INSA - Teses de doutoramento
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- Assessment of the biological and toxicological effects of silica-based nanoparticles: contribution to grouping of nanomaterialsPublication . Brandão, Maria de Fárima Pinto; Costa, Carla Trindade; Fraga, Sónia; Laffon, Blanca; Sousa da Rocha, Eduardo JorgeOs nanomateriais de sílica amorfa (aSiO2 NM) são cada vez mais utilizados numa vasta gama de aplicações, como biossensores, tintas, cosméticos, aditivos alimentares, sistemas de transporte e entrega de fármacos e material genético, produtos dentários e agentes de bioimagem. Com esta utilização crescente, a exposição humana a estes materiais, particularmente por inalação em ambientes profissionais, também aumentou. O presente trabalho teve como objetivo preencher lacunas de conhecimento existentes ao avaliar sistematicamente a toxicidade de aSiO2 NM em modelos in vitro e in vivo com foco na via inalatória e em como variações de tamanho e química de superfície influenciam a sua citotoxicidade e genotoxicidade ao nível pulmonar. Assim, foram testadas sete variantes de aSiO2 NM, com diferentes tamanhos (7, 15 e 40 nm) e química de superfície (não modificadas ou revestidas com grupos fosfonato, amino e trimetilsilil). Estudos in vitro em células epiteliais alveolares de rato (RLE-6TN) avaliaram os efeitos citotóxicos e genotóxicos de todas as variantes de aSiO2 NM, incluindo alterações na integridade da membrana, atividade metabólica e danos no DNA (quebras de cadeia simples (SSB) e dupla (DSB)) através do ensaio do cometa. As variantes com maior potencial citotóxico e genotóxico (danos no DNA) (SiO2_7, SiO2_15_Unmod (não modificado), SiO2_15_Amino e SiO2_40) foram ainda analisadas quanto aos seus efeitos na progressão do ciclo celular e nos níveis de histona H2AX fosforilada (γ-H2AX), um biomarcador de resposta ao dano no DNA, por citometria de fluxo. Os resultados revelaram que as variantes não revestidas, particularmente as SiO2_7 e SiO2_15_Unmod, induziram efeitos citotóxicos significativos, enquanto as variantes com revestimento demonstraram um menor potencial citotóxico. É interessante notar que, apesar do elevado potencial citotóxico, as variantes SiO2_7, SiO2_15_Unmod, e a variante SiO2_15_Amino não induziram danos significativos no DNA em concentrações não citotóxicas, ao passo que exposição à variante SiO2_40 aumentou significativamente o dano no DNA das células epiteliais alveolares, sem, no entanto, afetar a sua atividade metabólica. Deste modo, a modificação da superfície com grupos hidrofóbicos de organosilanos e, em menor grau, com grupos fosfonatos, parece ser uma estratégia eficaz para atenuar a toxicidade dos aSiO2 NM nas células RLE-6TN. Por outro lado, todas as variantes testadas (SiO2_7, SiO2_15_Unmod, SiO2_15_Amino e SiO2_40) aumentaram significativamente os níveis totais de γ-H2AX. Na concentração mais elevada (28 μg/cm2), a exposição a todos os materiais testados levou a uma diminuição da subpopulação G0/G1, acompanhada de um aumento significativo das subpopulações S e G2/M, exceto no caso da variante SiO2_40, que não afetou a progressão do ciclo celular. Com base nos dados obtidos, as variantes de aSiO2 NM podem ser classificadas quanto ao seu potencial genotóxico de dano no DNA da seguinte forma: SiO2_7 = SiO2_15_Unmod = SiO2_40 > SiO2_15_Amino. Foi realizado um estudo in vivo onde as variantes com maior toxicidade in vitro (SiO2_7, SiO2_15_Unmod, SiO2_15_Amino e SiO2_40), foram administradas por instilação intratraqueal no rato, para avaliação dos danos primários e oxidativos no DNA e das alterações da expressão génica no tecido pulmonar. Além disso, foi efetuado um estudo de inalação a curto prazo (STIS) no rato, com a variante de menor tamanho (SiO2_7) e com o TiO2-NM105 como NM de referência. Nos estudos de instilação, o SiO2_7 ou o SiO2_40 causaram lesões oxidativas significativas no DNA, embora estas não tenham sido observadas nos grupos de recuperação, o que sugere que estas lesões tenham sido reparadas. No STIS, detetámos um aumento significativo das quebras de cadeia de DNA no tecido pulmonar de animais expostos a 0,5 mg/m³ de SiO2_7 ou 50 mg/m3 de TiO2_NM105, em ambos os grupos (grupo exposto e grupo de recuperação). As alterações observadas na expressão génica sugerem que as vias do stress oxidativo e/ou inflamatórias estão provavelmente envolvidas na indução dos danos oxidativos no DNA observados. De um modo geral, in vivo não se detetou uma toxicidade significativa dos aSiO2 NM testados quer no estudo de instilação intratraqueal, quer no STIS. Os efeitos genotóxicos da variante SiO2_7, foram concordantes em ambos os estudos in vivo realizados, no entanto, as alterações observadas nos animais do STIS foram mais permanentes, mais difíceis de reverter. Os resultados dos estudos in vivo alinharam-se com os resultados dos estudos in vitro, indicando que a via de síntese desempenha um papel na determinação do modo de ação (MoA) do SiO2 NM, com as variantes pirogénicas (SiO2_7 e SiO2_40) a causarem maior toxicidade do que as variantes sintetizadas por precipitação (SiO2_15_Unmod e SiO2 _15_Amino). Consequentemente, as células RLE-6TN parecem ser um modelo preditivo da toxicidade pulmonar in vivo dos SiO2 NM. Os nossos resultados contribuíram para o desenvolvimento de uma estratégia de agrupamento de nanomateriais de engenharia (ENM) no âmbito do projeto NanoToxClass, baseada na abordagem DF4nanoGrouping, com objetivo de agilizar o processo de avaliação de risco dos nanomateriais. Esta classificação sistemática revelou que o revestimento da superfície e a via de síntese influenciam significativamente o MoA dos aSiO2 NM de, revelando que as variantes pirogénicas são mais ativas do que as variantes sintetizadas por precipitação, enquanto as variantes revestidas apresentam uma menor toxicidade comparativamente às não revestidas. Além disso, os nossos resultados apoiam a utilidade de abordagens multiparamétricas para melhorar a compreensão do MoA dos ENM e a previsão do seu perigo. Eles salientam também o potencial destas abordagens e estratégias de agrupamento para se alinharem com os 3R (Substituição, Redução e Refinamento), reduzindo a necessidade de testes in vivo e promovendo um desenvolvimento de ENM seguros por conceção (safe-by-design). Por último, o presente trabalho sublinha a necessidade de protocolos rápidos, robustos e reprodutíveis para a avaliação dos perigos dos ENM, defendendo a adaptação dos ensaios clássicos de genotoxicidade e a utilização de técnicas de elevado rendimento. Estes conhecimentos são cruciais para o avanço da nanotoxicologia, promovendo a conceção segura de ENM e facilitando o desenvolvimento eficiente de produtos com recurso à nanotecnologia novos e sustentáveis.