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Avaliação da genotoxicidade de nanomateriais através do ensaio do micronúcleo: Uma comparação interlaboratorial para a sua validação.
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Authors
Abstract(s)
Nanomaterials (NMs) have unique physico-chemical characteristics that make them ideal for various applications in numerous areas. With the increase in the use of NMs in some industries and consumer products, among others, human and environmental exposure to these substances has increased more and more, and further studies are needed to understand the potential risks associated with such exposure.
Currently, the in vitro micronucleus assay (MN) in cytokinesis-blocked cells is one of the most widely used tests for genotoxic substances assessment and is considered the gold standard when compared to other similar tests. Even though it is an appropriate test, the comparability of the MN assay results is difficult due to inconsistent results reported. Thus, there is a need to develop harmonised protocols and select the most sensitive cell lines, given the particularities of these substances, in order to validate techniques like this one
This project, which is part of a larger international study involving interlaboratorial comparisons, aims to optimize the in vitro micronucleus assay to obtain a more sensitive and reliable assay for the evaluation of nanomaterial genotoxicity in mammalian cell lines. The toxicity of nanomaterials was evaluated, namely, cerium dioxide (CeO2), barium sulfate (BaSO4), silica (SiO2), cellulose nanofibrillated (CNF) and cellulose nanocrystalline (CNC), all of them with varied applications in industry and consumer products. Chinese hamster lung fibroblasts (V79 cells) were exposed to different concentrations of each NM during 1 cell cycle (17 hours) to assess cytotoxicity through the MTT assay [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] and for 4 days for the clonogenic assay. Genotoxicity was assessed by the MN assay after exposure to the same concentration-range of nanomaterials for 17 hours.
The results showed a significant decrease in cell viability after exposure to BaSO4 at the highest concentrations (64, 128 and 256 μg/mL) tested. The exposure for 4 days to BaSO4, CNF or CNC led to a decrease in cell proliferation, showing positive cytotoxic effects for these NMs.
As for genotoxic effects, assessed by the MN assay, the results revealed a significant increase in the frequency of micronucleated cells after exposure to CNF, as well as to the lowest concentration of BaSO4. CeO2 and SiO2 nanomaterials were not genotoxic.
The knowledge generated through this project will contribute to data set on the use of the in vitro micronucleus assay for the genotoxicity assessment of nanomaterials. The results obtained for the several NMs assessed suggest that the protocol used for the MN assay allowed to distinguish differential effects regarding their genotoxicity. Furthermore, the results generated will add to the safety assessment of the NMs under study, thereby contributing to their safe application in industry, consumer products and nanotheranostics. A future interlaboratory comparison will allow to assess the assay reproducibility and adequacy, considering the physical-chemical characteristics of the NMs under test, and the use of standardized protocols will improve results comparability.
Os nanomateriais (NMs) apresentam características físico-químicas únicas que os tornam ideais para várias aplicações em inúmeras áreas. Com o incremento do uso de NMs em algumas indústrias e produtos de consumo, entre outros, a exposição humana e ambiental a essas substâncias tem aumentado cada vez mais, sendo necessários mais estudos para compreender os potenciais perigos associados a essa exposição. Atualmente, o ensaio do micronúcleo (MN) é um dos testes mais utilizados na avaliação da genotoxicidade de substâncias sendo considerado mais vantajoso quando comparado com outros testes similares. Mesmo sendo um teste apropriado, a comparação dos resultados do ensaio MN é difícil devido aos resultados inconsistentes reportados. Assim, há a necessidade de desenvolver protocolos harmonizados e selecionar as linhas celulares mais sensíveis, dadas as particularidades dessas substâncias, a fim de validar técnicas como esta. Este trabalho, que se insere num estudo internacional mais amplo envolvendo comparações interlaboratoriais, tem como objetivo otimizar o ensaio do micronúcleo in vitro de forma a obter um ensaio mais sensível e fiável para a avaliação da genotoxicidade dos NMs em linhas celulares de mamíferos. Foi avaliada a toxicidade de NMs, nomeadamente, dióxido de cério (CeO2), sulfato de bário (BaSO4), sílica (SiO2), celulose nanofibrilada (CNF) e celulose nanocristalina (CNC), todos eles com aplicações variadas na indústria e produtos de consumo Fibroblastos de pulmão de hamster chinês (células V79) foram expostos a diferentes concentrações de cada NM durante 1 ciclo celular (17 horas) para avaliação da citotoxicidade através do ensaio MTT e por 4 dias através do ensaio clonogénico. A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do MN após exposição durante 17 horas às mesmas concentrações dos NMs. Os resultados mostraram uma diminuição significativa da viabilidade celular após exposição ao BaSO4 nas concentrações mais elevadas (64, 128 e 256 μg/mL). A exposição por 4 dias a BaSO4, CNF ou CNC levou a um decréscimo da proliferação celular, verificando-se efeitos citotóxicos positivos para esses NMs. Quanto a efeitos genotóxicos, avaliados pelo ensaio do MN, os resultados revelaram aumento significativo de frequência de células micronucleadas após exposição a CNF, assim como à concentração mais baixa de BaSO4. Os NMs de CeO2 e SiO2 não revelaram ser genotóxicos. O conhecimento gerado através deste trabalho contribuirá para o conjunto de dados produzidos através do uso do ensaio do MN in vitro para a avaliação da genotoxicidade dos NMs. Os resultados obtidos para os diversos NMs avaliados sugerem que o protocolo utilizado para o ensaio de MN permitiu distinguir efeitos diferenciais quanto à sua genotoxicidade. Além disso, os resultados gerados contribuirão para a avaliação de segurança dos NMs em estudo, contribuindo assim para sua aplicação segura na indústria, produtos de consumo e nanoteranósticos. Uma futura comparação interlaboratorial permitirá avaliar a reprodutibilidade e adequação do ensaio, considerando as características físico-químicas dos NMs em teste, e o uso de protocolos padronizados melhorará a comparação dos resultados.
Os nanomateriais (NMs) apresentam características físico-químicas únicas que os tornam ideais para várias aplicações em inúmeras áreas. Com o incremento do uso de NMs em algumas indústrias e produtos de consumo, entre outros, a exposição humana e ambiental a essas substâncias tem aumentado cada vez mais, sendo necessários mais estudos para compreender os potenciais perigos associados a essa exposição. Atualmente, o ensaio do micronúcleo (MN) é um dos testes mais utilizados na avaliação da genotoxicidade de substâncias sendo considerado mais vantajoso quando comparado com outros testes similares. Mesmo sendo um teste apropriado, a comparação dos resultados do ensaio MN é difícil devido aos resultados inconsistentes reportados. Assim, há a necessidade de desenvolver protocolos harmonizados e selecionar as linhas celulares mais sensíveis, dadas as particularidades dessas substâncias, a fim de validar técnicas como esta. Este trabalho, que se insere num estudo internacional mais amplo envolvendo comparações interlaboratoriais, tem como objetivo otimizar o ensaio do micronúcleo in vitro de forma a obter um ensaio mais sensível e fiável para a avaliação da genotoxicidade dos NMs em linhas celulares de mamíferos. Foi avaliada a toxicidade de NMs, nomeadamente, dióxido de cério (CeO2), sulfato de bário (BaSO4), sílica (SiO2), celulose nanofibrilada (CNF) e celulose nanocristalina (CNC), todos eles com aplicações variadas na indústria e produtos de consumo Fibroblastos de pulmão de hamster chinês (células V79) foram expostos a diferentes concentrações de cada NM durante 1 ciclo celular (17 horas) para avaliação da citotoxicidade através do ensaio MTT e por 4 dias através do ensaio clonogénico. A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do MN após exposição durante 17 horas às mesmas concentrações dos NMs. Os resultados mostraram uma diminuição significativa da viabilidade celular após exposição ao BaSO4 nas concentrações mais elevadas (64, 128 e 256 μg/mL). A exposição por 4 dias a BaSO4, CNF ou CNC levou a um decréscimo da proliferação celular, verificando-se efeitos citotóxicos positivos para esses NMs. Quanto a efeitos genotóxicos, avaliados pelo ensaio do MN, os resultados revelaram aumento significativo de frequência de células micronucleadas após exposição a CNF, assim como à concentração mais baixa de BaSO4. Os NMs de CeO2 e SiO2 não revelaram ser genotóxicos. O conhecimento gerado através deste trabalho contribuirá para o conjunto de dados produzidos através do uso do ensaio do MN in vitro para a avaliação da genotoxicidade dos NMs. Os resultados obtidos para os diversos NMs avaliados sugerem que o protocolo utilizado para o ensaio de MN permitiu distinguir efeitos diferenciais quanto à sua genotoxicidade. Além disso, os resultados gerados contribuirão para a avaliação de segurança dos NMs em estudo, contribuindo assim para sua aplicação segura na indústria, produtos de consumo e nanoteranósticos. Uma futura comparação interlaboratorial permitirá avaliar a reprodutibilidade e adequação do ensaio, considerando as características físico-químicas dos NMs em teste, e o uso de protocolos padronizados melhorará a comparação dos resultados.
Description
Orientadora: Maria João Silva (INSA)
Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2021
Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2021
Keywords
Environmental Genotoxicity Nanomaterials Nanotoxicology Cytotoxicity V79 Cell Line Micronucleus Assay Nanomateriais Citotoxicidade Genotoxicidade Ensaio do Micronúcleo Células V79 Genotoxicidade Ambiental