighboring MAMLD1 gene and subsequent cDNA analysis detected the presence of a MTM1/MAMLD1 fusion transcript. A complex rearrangement involving the duplication of exon 10 has since been reported, with detection also enabled by MLPA analysis. It is thus conceivable that large duplications in MTM1 may account for a number of CNM cases that have remained genetically unresolved.
- Nova abordagem no diagnóstico diferencial de doentes Portugueses com LGMD2A (ou Calpainopatia)Publication . Oliveira, Márcia E.; Maia, Nuno; Vieira, Emília; Evangelista, Teresinha; Melo Pires, Manuel; Peixoto Silveira, Fernando; Santos, RosárioINTRODUÇÃO A Distrofia Muscular das Cinturas tipo 2A (Limb girdle muscular dystrophy type 2A, LGMD2A) ou Calpainopatia é umas das formas mais frequentes de Distrofia Muscular das Cinturas (LGMD), de transmissão autossómica recessiva. Clinicamente, os doentes afectados com LGMD2A são caracterizados por fraqueza progressiva dos músculos das cinturas escapular e pélvica [1]. Recentemente, foram descritos casos de LGMD2A com apresentação autossómica dominante [2]. Mutações no gene CAPN3 são responsáveis pela LGMD2A, que codifica a proteína muscular Calpaína-3 (CAPN3), uma protease de cisteína dependente de iões cálcio. Esta proteína é predominantemente expressa no músculo esquelético, onde se encontra associada à titina (uma proteína muscular “gigante” envolvida na contracção-relaxamento muscular) [3]. Além da sua função proteolítica, a CAPN3 apresenta também actividade autolítica. Diversos estudos realizados têm vindo a demonstrar que o mecanismo de autólise da CAPN3 é fundamental para a activação e regulação da sua actividade proteolítica [4]. A análise proteica muscular dos doentes LGMD2A tem revelado que a maioria destes apresenta alterações na abundância da CAPN3 muscular (ausência/diminuição da abundância) por comparação com amostras controlo, através de análise por western-blotting. Paralelamente, verifica-se também a existência de um pequeno grupo de doentes com abundância normal da CAPN3 no músculo, mas cujas mutações no gene CAPN3 surpreendentemente se encontram associadas à perda da função autolítica da proteína [5]. OBJECTIVOS Dado o largo espectro de mutações detectadas nos doentes com diagnóstico molecular de LGMD2A realizado na Unidade de Genética Molecular do CGMJM, com este trabalho pretendeu-se complementar o estudo molecular num pequeno grupo de doentes LGMD2A Portugueses, na tentativa de estabelecer correlações genótipo/fenótipo. MATERIAIS E MÉTODOS Amostras de biópsia muscular de 9 doentes LGMD2A diagnosticados molecularmente e de controlos foram sujeitas a análise das proteínas musculares para estudo de abundâncias e teste da função autolítica, por western-blotting e densitometria. Adicionalmente, foram realizados estudos de expressão do gene CAPN3 por PCR em tempo real quantitativo. RESULTADOS E DISCUSSÃO A CAPN3 não foi observada em 5 amostras musculares (5 em 9) após immunoblotting, sugerindo alterações ao nível da pós-transcrição da proteína nestes doentes. O teste da função autolítica da CAPN3 foi efectuado nos doentes que apresentaram abundância “normal” nas biópsias musculares (3 em 9). Os resultados obtidos sugerem que 2 destes doentes perderam a actividade autolítica da CAPN3. Uma vez que apenas um alelo mutado foi detectado num destes 2 doentes após o seu estudo molecular, este teste foi importante para confirmar o diagnóstico de LGMD2A neste doente. A técnica de PCR em tempo real quantitativo foi realizada para avaliar diferenças nos níveis de expressão do gene CAPN3 entre os doentes e amostras musculares controlo. Surpreendentemente, nenhuma redução na expressão do gene CAPN3 foi observada nas amostras analisadas (num total de 5). Adicionalmente, duas delas (relativas a doentes com apenas 1 alelo mutado identificado) apresentaram aumento da expressão do gene CAPN3 muito superior (~3,5 a 5,5 vezes) aos controlos, sugerindo a exclusão do diagnóstico de LGMD2A nestes doentes. CONCLUSÕES FINAIS Com esta nova abordagem de estudo foi possível: i) confirmar ou excluir o diagnóstico de LGMD2A em casos com resultados inconclusivos; ii) atribuir um defeito quantitativo ou funcional dos doentes com LGMD2A; iii) sugerir outras causas de envolvimento (outros factores que não a CAPN3), principalmente em doentes não confirmados molecularmente. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Zatz M et al. Neuromuscular Disord 2003, 13:532-544. [2] Vissing J et al. Neuromuscul Disord 2011, 21:750. [3] Kramerova I et al. Biochimica et Biophysica Acta 2007, 128-144. [4] Groen EJ et al. Brain 2007, 130:3237-3249. [5] Fanin M et al. Eur J Hum Genet 2009, 17:598-603.
- O Papel da neuropatologia no diagnóstico das distrofias das cinturas autossómicas recessivasPublication . Monteiro, Cecília; Taipa, Ricardo; Alves, Ivânia; Vieira, Emília; Oliveira, Márcia E.; Melo Pires, Manuel; Santos, Rosário; Guimarães, AntónioINTRODUÇÃO As distrofias das cinturas (DC) autossómicas recessivas representam um grupo heterogéneo de doenças caracterizadas por fraqueza e atrofia muscular progressivas, com idade de início variável. Embora o diagnóstico definitivo seja genético, a biópsia muscular é utilizada para orientação da investigação. OBJECTIVO Verificar a relação entre o estudo neuropatológico e o diagnóstico genético nas DC, procurando determinar padrões histoenzimológicos e imunohistoquímicos característicos. MÉTODOS Selecção das biópsias realizadas na Unidade de Neuropatologia do HSA entre 1980 e 2011 com diagnóstico final de DC e correlação com os respectivos resultados genéticos realizados na Unidade de Genética Molecular do CGMJM. RESULTADOS Foram registadas 132 biópsias, 77 das quais com estudo genético: 18 γ-sarcoglicanopatias (23%), 7 calpainopatias (9%), 7 disferlinopatias (9%), 6 α-sarcoglicanopatias (8%) e 6 β-sarcoglicanopatias (8%); 10 correspondem a mutações menos frequentes ou mutações de outras doenças não-DC (FKRP, ANO5, TCAP, DYS, LMNA, SMA) e 23 doentes apresentaram testes genéticos negativos. O resultado neuropatológico foi confirmado pela genética em 15 γ-sarcoglicanopatias (num total de 16 propostas), 6 disferlinopatias (9 propostas), 5 α-sarcoglicanopatias (5 propostas) e 1 calpainopatia (7 propostas); uma β-sarcoglicanopatia foi proposta no estudo neuropatológico (aguarda resultado genético). O diagnóstico neuropatológico nas 6 β-sarcoglicanopatias confirmadas geneticamente foi “DC não especificada” na maioria. A revisão dessas biópsias mostrou que todas apresentam ausência ou redução marcada de pelo menos 3 dos 4 sarcoglicanos. O estudo histoenzimológico não contribuiu para o diagnóstico diferencial das diferentes DC, à excepção das calpainopatias - pela presença de fibras lobuladas, 7 biópsias foram descritas como sugestivas de calpainopatia, sendo que apenas num doente esse diagnóstico foi confirmado. As biópsias do grupo de calpainopatias confirmadas geneticamente, em que este diagnóstico não foi sugerido, não apresentavam fibras lobuladas ou infiltrados inflamatórios. DISCUSSÃO A ausência de marcação para γ-sarcoglicano, associada a restantes marcações normais ou ligeiramente alteradas sugere o diagnóstico de γ-sarcoglicanopatia, e a ausência completa ou redução marcada de 3 das 4 sarcoglicanos, pode ser considerada para o diagnóstico de β-sarcoglicanopatia. As fibras lobuladas foram inespecíficas na orientação para o diagnóstico de calpainopatia. Realçamos a importância do estudo imunohistoquímico completo, que pode ajudar a identificar padrões de expressão das proteínas da membrana, permitindo orientar o estudo genético.
- O papel da Neuropatologia no diagnóstico das distrofias musculares congénitas e sua relação com o estudo genéticoPublication . Alves, Ivânia; Taipa, Ricardo; Monteiro, Cecília; Melo Pires, Manuel; Santos, Rosário; Gonçalves, Ana Rita; Oliveira, Jorge; Guimarães, AntónioIntrodução e objectivos: As distrofias musculares congénitas (DMC) são doenças raras, caracterizadas clinicamente por hipotonia congénita, atraso no desenvolvimento motor e fraqueza muscular progressiva de início precoce, com alterações distróficas graves na biópsia muscular. Nos últimos anos, o número de genes associados aos diferentes subtipos tem aumentado e calcula-se que cerca de 1/3 dos casos sejam causados por mutações no gene LAMA2. O objectivo deste trabalho foi verificar em que medida os resultados da biópsia muscular ajudam no diagnóstico genético definitivo. Metodologia: Foram consultados retrospectivamente (de 1981 a 2011) os dados referentes a biópsias musculares classificadas como “DMC” na base de dados da Unidade de Neuropatologia do HSA e compararam-se com os resultados do estudo genético correspondente, quando realizado. Resultados: Foram identificados 51 doentes, à data da biópsia com idades compreendidas entre 1 mês e 23 anos. Os diagnósticos neuropatológicos atribuídos foram: 55% DMC; 41% DMC por défice de merosina e 4% indeterminados (DMC versus miopatia). Foram testados geneticamente 20 doentes, 15 dos quais (75%) apresentaram um resultado neuropatológico compatível com o resultado genético (défice de merosina). Dos restantes doentes 5 doentes, 2 mantêm diagnóstico indeterminado; 3 doentes previamente classificados como DMC indeterminada tiveram diagnósticos moleculares definitivos (1 atrofia espinal progressiva [mutação no gene SMN1], 1 DMC por défice de merosina e DMC [mutação no gene FKRP]). Dos doentes não testados geneticamente (31 casos), verifica-se que em apenas 14 (45%) foi realizado estudo imunocitoquímico na biópsia muscular, que mostrou um défice de merosina em 6 destes. As características histológicas e histoenzimológicas não contribuíram para a classificação dos diferentes tipos de DMCs. Discussão: O estudo imunocitoquímico para a merosina mostrou elevado valor preditivo para o diagnóstico genético deste grupo de DMCs. As características histológicas e histoenzimológicas não permitam diferenciar entre as DMCs por défice de merosina das restantes.