Browsing by Author "Maia, Nuno"
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- Análise de proteínas musculares por Western blot em doentes com Distrofia Muscular das Cinturas tipo 2A (LGMD2A)Publication . Maia, Nuno; Vieira, Emília; Santos, Rosário; Oliveira, Marcia E.Introdução: As Distrofias Musculares são um grupo de doenças musculares hereditárias, genotipicamente e fenotipicamente heterogéneo, envolvendo normalmente o músculo esquelético (1). Actualmente, estão identificados 18 genes associados a um subgrupo específico denominado Distrofias Musculares das Cinturas (LGMDs, limb-girdle muscular dystrophies), caracterizadas por fraqueza inicial da musculatura pélvica e escapular (2). Alterações no gene CAPN3 são responsáveis pelo fenótipo LGMD tipo 2A (LGMD2A), de transmissão autossómica recessiva (3), sendo esta uma das formas mais comuns (4). Este gene codifica a enzima citosólica calpaína 3 (CAPN3), expressa predominantemente no músculo esquelético e que pertence a uma família de proteases de cisteína não lissossomais dependentes de cálcio (5). Vários estudos demonstraram que a capacidade autolítica da CAPN3 é essencial para a activação e regulação da sua actividade proteolítica (6). A análise das proteínas musculares da maioria dos doentes com LGMD2A revela uma diminuição da expressão da CAPN3 comparativamente a músculos controlo. No entanto, um pequeno grupo desses doentes apresenta expressão normal da enzima, mas função autolítica deficiente (7). Objectivo: Dado o largo espectro de mutações detectadas nos doentes com diagnóstico molecular de LGMD2A realizado na UMOP, este trabalho visa complementar o estudo molecular, através da análise por Western blot das proteínas musculares, e tentar estabelecer uma relação fenótipo/genótipo. Material e Métodos: Foram utilizadas biópsias musculares de 9 doentes LGMD2A diagnosticados molecularmente na UMOP em estudos de expressão/ funcionais da CAPN3 e de outras proteínas musculares, por Western blot e densitometria. Resultados e Discussão: Não foi detectada expressão da CAPN3 em 5 amostras analisadas, sugerindo alterações ao nível da tradução da proteína. Foi verificada perda da função autolítica da CAPN3 em 2 doentes com expressão muscular da proteína. Devido à degradação generalizada do conteúdo proteico muscular verificado em algumas das biópsias estudadas, como resultado do acondicionamento inapropriado, não foi possível avaliar quantitativamente a expressão da CAPN3 e de outras proteínas musculares em todas as amostras. Por este facto, vão ainda ser realizados estudos de expressão do gene CAPN3, por PCR de tempo real, na tentativa de correlacionar todas as alterações observadas ao nível de DNA, RNA e proteína nos doentes estudados. Referências bibliográficas 1. Gaina G, Manole E, Bordea C, Ionica E. Analysis of calpain-3 in LGMD2A. Seria Stiintele Vietii (Life Sciences Series) 2008, 18:181-186. 2. Zatz M, Paula F, Starling A. The 10 autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies. Neuromuscular Disord 2003, 13:532-544. 3. Richard I, Broux O, Allamand V, Fougerousse F, Chiannilkulchai N, Bourg N, Brenguier L, Devaud C, Pasturaud P, Roudaut C, Hillaire D, Passos-Bueno MR, Zatz M, Tischfield JA, Fardeau M, Jackson CE, Cohen D, Beckmann JS. Mutations in the proteolytic enzyme calpain 3 cause limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Cell, 1995, 81:27-40. 4. Fanin M, Nascimbeni AC, Fulizio L, Angelini C. The frequency of limb girdle muscular dystrophy 2A in northeastern Italy. Neuromuscular Disord 2005, 15(3):218-224. 5. Kramerova I, Beckmann JS, Spencer MJ. Molecular and cellular basis of calpainopathy (limb girdle muscular dystrophy type 2A). Biochimica et Biophysica Acta 2007, 128-144. 6. Groen EJ, Charlton R, Barresi R, Anderson LV, Eagle M, Hudson J, Koref MS, Straub V, Bushby KMD. Analysis of the UK diagnostic strategy for limb girdle muscular dystrophy 2A. Brain 2007, 130:3237-3249. 7. Fanin M, Nascimbeni AC, Tasca E, Angelini C. How to tackle the diagnosis of limb-girdle muscular dystrophy 2A. Eur J Hum Genet 2009, 17(5):598-603.
- Atrofias Musculares Espinhais: do estudo genético ao registo de doentesPublication . Oliveira, Jorge; Rodrigues, Luisa; Maia, Nuno; Oliveira, Marcia E.; Santos, RosárioA Atrofia Muscular Espinhal (AME) caracteriza-se pela degeneração das células do corno anterior da medula espinhal, resultando em fraqueza e atrofia muscular progressiva. O espectro clínico da doença é variável, desde formas graves de inicio neonatal (tipo I/Werdnig-Hoffman, MIM#253400) a fenótipos mais ligeiros com apresentação na idade adulta (tipo IV, MIM#271150). Considerando a frequência de portadores de AME na nossa população (1/52)1, estima-se que a incidência da doença em Portugal seja ~1/10800. A AME resulta de mutações no gene SMN1, no entanto foram já descritos outros genes (nomeadamente IGHMBP2, ATP7A, GARS, TRPV4 e PLEKHG5) associados a atrofias musculares espinhais mais raras. Desde 1994 foram estudados, na unidade de Genética Molecular, 549 doentes com suspeita clínica de AME. Foi confirmado o envolvimento do gene SMN1 em 223 doentes (40,6%) pertencentes a 219 famílias. Nestes doentes, o defeito genético mais frequente consiste na delecção em homozigotia do gene SMN1 (91,9%). Em 18 doentes (8,1%) foram identificadas mutações pontuais: c.346A>T (n=1), c.524delC (n=1) c.734dupC (n=1) e c.770_780dup (n=15). De forma a possibilitar o acesso de destes doentes a futuros ensaios clínicos, encontra-se em implementação o registo nacional de doentes com AME como previamente acordado com a SPEDNM e a rede internacional TREAT-NMD. Considerando o número de doentes com suspeita de AME sem confirmação molecular e a possível sobreposição fenotípica com outras patologias (distrofias, CMT e ALS), torna-se pertinente a re-avaliação clínica destes doentes. Esta permitirá o alargamento do estudo molecular a outros genes candidatos e eventualmente a identificação de novas causas genéticas para a AME recorrendo à análise genómica em larga escala.
- Haplotype analysis of newly diagnosed Portuguese and Brazilian families with fibrinogen amyloidosis caused by the FGA p.Glu545Val variantPublication . Tavares, Isabel; Oliveira, Márcia E.; Maia, Nuno; Moreira, Luciana; Castro Lacerda, Pedro; Santos, Josefina; Santos, Rosário; Pinho Costa, Paulo; Lobato, LuísaBackground: Fibrinogen A alpha-chain (AFib) amyloidosis is an autosomal dominant disease with an endemic foci in the district of Braga, northern Portugal [1]. Among the 16 amyloidogenic mutations identified in the fibrinogen A alpha-chain gene (FGA) [2,3], the c.1634A > T (p.Glu545Val) mutation (rs121909612) is the most common and, so far, the only one identified in Portugal. A first study using three common polymorphisms showed a single haplotype, associated with the FGA p.Glu545Val mutation in Irish–American and Polish–Canadian kindreds [4]. However, the origin of this amyloidogenic variant in diverse regions and its migration in the different populations are still unclear. Therefore, we proceeded to a preliminary study using two FGA haplotype markers in newly identified Portuguese and Brazilian carriers to investigate the possibility of a common ancestor.
- Nova abordagem no diagnóstico diferencial de doentes Portugueses com LGMD2A (ou Calpainopatia)Publication . Oliveira, Márcia E.; Maia, Nuno; Vieira, Emília; Evangelista, Teresinha; Melo Pires, Manuel; Peixoto Silveira, Fernando; Santos, RosárioINTRODUÇÃO A Distrofia Muscular das Cinturas tipo 2A (Limb girdle muscular dystrophy type 2A, LGMD2A) ou Calpainopatia é umas das formas mais frequentes de Distrofia Muscular das Cinturas (LGMD), de transmissão autossómica recessiva. Clinicamente, os doentes afectados com LGMD2A são caracterizados por fraqueza progressiva dos músculos das cinturas escapular e pélvica [1]. Recentemente, foram descritos casos de LGMD2A com apresentação autossómica dominante [2]. Mutações no gene CAPN3 são responsáveis pela LGMD2A, que codifica a proteína muscular Calpaína-3 (CAPN3), uma protease de cisteína dependente de iões cálcio. Esta proteína é predominantemente expressa no músculo esquelético, onde se encontra associada à titina (uma proteína muscular “gigante” envolvida na contracção-relaxamento muscular) [3]. Além da sua função proteolítica, a CAPN3 apresenta também actividade autolítica. Diversos estudos realizados têm vindo a demonstrar que o mecanismo de autólise da CAPN3 é fundamental para a activação e regulação da sua actividade proteolítica [4]. A análise proteica muscular dos doentes LGMD2A tem revelado que a maioria destes apresenta alterações na abundância da CAPN3 muscular (ausência/diminuição da abundância) por comparação com amostras controlo, através de análise por western-blotting. Paralelamente, verifica-se também a existência de um pequeno grupo de doentes com abundância normal da CAPN3 no músculo, mas cujas mutações no gene CAPN3 surpreendentemente se encontram associadas à perda da função autolítica da proteína [5]. OBJECTIVOS Dado o largo espectro de mutações detectadas nos doentes com diagnóstico molecular de LGMD2A realizado na Unidade de Genética Molecular do CGMJM, com este trabalho pretendeu-se complementar o estudo molecular num pequeno grupo de doentes LGMD2A Portugueses, na tentativa de estabelecer correlações genótipo/fenótipo. MATERIAIS E MÉTODOS Amostras de biópsia muscular de 9 doentes LGMD2A diagnosticados molecularmente e de controlos foram sujeitas a análise das proteínas musculares para estudo de abundâncias e teste da função autolítica, por western-blotting e densitometria. Adicionalmente, foram realizados estudos de expressão do gene CAPN3 por PCR em tempo real quantitativo. RESULTADOS E DISCUSSÃO A CAPN3 não foi observada em 5 amostras musculares (5 em 9) após immunoblotting, sugerindo alterações ao nível da pós-transcrição da proteína nestes doentes. O teste da função autolítica da CAPN3 foi efectuado nos doentes que apresentaram abundância “normal” nas biópsias musculares (3 em 9). Os resultados obtidos sugerem que 2 destes doentes perderam a actividade autolítica da CAPN3. Uma vez que apenas um alelo mutado foi detectado num destes 2 doentes após o seu estudo molecular, este teste foi importante para confirmar o diagnóstico de LGMD2A neste doente. A técnica de PCR em tempo real quantitativo foi realizada para avaliar diferenças nos níveis de expressão do gene CAPN3 entre os doentes e amostras musculares controlo. Surpreendentemente, nenhuma redução na expressão do gene CAPN3 foi observada nas amostras analisadas (num total de 5). Adicionalmente, duas delas (relativas a doentes com apenas 1 alelo mutado identificado) apresentaram aumento da expressão do gene CAPN3 muito superior (~3,5 a 5,5 vezes) aos controlos, sugerindo a exclusão do diagnóstico de LGMD2A nestes doentes. CONCLUSÕES FINAIS Com esta nova abordagem de estudo foi possível: i) confirmar ou excluir o diagnóstico de LGMD2A em casos com resultados inconclusivos; ii) atribuir um defeito quantitativo ou funcional dos doentes com LGMD2A; iii) sugerir outras causas de envolvimento (outros factores que não a CAPN3), principalmente em doentes não confirmados molecularmente. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Zatz M et al. Neuromuscular Disord 2003, 13:532-544. [2] Vissing J et al. Neuromuscul Disord 2011, 21:750. [3] Kramerova I et al. Biochimica et Biophysica Acta 2007, 128-144. [4] Groen EJ et al. Brain 2007, 130:3237-3249. [5] Fanin M et al. Eur J Hum Genet 2009, 17:598-603.
- Nova abordagem no estudo da Distrofia Muscular das Cinturas tipo 2APublication . Maia, Nuno; Oliveira, Márcia E.; Almeida, AdelaideMuscular dystrophies comprise a group of heterogeneous genetic diseases characterized by progressive muscle weakness. Until now, eighteen genes have been associated to a specific subgroup of muscular dystrophies called limb-girdle muscular dystrophies (LGMD). Mutations in the CAPN3 gene are responsible for calpainopathy or limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A), one of the most frequent form of LGMD. The gene CAPN3 codes for calpain 3 (or CAPN3), a muscle-specific calcium-dependent cysteine protease functionally regulated via its autolytic activity. The pathogenesis mechanism of LGMD2A still continues to be unresolved, however functional defects of CAPN3 seem to be the major cause of the pathology. With the present work, it is proposed a new approach for the LGMD2A diagnostic analysis, combining molecular genetics and protein analysis methodologies in order to contribute to a differential diagnostic essential for global characterization of patients, specifically among patients with non-specific muscular dystrophy symptoms. Muscle biopsy samples of 9 LGMD2A patients, already studied at the molecular genetics level, were subjected to protein analysis and functional tests by western blotting and densitometry analyses. Additionally, gene expression studies were performed using real-time quantitative PCR. A global analysis of the data obtained allowed us: (a) to complement the previous molecular genetics study in patients 2-7, including the identification of a CAPN3 functional defect in patient 3; (b) to confirm the clinical diagnostic in patient 8 (with only one mutation in heterozygous state) also caused by a protein functional defect; and (c) to exclude the CAPN3 implication in the other two patients which presented one mutated allele in heterozygous state, because of the detection of an overexpression of the CAPN3 gene in comparison to control samples.
- Refining the molecular characterization of calpainopathy (LGMD2A) patientsPublication . Maia, Nuno; Vieira, Emília; Santos, Rosário; Oliveira, Márcia E.Introduction: Mutations in the gene CAPN3 are responsible for calpainopathy or limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A), one of the most frequent forms of LGMD. The gene CAPN3 codes for calpain-3 (or CAPN3), a muscle-specific calcium-dependent protease functionally regulated via its autolytic activity. Most of the patients show differences in CAPN3 abundance in muscle samples as compared to control muscles, by immunoblot analysis. Interestingly, a smaller group of patients with normal protein abundance presents abnormal CAPN3 autolytic function. We intend to complement the molecular studies already carried out on small group of Portuguese LGMD2A patients in order to establish genotype/phenotype correlations. Materials and methods: Muscle biopsy samples of 9 LGMD2A patients diagnosed in our laboratory were subjected to protein analysis and functional tests by western blotting and densitometry analyses. Additionally, gene expression studies were performed using real-time quantitative PCR. Results and discussion: The autolytic CAPN3 biochemical test was used in the patients that presented “normal” CAPN3 abundance in muscle biopsies (3 out of 9). The data obtained suggested that two of these patients had lost CAPN3 autolytic activity. Although, only one mutated allele had been found in one of these 2 patients after molecular genetic testing, this biochemical test was important in providing a differential diagnosis of LGMD2A in these patients. Real-time quantitative PCR was done in order to quantify differences in the expression level of the CAPN3 gene between patients’ samples and controls. Interestingly, no reduction of CAPN3 expression was observed in the samples tested (= 5). Additionally, two of them presented an overexpression of CAPN3 gene as compared to controls. Once again, in these 2 patients only one mutated allele had been detected. In these cases, the data suggests that the diagnosis of calpainopathy may be excluded in these 2 patients.