Browsing by Author "Costa, Nuno"
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- How mRNA translation is involved in modulating nonsense-mediated decay in transcripts with short open reading framesPublication . Onofre, Cláudia; Menezes, Juliane; Peixeiro, Isabel; Costa, Nuno; Barbosa, Cristina; Romão, LuísaNonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a surveillance pathway that recognizes and selectively degrades mRNAs carrying premature termination codons (PTCs). In addition, several studies have also implicated NMD in the regulation of steady-state levels of physiological mRNAs, and examples of natural NMD targets are transcripts containing upstream short open reading frames or long 3’ untranslated regions. The strength of the NMD response appears to reflect multiple determinants on a target mRNA. We have reported that human mRNAs with a PTC in close proximity to the translation initiation codon (AUG-proximal PTC), and thus, with a short open reading frame, can substantially escape NMD. Our data support a model in which cytoplasmic poly(A)-binding protein 1 (PABPC1) is brought into close proximity with an AUG-proximal PTC via interactions with the translation initiation complexes. This proximity of PABPC1 to the AUG-proximal PTC allows PABPC1 to interact with eRF3 with a consequent enhancement of the release reaction and repression of the NMD response. Here, we provide strong evidence that the eIF3 is involved in delivering eIF4G-associated PABPC1 into the vicinity of the AUG-proximal PTC. In addition, we dissect the biochemical interactions of the eIF3 subunits in bridging PABPC1/eIF4G complex to the 40S ribosomal subunit. Together, our data provide a framework for understanding the mechanistic details of PTC definition and translation initiation.
- How mRNA translation is involved in modulating nonsense-mediated decay in transcripts with short open reading framesPublication . Onofre, Claudia; Menezes, Juliane; Peixeiro, Isabel; Costa, Nuno; Barbosa, Cristina; Romão, LuísaBeyond its well-known hematopoietic action, erythropoietin (EPO) has diverse cellular effects in non-hematopoietic tissues. For example, in cases of tissue injury, such as cardiac ischemia or acute myocardial infarct, EPO expression increases locally, providing a cardioprotective effect. Cellular stress activates an integrated stress response, which includes rapid changes in global and gene-specific translation. Translational regulation of specific transcripts mostly occurs at translation initiation and is mediated via different cis-acting elements, including upstream open reading frames (uORFs). The human EPO 5’ untranslated region (5’UTR) has one uORF with 14 codons that is conserved among different species, indicating its potential regulatory role. To test whether EPO expression is translationally regulated in response to ischemia in cardiac tissue, reporter constructs containing the normal or mutant EPO 5’UTR fused to the Firefly luciferase cistron were expressed in H9c2 (heart/myocardium myoblasts) and C2C12 (muscle myoblasts) cell lines. Luminometry assays revealed that the EPO uORF represses translation of the main ORF at about 60-70%, in both cell lines. Under chemical ischemia, EPO uORF-mediated translation repression is specifically released in muscle cells. In response to hypoxia, translational derepression occurs in both cell lines. Although the eIF2-alpha phosphorylation occurs in both conditions, thapsigargin treatment does not affect EPO translation. We are currently exploring additional mechanisms through which EPO cardioprotection effects are regulated at the translational level.
- The mechanism of nonsense-mediated mRNA decayPublication . Costa, Nuno; Romão, Luísa; Menezes, Juliane[PT] A expressão genética representa uma das vias mais complexas e importantes para a célula, que culminam na síntese proteica. Como tal, quaisquer erros que possam surgir durante estes eventos podem ser rapidamente amplificados e terem um impacto severo na célula. Portanto surgiram diversos mecanismos de controlo de qualidade para assegurar a fidelidade da expressão genética. Entre estes mecanismos está o decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense (na sigla inglesa NMD – nonsense mediated decay) que permite rapidamente degradar transcritos que contenham codões de terminação de tradução prematuros (na sigla inglesa PTC – premature translation termination codon), reduzindo a sua abundância1. A eliminação destes transcritos anómalos evita a formação e acumulação de proteínas truncadas no C-terminal potencialmente tóxicas que, caso contrário, danificariam a célula. Assim, o NMD tem um papel protector contra erros genéticos, muitos dos quais originam PTCs. Recentemente, tem-se tornado óbvio que o NMD tem um papel mais abrangente, não só funcionando como mecanismo de controlo de qualidade da expressão genética, mas também apresenta uma importante função na regulação de transcritos fisiológicos2,3. De facto foi demonstrado que o NMD controla a abundância de 3 a 10% de todo o transcriptoma em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster e em Homo sapiens, pois estes transcritos possuem várias características que os tornam sensíveis à acção do NMD4. Nas células humanas, este mecanismo envolve a acção dos factores UPF1 (upframe shift), UPF2, UPF3 e dos factores SMG1 (suppressor with morphogenetic effects on genitalia), SMG5, SMG6 e SMG75. O NMD é activado assim que um PTC é identificado. Os factores UPF1, UPF2, UPF3 e SMG1 são recrutados e interagem com o ribossoma e com os factores de terminação de tradução eRF3 e eRF1 (eukaryotic release factor), formando o complexo DECID (decay inducing complex)6,7. Este complexo estimula a fosforilação do UPF18, o que conduz ao recrutamento dos factores SMG5/SMG7 ou SMG6, que activam a degradação do ácido ribonucleico (RNA) pela acção de exossomas5. Grande parte da pesquisa sobre o mecanismo do NMD tem-se focado na forma como este mecanismo diferencia um PTC de um codão de terminação normal. De acordo com o modelo prevalente, nas células dos mamíferos a capacidade do NMD reconhecer um PTC depende dos complexos de junção exão-exão (na sigla inglesa EJC). Os EJC são complexos multiproteicos depositados a 20 a 24 nucleótidos (nt) de distância a montante dos locais de excisão de intrões (junções exão-exão) durante o splicing do mRNA precursor9. Estes complexos mantêm-se associados ao mRNA durante o seu transporte para o citoplasma, servindo como marcadores dos locais de excisão de intrões e também como plataformas de ligação dos factores do NMD, UPF2 e UPF310–12. Durante o primeiro ciclo da tradução, se o transcrito não tiver PTC, o complexo ribossomal dissocia os EJCs para fora da grelha de leitura até chegar ao codão de terminação. No entanto, se o transcrito possuir um PTC e este se localizar a pelo menos 50 a 55 nt de distância a montante da última junção exão-exão, a elongação é terminada prematuramente e pelo menos um EJC fica associado ao mRNA13. Nestas condições, o EJC facilita o recrutamento e a interacção dos factores do NMD (UPF1, UPF2 e UPF3) com o complexo ribossomal, activando o NMD. Por outro lado, se o PTC se localizar depois desta fronteira localizada a 55 nts a montante da última junção exão-exão, o ribossoma consegue remover todos os EJCs, que não poderão, assim, desencadear a degradação do transcrito14. Contudo esta regra posicional do EJC não explica todos os transcritos susceptíveis de serem degradados por NMD. Existem transcritos que mesmo estando nas condições previstas pelo modelo (i.e.: no qual o PTC está localizado a pelo menos 50-55 nt de distância a montante da última junção exão-exão), conseguem resistir à acção do NMD, como é o caso de mRNAs que contenham PTC próximos do codão de iniciação15. De facto, verificou-se que existem outras características do mRNA, para além dos EJC, que influenciam a activação do NMD. Por exemplo, trabalhos feitos pelo grupo laboratorial onde este projecto experimental foi desenvolvido, apontam para a distância física entre um PTC e a proteína citoplasmática de ligação à cauda poli-A do mRNA (na sigla inglesa PABPC1) como sendo um factor que afecta a activação do NMD16. Foi demonstrado que a PABPC1 consegue interagir com a proteína eRF3 e pensa-se que a PABPC1 é necessária para estimular um processo de terminação correcto e eficiente17,18. Para além disso, a PABPC1 consegue competir com a UPF1 pela ligação ao eRF3, inibindo o NMD, mesmo na presença de um EJC a jusante16,19. Propôs-se assim um novo modelo: se o ribossoma ao chegar ao PTC ficar fisicamente perto da PABPC1, ocorre terminação correcta e não há indução do NMD. No caso em que o ribossoma ao chegar ao PTC não possa interagir com a PABPC1, a UPF1 interage com o complexo eRF3/eRF1 e inicia-se o NMD11. Portanto, tendo em consideração este modelo e sabendo que o mRNA adquire uma conformação circular devido à interacção do factor eucariótico de iniciação 4G (na sigla inglesa eIF4G) com a estrutura cap na extremidade 5’, a PABPC1, o complexo eIF3 e o ribossoma, pode-se colocar a hipótese de a PABPC1 ser arrastada para a vizinhança do codão de iniciação pelo ribossoma durante o scanning. Nestas condições a PABPC1 encontra-se próxima o suficiente para competir com a UPF1, caso ocorra terminação prematura na vizinhança do codão de iniciação, permitindo assim explicar a resistência ao NMD dos transcritos contendo PTCs próximos do codão de iniciação. Esta tese teve como objectivo testar esta hipótese. Procedeu-se á construção de plasmídeos necessários para estudar a interacção do PABPC1 com o ribossoma. Os plasmídeos contêm a sequência da β-globina (que origina um pequeno transcrito de três exões cujas mutações nonsense já foram extensivamente descritas) e várias repetições da sequência do sítio de ligação da cápside do bacteriófago MS2. Estas sequências são aptámeros de RNA naturais que em conjunto com uma proteína recombinante contendo o N-terminal da proteína da cápside do MS2 e um anticorpo específico, permitem a imunoprecipitação selectiva destes transcritos e de qualquer proteína associada. A construção dos plasmídeos foi iniciada usando um processo de SOEing PCR. O factor de iniciação da tradução eIF3 é um complexo multiproteico que interage com o ribossoma e a proteína eIF4G, funcionando como um ponte entre os dois durante o processo de iniciação da tradução. Trabalhos feitos pelo nosso grupo laboratorial mostraram que as subunidades eIF3h e eIF3f podem estar envolvidas na interacção do ribossoma com a PABPC1 (através da eIF4G)20 e portanto podem ser necessárias ao deslocamento da PABPC1 para a vizinhança do codão de iniciação pelo ribossoma. Para testar o papel das subunidades eIF3h e eIF3f na ligação entre o complexo ribossomal 40S e a PABPC1 (através do eIF4G), isolou-se por imunoprecipitação, utilizando anticorpos anti-eIF3h ou eIF3f, os complexos ribonucleoproteícos (na sigla inglesa mRNPs) de células HeLa tratadas com RNAs de interferência (na sigla inglesa siRNA) específicos para as subunidades eIF3h ou eIF3f, respectivamente. Os imunoprecipitados foram testados por Western Blot para detectar a presença de PABPC1, eIF4G e proteínas do ribossoma. Nas imunoprecipitações de mRNPs de células HeLa tratadas com siRNAs para a subunidade eIF3f, verificou-se uma ligeira diminuição dos níveis proteicos tanto da PABPC1 como do eIF4G, suportando um modelo no qual a eIF3f é responsável pela aproximação do complexo PABPC1/eIF4G ao ribossoma. Já a imunoprecipitação de mRNPs de células tratadas com siRNA para a subunidade eIF3h, não se observaram variações significativas na expressão da proteína eIF4G e não foi detectada a proteína PABPC1. Contudo a ausência de sinal da PABPC1 pode ter ocorrido devido à perca de proteína durante a remoção dos anticorpos para reutilização da membrana de PVDF. Além disso, a eficiência do silenciamento das subunidades não foi satisfatória, resultando numa diminuição pouco apreciável dos níveis proteicos de eIF3h ou eIF3f. Assim sendo, tanto o processo de imunoprecipitação e o método de silenciamento devem ser optimizados para que se possam tirar conclusões definitivas.