Departamento de Doenças Infecciosas
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Browsing Departamento de Doenças Infecciosas by advisor "Caniça, Manuela"
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- Assessing antibiotic resistance in Gram negative bacteria from animals and the wider environmentPublication . Jones-Dias, Daniela; Caniça, Manuela; Nogueira, IsabelThe alarming increase in the levels of antibiotic resistant bacteria in clinical practice launched the call for a broader understanding of this event. This Ph.D. thesis aimed to unravel the main mobile antibiotic resistance determinants circulating in Gram negative bacteria from non-human sources, showing the contribution of mobile genetic elements for the overall process. The susceptibility and molecular epidemiological studies performed on different collections of bacterial isolates showed the predominance of multidrug resistant Escherichia coli in animals of different origins, soil and vegetables. E. coli and other species of Gram negative bacteria were related with carriage of diverse antibiotic resistance genes [e.g. blaCTX-M-1, blaCTX-M-15, blaCMY-2, blaGES-11, qnrS1, aac(6’)-Ib-cr, strAB, tet, drfA, aadA, mcr-1] that were associated with a transferable genetic support. Indeed, an assortment of mobile genetic elements (e.g. IncI1 and IncF plasmids, ISEcp1 insertion sequences, Tn402 and Tn7 transposons and class 1, 2 and 3 integrons) was detected in the genetic proximity of those antibiotic resistance genes, suggesting their profound involvement, not only in interspecies dispersion, but also in the movement of the genes within the cell. Specific genomic investigation of two Enterobactericeae isolates and the proteomic study of a third, underscored the potential of massive omic approaches to study antibiotic resistance as a global process. One of the key findings released from these studies is that antibiotic resistance is not only linked to virulence and pathogenicity, but can also be connected to core bacterial metabolic processes. The results obtained throughout this thesis extend our knowledge on the distribution of mobile antibiotic resistance genes in animals, environment and, ultimately, in the food chain. If the gathered results increased our concerns towards the current distribution of antibiotic resistant bacteria, they can also be an encouragement to address this problem at a global scale.
- Caracterização dos mecanismos de resistência aos antibióticos em estirpes de origem humana, ambientes associados aos cuidados de saúde e veterináriaPublication . Salgueiro, Vanessa; Caniça, Manuela; Rebelo, Maria TeresaA resistência aos antibióticos é atualmente um problema de saúde pública a nível mundial. Este fenómeno envolve diversos mecanismos e espécies bacterianas, revelando-se de extrema importância a sua compreensão, através de investigação e vigilância, para evitar possíveis disseminações. Neste âmbito, este trabalho teve como principal objetivo a caracterização de mecanismos de resistência aos antibióticos em 139 estirpes bacterianas com três origens distintas: hospitais (Acinetobacter baumannii, Exiguobacterium acetylicum, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis e Staphylococ-cus epidermidis), ambiente de instituições de cuidados continuados (Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter junii, Acinetobacter pittii, Klebsiella oxyto-ca, Micrococcus luteus, Pantoea spp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas oryzihabi-tans, Pseudomonas putida, Sphingomonas paucimobilis, S. capitis, Staphylococcus capi-tis/caprae/warneri, S. epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis e Staphylococcus xylosos) e animais (S. aureus e Staphylococcus simiae). A realização de testes de suscetibilidade aos antibióticos (difusão em disco e E-teste) permitiu não só a identificação de estirpes com suscetibilidade diminuída às várias classes de antibióticos ensaiadas, mas também a orientação da pesquisa de genes de resistência por PCR (Polymerase Chain Reaction). Procurou-se estudar a diversidade genética das es-tirpes de A. baumannii através da deteção de linhagens clonais com importância internacio-nal e MLST (Multilocus Sequence Typing). No caso particular de S. aureus, a tipagem dos genes spa e agr, assim como MLST, permitiram estabelecer relações genéticas entre estas estirpes. Por outro lado, o método de PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis), utilizado para K. oxytoca, possibilitou a avaliação da clonalidade de uma estirpe ambiental em relação a estirpes de origem clínica. A maioria das estirpes coletadas em hospitais possuía um fenótipo de multirresistên-cia, ao contrário das estipes com origem nos lares e em animais. Aí se destaca a suscetibili-dade diminuída à ciprofloxacina e cefoxitina, esta última por expressão do gene mecA, em S. aureus e a suscetibilidade diminuída aos carbapenemes em A. baumannii e P. aerugino-sa, diminuindo as opções de tratamento disponíveis para infeções causadas por estas bactérias. Em A. baumannii foram encontrados os genes blaOXA-66 e blaOXA-23 e a sequência de inserção ISAba1. Em P. aeruginosa detetaram-se os genes blaGES-7-tipo, blaVEB-tipo, blaVIM-2 e blaVIM-11. A identificação do mesmo tipo de spa e ST em estirpes de S. aureus com origem humana e animal demonstra a possível disseminação entre estes dois reservatórios. A caracterização molecular permitiu ainda identificar uma eventual transferência de uma estirpe e/ou de determinantes de resistência entre S. capitis de um hospital e de um lar, situados na mesma área geográfica. Os lares e os animais, em paralelo com o Homem, poderão ser reservatórios de genes de resistência. Assim, é essencial um melhor conhecimento dos mecanismos de resistência e das vias de disseminação nestes reservatórios, para intervir e controlar a sua emergência e expansão.
- Controlo de qualidade em laboratório clínico: hemoglobinopatiasPublication . Vilhena, Filipa; Caniça, Manuela; Faria, Ana Paula; Miranda, Armandina[PT] O laboratório clínico deve utilizar metodologias de controlo de qualidade que permitam identificar, prevenir e corrigir possíveis falhas e assim garantir a exatidão dos seus resultados. O Controlo de Qualidade laboratorial é de elevada importância quer através da aplicação de metodologias de Controlo de Qualidade Interno (CQI) para avaliação da precisão analítica, quer através da participação em programas de Avaliação Externa da Qualidade (AEQ) para avaliação da exatidão analítica. As hemoglobinopatias são doenças monogénicas com transmissão de forma autossómica recessiva, causadas por mutações ao nível dos genes das globinas humanas, que conduzem à síntese reduzida da hemoglobina (talassémias) ou à formação de hemoglobinas estruturalmente anómalas (variantes). O estudo apresentado incidiu sobre os resultados do CQI e da participação em programas de AEQ da Unidade de Diagnóstico Laboratorial de Referência (UDR) do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, bem como dos ensaios de AEQ organizados pelo Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade (PNAEQ) ao nível do doseamento de Hb A2, Hb F e Hb S realizados entre 2011 e 2014. Ao nível do CQI, verificou-se uma melhoria da precisão analítica no doseamento de amostras controlo de nível de concentração normal para a Hb A2, normal e elevado para a Hb F. O erro total associado ao doseamento da Hb A2 e da Hb F apresenta, de um modo geral, uma tendência decrescente. Relativamente ao doseamento da Hb S o mesmo só se verifica para as amostras analisadas no equipamento HA 8160. Entre 2011 e 2014 foram organizados pelo PNAEQ oito ensaios no âmbito das hemoglobinopatias. Os resultados obtidos indicam que, para as diferentes hemoglobinas estudadas, existe uma grande variabilidade nos resultados entre os laboratórios participantes.
- Decrypting the diversity of microbiome in aquaculturePublication . Salgueiro, Vanessa; Caniça, Manuela; Manageiro, Vera; Nogueira, IsabelAquaculture can play an important role in reducing the overexploitation of natural re- sources and feeding the world’s growing population. However, the use of e.g., antibiotics in aquaculture can favor the development of resistant bacteria and jeopardize the safety of its products. Thus, this Ph.D. thesis aimed to contribute to the deciphering of aquaculture’s mi- crobiome and resistome, as well as to the understanding of the role of mobile genetic elements (MGE) in the dissemination of resistance genes in these environments. Several approaches were used, to obtain the results that most reflect the microbiome and resistome of seabream and bivalve mollusks from aquaculture. All microbiomes studied were very diverse, encompassing commensal and pathogenic bacteria from seabream and bivalve mollusks (e.g., Aeromonas,Kocuria, Pseudomonas and Vibrio genera), as well as bacteria important in human medicine (e.g., Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae). Twenty-one new se- quence types were described in Aeromonas spp., Citrobacter sp., Enterobacter spp., Shewanella spp., Staphylococcus sp. and Vibrio spp. Decreased susceptibilities to phenicols, oxytetracy- cline, β-lactams (namely carbapenems), quinolones, glycopeptides, mupirocin, erythromycin, and colistin were found. The resistome also revealed a great diversity of genes in all samples studied associated with antibiotics (e.g., blaTEM-1B, mecA, sul2, mcr-9.1), disinfectants (e.g.,formA-type), and heavy metals (e.g., sil) resistance. Twenty-five different genes related with increased virulence were also detected. Thirteen new β-lactams resistance genes were identi- fied (e.g., blaCTX-M-246, blaFOX-18, and blaOXA-958) and 35 other resistance genes, namely for antibi- otics (e.g., mcr-9 and qnrD2), heavy metals (e.g., emrA and mdtE) and disinfectants ( sitABCD- type), and virulence factors (e.g., astA and hlyF) were here described for the first time associated with aquaculture. Our results suggest that some of these resistance genes (e.g., erm(T)-type,qnrB19, catA1-type, tet(A), dfrA-type, aph(6)-Id, qacE∆ 1 and merA) are being disseminated by MGE such as plasmids, class 1 integrons, and Tn As1. These findings not only expand our knowledge about aquaculture’s microbiome and resistome, but also provide the necessary xiv information to implement the most suitable measures to control antibiotic resistance in aqua- culture environments.
- Dynamics of β-lactamases in Gram-negative bacteriaPublication . Manageiro, Vera; Caniça, Manuela; Caeiro, Maria Filomenaβ-Lactamase production is the most important resistance mechanism among Gram-negative bacteria. The overall aim of this PhD thesis was to contribute to the knowledge of molecular epidemiology of β-lactamases and to the understanding of their diversity in a structural-functional level. To accomplish this aim, several studies with different approaches were performed. The emergence of β-lactamase-producing isolates, as well as the appearance of new epidemic clones, is of great concern. The studies presented in the first chapter of results, have clearly shown that specific extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-, plasmid-mediated AmpC β-lactamase (PMAβ)- and carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDL)-producing clones are able to persist in clinical settings for long periods, resulting in a complex β-lactamase endemic situation. A high diversity of β-lactamases was encountered, specifically: CTX-M family which is the most prevalent ESBL, and PMAβ (e.g., DHA-1, CMY-2, CMY-39, MIR-1, MIR-3, FOX-5 and the novel CMY-46 and CMY-50), both in Enterobacteriaceae, as well as CHDLs OXA-23 and OXA-24/40 in Acinetobacter baumannii. The results obtained in this thesis also highlight different strategies for bacterial spread of resistance that can occur through either clonal spread or horizontal gene transfer of mobile genetic elements. In the second chapter of results, structure/function correlation of five novel clinical important β-lactamases, namely three inhibitor-resistant SHV (SHV-72, SHV-84 and SHV-107), one ESBL (SHV-55) and one parental SHV (SHV-99), are presented. One of the key findings we can infer from results is that the conserved motif Lys234-Thr/Ser235-Gly236, present in class A β-lactamases, is a hot-spot for β-lactamase inhibition, meaning that new compounds can be designed to address this structural feature. In summary, the work performed in this thesis allows the elucidation on the dynamics of β-lactamases in Gram-negative bacteria, in Portugal. Molecular characterization together with biochemical data is essential for understanding the emergence of new resistance mechanisms and their spread.
- Evolução da resistência aos antibióticos em estirpes isoladas de diferentes reservatóriosPublication . Graça, Rafael; Caniça, Manuela; Dias, DeodáliaA resistência aos antibióticos é um problema global e atual. O uso e mau uso de antibióticos não só em medicina humana e veterinária, mas também no ambiente, são fatores responsáveis pela emergência e disseminação de bactérias multirresistentes. A difusão das β-lactamases de espectro alargado (ESBL) constitui o principal mecanismo de resistência às cefalosporinas de 3ª geração em bactérias de Gram-negativo. Atualmente, as ESBL, particularmente as produtoras de CTX-M, têm emergido em diferentes reservatórios (animal, homem e ambiente). A produção de CTX-M, concomitantemente com a resistência a outras classes de antibióticos, ou mesmo por coprodução de outras β-lactamases (como as carbapenemases), tem constituído uma forma das bactérias se tornarem multirresistentes. No sentido de avaliar a evolução da resistência aos antibióticos em estirpes de Escherichia coli isoladas de diferentes reservatórios, este trabalho teve como objetivos específicos: a) investigar a diversidade das β-lactamases produzidas por 68 isolados de origem humana e animal e avaliar a sua suscetibilidade às diferentes classes de antibióticos; b) caracterizar a estrutura-função da nova enzima CTX-M-166 e estudar as suas consequências fenotípicas. Para alcançar estes objetivos, foi utilizada uma combinação de métodos fenotípicos, de biologia molecular e bioquímicos. A caracterização molecular dos mecanismos de resistência permitiu identificar uma grande diversidade de β-lactamases: penicilinases (TEM-1 e OXA-tipo); ESBLs da família CTX-M [CTX-M-1, CTX-M-14, CTX-M-15 (mais prevalente), CTX-M-27, CTX-M-32 e CTX-M-166 (nova variante)], TEM (TEM-52) e SHV (SHV-12); resistentes aos inibidores (TEM-30/IRT-2); e AmpCs plasmídicas (CMY-2 e DHA-1). Foram também identificados genes plasmídicos de resistência às fluoroquinolonas: aac(6’)-Ib-cr e qnrB 19. Dos 68 isolados analisados, 75% revelaram ser multirresistentes. A determinação das constantes cinéticas da CTX-M-166, identificada num isolado de origem animal, permitiu verificar uma diminuição na eficiência catalítica (kcat/Km), em comparação com a CTX-M-1. Contudo, a substituição aminoacídica Ala120Val contribuiu para o aumento da afinidade (Km) para a penicilina G, piperacilina, cefotaxima e ceftiofur, sendo este último antibiótico exclusivamente utilizado em medicina veterinária. Em conclusão, este estudo evidenciou uma grande diversidade de β-lactamases em isolados de E. coli de vários reservatórios, e uma elevada prevalência de multirresistência. Contribuiu ainda para uma melhor compreensão da evolução das propriedades catalíticas das enzimas CTX-M.
- Mecanismos de resistência aos antibióticos em bactérias de Gram negativo com susceptibilidade diminuida aos carbapenemes: caracterização laboratorialPublication . Simões, Constança; Caniça, Manuela; Dias, DeodáliaOs carbapenemes são antibióticos β-lactâmicos utilizados como último recurso no tratamento de infeções causadas por bactérias de Gram negativo. Considerando a emergência da resistência a estes antibióticos, importa esclarecer os mecanismos que estão na origem desta diminuição de suscetibilidade. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar, laboratorialmente, os mecanismos responsáveis pela resistência aos carbapenemes em isolados clínicos de Gram negativo, a sua multirresistência, e as vias implicadas na possível disseminação dessa resistência. Dos 426 isolados estudados, foram identificados 22 (5%) com suscetibilidade diminuída ao ertapeneme, os quais foram retidos para a restante investigação. Assim, com os testes de suscetibilidade aos antibióticos realizados, verificou-se que 4% dos isolados apresentavam multirresistência aos antibióticos, tendo ainda permitido predizer mecanismos de resistência responsáveis pelos fenótipos encontrados, e orientar os estudos bioquímicos e moleculares. Estas duas últimas abordagens metodológicas identificaram e caraterizaram a expressão de carbapenemases (3 KPC- 3 e 1 GES-5) e/ou a expressão de β-lactamases de espectro alargado (ESBL) ou AmpC (MIR-tipo). Em 21 isolados foi identificada a alteração aminoacídica das principais porinas (por inserção, deleção e/ou substituição): OmpK35, OmpK36, OmpK37 (Klebsiella pneumoniae), OmpC, OmpF (Escherichia coli, Enterobacter cloacae e Enterobacter cancerogenus), Omp35 e Omp36 (Enterobacter aerogenes). A ESBL predominante foi a β-lactamase CTX-M-15 (n=11) em co-expressão com OXA-1 e TEM-1, bem como a enzima Aac(6’)-Ib-cr (n=8) e OqxAB (n=5); um isolado coexpressava a ESBL SHV-12 e GES-5. Foram identificadas outras β-lactamases, como SHV-1, SHV-11 e SHV-32. Se E. coli pertencia à sequência tipo ST131, estirpe pandémica, já K. pneumoniae apresentou diversidade genética, destacando-se 2 isolados com ST147, disseminado em vários países, e o novo ST1138. Globalmente, este estudo dá um contributo muito importante para o conhecimento dos mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenemes (cuja disseminação clonal e horizontal é preocupante), nomeadamente em isolados com multirresistência, realçando-se a resistência plasmídica às fluoroquinolonas.