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A importância do uso de métodos complementares para a avaliação da toxicidade de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

Publication . Morgado, Patrícia I.; Jordão, Luísa

Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs) e seus derivados Halogenados (HHAPs) são conhecidos como um conjunto de contaminantes ambientais, classificados como potencialmente tóxicos, mutagénicos e carcinogénicos, sendo um assunto de extrema importância e preocupação para a saúde pública. Diversos estudos têm reportado o potencial efeito tóxico destes compostos após longos períodos de exposição, pelo uso de métodos colorimétricos como o ensaio de brometo de 3-[4,5- dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e vermelho neutro. Contudo, apesar de estes métodos clássicos de avaliação da citotoxicidade in vitro permitirem, de forma rápida, identificar as propriedades nocivas dos compostos, não permitem compreender os mecanismos moleculares subjacentes responsáveis pela sua toxicidade. Deste modo, no presente estudo, para avaliar os efeitos à exposição aos compostos Pireno (Pir) e seu derivado resultante da desinfeção de águas por bromação, 1-BromoPireno (1-BrPir), foram utilizados outros métodos complementares como avaliação do stress oxidativo e vários fenómenos associados à morte celular programada. Os resultados obtidos comprovam não só a existência de efeitos citotóxicos dos poluentes quando acumulados, como também possíveis efeitos genotóxicos. Assim, pelos métodos complementares, foi possível a identificação de alvos moleculares passiveis de ação farmacológica, o que pode constituir o primeiro passo para o desenho de estratégias terapêuticas que visem prevenir ou tratar os danos provocados por estes poluentes no Homem.

2016-07Journal article

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Classic and new approaches to evaluate risk assessment for public health related to exposure to Halogenated Polycyclic Aromatic Hydrocarbons present in ludic waters

Publication . Morgado, Patricia I.; Jordão, Luisa

Risk assessment for public health related to exposure to Halogenated Polycyclic Aromatic Hydrocarbons present in ludic waters

2016-06-30Conference object

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Decephring the toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons in HepG2 cell line

Publication . Morgado, Patrícia I.; Jordao, Luisa

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are persistent pollutants present in the environment with known mutagenic and carcinogenic properties. In the present study the effect of exposure to single or multiple doses of benzo[a]anthracene (BaA), pyrene (Pyr) and three HPAHs (1-ClPyr; 1-BrPyr and 7-ClBaA) were evaluated in a liver-derived human cell line (HepG2). Cytotoxicity as accessed by the classic MTT and neutral red showed a mild toxic effect in response to single or multiple dose exposure for up to 72h; except for multiple dose exposure to BaA and 7-ClBaA (cumulative concentration of 4 µM) and single exposure to 10 µM BaA. Furthermore, a selective mitochondrial and lysosomal toxicity was observed for Pyr and BaA series, respectively. In order to understand the underlying molecular mechanisms responsible for this effect, ROS production, mitochondrial membrane depolarization, lysosomal pH, DNA fragmentation and apoptosis mediators were evaluated after exposure to single PAHs doses. All compounds were able to trigger oxidative stress after 24h as measured by catalase activity and a good correlation was found between mitochondrial membrane depolarization, lysosomal pH increase and MTT and neutral red assays, respectively. The evaluation of cell death mediators showed that caspase-3/7 but not anexin-V pathways were involved in toxicity triggered by the studied compounds. In conclusion, the studied PAHs, especially 1-BrPyr and BaA, exhibit cytotoxic effects when accumulated, and may have adverse effects to humans after long periods of exposure.

2017-05-08Conference object

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Integration of cellular and molecular endpoints to assess the toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons in HepG2 cell line

Publication . Morgado, Patrícia I.; Jose, Sílvia; Wanke, Riccardo; Antunes, Alexandra M.M.; Sofia Cardoso, Ana; Jordao, Luisa

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are persistent pollutants present in the environment with known mutagenic and carcinogenic properties. In the present study the effect of exposure to single or multiple doses of benzo[a]anthracene (BaA), pyrene (Pyr) and three halogenated derivatives of these compounds (1-ClPyr; 1-BrPyr and 7-ClBaA) were evaluated in a liver-derived human cell line (HepG2). Cytotoxicity as assessed by the classic MTT and neutral red assays showed a mild toxic effect in response to single or multiple dose exposure for up to 72h; except for multiple dose exposure to BaA and 7-ClBaA (1μM per day during 4 days) and single exposure to 10 μM BaA. Furthermore, selective mitochondrial and lysosomal toxicity was observed for Pyr and BaA series, respectively. In order to understand the underlying molecular mechanisms responsible for this effect ROS production, mitochondrial membrane depolarization, lysosomal pH, DNA fragmentation, early and late apoptosis mediators were evaluated after exposure to single doses of the compounds. All compounds were able to trigger oxidative stress after 24h as measured by catalase activity and a good correlation was found between mitochondrial membrane depolarization, lysosomal pH increase and MTT and neutral red assays, respectively. The evaluation of cell death mediators showed that caspase-3/7 but not annexin-V pathways were involved in toxicity triggered by the studied compounds. The integration of all results showed that 1-BrPyr and BaA have a higher toxicity potential.

2017-12Journal article

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Estudo da mutação W402X: frequência desta variante da α-L-iduronidase lisossomal na população portuguesa e análise da sua função

Publication . Ribeiro, Diogo Alexandre do Nascimento; Amaral, Olga A.M. Oliveira; Maciel, Patrícia Espinheira de Sá

As Doenças Lisossomais de Sobrecarga (DLSs) são um grupo de doenças metabólicas hereditárias raras. Na população portuguesa, as DLSs têm uma prevalência de aproximadamente 1/4000 nados vivos. A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença autossómica recessiva, que resulta da actividade deficiente da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), e está presente na população portuguesa com uma prevalência de 1.33/100000 nados vivos. Apesar da existência de mais de 100 mutações causais, a mutação W402X é a causa genética mais frequente; a homozigotia para a mutação W402X está associada ao fenótipo clínico mais grave (síndrome de Hurler, MPS IH). Assim, a relevância do estudo desta mutação é evidenciada pelo facto de se tratar de uma mutação pan-europeia relacionada com um fenótipo grave. Tem, inclusivamente, sido sugerido que esta mutação pode ser uma chave essencial para a compreensão da patofisiologia da MPS IH. Surgiram três questões principais que justificaram uma investigação mais aprofundada: qual seria a frequência da mutação W402X na população portuguesa? Existiria um haplótipo comum nos alelos mutados detectados? Seria possível melhorar o fenótipo e, talvez, recuperar parcialmente a função deste mutante, utilizando mecanismos de supressão nonsense? Neste trabalho determinou-se que a frequência alélica da mutação W402X na população portuguesa em geral é de 0,20% (IC: 0,08-0,39), utilizando duas técnicas de genotipagem distintas, PCRRFLP e PCR-dHPLC. Em termos de haplótipos foi encontrada variabilidade nos alelos mutados detectados, o que parece indicar uma grande divergência entre os alelos W402X. Aparentemente o SNP mais frequentemente associado à mutação W402X em portugueses e brasileiros é o Q33H, seria interessante saber se na população irlandesa esta associação também se verifica. Adicionalmente, ao caracterizar funcionalmente a mutação W402X do gene IDUA, comprovou-se que, não só, esta mutação resulta em nonsense mediated decay, mas também que é susceptível a mecanismos de supressão de nonsense com dois compostos distintos, a gentamicina e a cicloheximida (CHX). Face aos resultados obtidos com os diferentes tratamentos, o efeito de supressão da CHX na mutação nonsense W402X do gene IDUA provou ser o mais eficaz. Verificou-se que o aumento de expressão do gene IDUA na linha celular de um doente MPS IH homozigótico para a mutação W402X permitiu atingir níveis semelhantes aos da linha celular controlo não sujeita a tratamento.

2012Master thesis

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