DPSPDNT - Teses de doutoramento
Permanent URI for this collection
Browse
Browsing DPSPDNT - Teses de doutoramento by Title
Now showing 1 - 9 of 9
Results Per Page
Sort Options
- Base genética da hipercolesterolemia familiarPublication . dos Santos Alves, Ana Catarina; Bourbon, Mafalda; Farinha, Carlos[PT] A Hipercolesterolemia Familiar (FH) é uma doença autossómica dominante caracterizada clinicamente por um aumento dos níveis de colesterol LDL no plasma, conduzindo à sua acumulação principalmente nos tendões (xantomas tendinosos) e nas artérias. Devido à acumulação de lípidos nas artérias, estes indivíduos desenvolvem aterosclerose muito cedo, tendo eventos cardiovasculares prematuramente. A FH apresenta uma frequência de 1/500, na forma heterozigótica, na maioria das populações europeias. Em Portugal estima-se que existam cerca de 20 000 casos de FH. A identificação clínica da FH é possível, mas apenas o diagnóstico molecular da FH permite a correta identificação da doença, fundamentando a instituição de terapêutica farmacológica mais agressiva e/ou precoce, com a consequente redução do risco cardiovascular nos indivíduos afetados. Geneticamente esta patologia caracteriza-se por mutações em três genes: LDLR, APOB e PCSK9. No entanto, a percentagem de indivíduos identificados molecularmente situa-se entre 30-80% dependendo da população estudada, uma vez que em Portugal apenas 40% dos doentes com diagnóstico clínico de FH apresentam uma mutação causadora de doença num dos três genes associados à FH. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF) tem como objetivos a realização de um estudo epidemiológico para a determinação da prevalência e distribuição da FH em Portugal, tendo implementado o estudo molecular desta doença. Para tal, a caracterização funcional de alterações encontradas em genes associados à FH é de extrema importância pois permite obter um diagnóstico definitivo de FH. O objetivo deste trabalho doutoral era identificar e caracterizar a causa genética da hipercolesterolemia em famílias sem mutação identificável nos genes LDLR e APOB pelas metodologias usualmente utilizadas. A primeira parte do presente foi dedicada à reorganização do diagnóstico molecular da FH e à pesquisa de mutações num novo gene – PCSK9 –, à pesquisa de grandes rearranjos através da técnica de MLPA, bem como ao estudo dos genes APOB e LDLRAP1 através de duas abordagens diferentes da técnica de pirosequenciação. No total foram estudados no EPHF 642 casos índex (CI) (250 crianças e 392 adultos), tendo sido identificada uma alteração em 294 indivíduos. A reorganização do EPHF permitiu identificar 6 grandes rearranjos através da técnica de MLPA, identificando deste modo mais 19 indivíduos e 4 alterações no gene PCSK9 em 5 CI. Através da técnica de pirosequenciação, identificaram-se 10 novas alterações potencialmente patogénicas no gene APOB em 10 indivíduos e 4 alterações no gene LDLRAP1 em 4 CI. A segunda parte do trabalho incluído nesta tese centrou-se na análise funcional de alterações cuja patogenicidade era desconhecida, uma vez que dos 294 CI com uma alteração apenas 192 CI apresentam uma mutação comprovadamente patogénica. Desta forma, foram analisadas funcionalmente para o gene LDLR 11 alterações de splicing, uma alteração no promotor e 4 alterações pontuais. Verificou-se que 8 alterações de splicing e 3 alterações missense eram patogénicas, e que 3 alterações de splicing e 1 alteração missense não originavam doença. No gene APOB foram estudadas funcionalmente 4 alterações, das quais apenas 2 destas são patogénicas. Estas mutações foram as primeiras descritas fora da região consensus de ligação do ligando ao LDLR postulada anteriormente. Na impossibilidade da caracterização funcional de todas as alterações cujo estudo não tinha sido realizado, foi desenvolvida uma classificação com base em 6 programas bioinformáticos para as alterações missense e 3 programas para as alterações de splicing. Com base nesta classificação, identificaram-se 435 CI (175 CI e 260 familiares) com diagnóstico definitivo de FH, e 196 indivíduos (116 CI e 80 familiares) apresentavam um diagnóstico provável, 79 um diagnóstico possível e 46 neutro. Verificou-se que 594 indivíduos apresentavam uma alteração no gene LDLR, 30 indivíduos têm uma alteração no gene APOB e 7 indivíduos no gene PCSK9. A terceira parte deste trabalho doutoral teve como objetivo correlacionar o genótipo vs com o fenótipo de todos os CI referenciados ao EPHF, tendo por base os diferentes diagnósticos moleculares que foram obtidos através da classificação das alterações com e sem estudos funcionais. A comparação dos fenótipos apresentados por crianças e adultos com diferentes tipos de mutação revelou que, embora em idade pediátrica o fenótipo não dependa do tipo de mutação, na idade adulta já existe uma clara diferença de fenótipos entre portadores de mutações nulas e missense. Esta observação reforça a importância do diagnóstico molecular precoce de modo a estratificar o risco cardiovascular no grupo pediátrico, uma vez que as crianças com mutações nulas apresentam um maior risco cardiovascular, necessitando por isso de um aconselhamento especializado e implementação ainda mais precoce de terapêuticas hipolipemiantes. A última parte deste trabalho focou-se na realização do estudo de sequenciação de exoma a 5 CI com diagnóstico clínico de FH, mas sem uma mutação identificada num dos 3 genes associados à FH. Uma vez que a sequenciação de exoma origina uma quantidade elevada de dados por amostra, de modo a restringir a análise, foi realizada uma seleção de 49 genes associados ao metabolismo lipídico, tendo-se verificado a existência de 20 alterações distribuídas por 17 genes. Através deste estudo, identificaram-se 2 alterações no gene FLT1 em 2 CI não relacionados e 1 alteração no gene SORT1 noutro CI que cossegregam com a hipercolesterolemia na família. Os estudos funcionais das alterações encontradas nestes genes serão importantes para classificar as mesmas quanto à sua patogenicidade. No caso de se comprovar que alguma destas alterações é funcional, esta será a primeira evidência de um quarto gene associado a FH. Uma vez que a FH se encontra sub-diagnosticada em Portugal, o diagnóstico e aconselhamento genético da FH são importantes para a correta perceção e prevenção do risco familiar de DCV. Nas crianças e adolescentes, o diagnóstico genético é ainda mais importante, uma vez que se sabe que o risco cardiovascular é elevado, mas evitável, se medidas preventivas forem colocadas em prática. O futuro passa pela prevenção, em vez da resolução tardia das complicações cardiovasculares inerentes a esta patologia.
- Biochemical and molecular characterisation of the dyslipidaemia in PortugalPublication . Costa, Cibelle Neiva Cavalcanti Mariano da; Bourbon, Mafalda; Antunes, MaríliaABSTRACT: Dyslipidaemia is one of the major modifiable independent risk factors for cardiovascular disease (CVD), with both genetic and environmental determinants. Although genetic risk factors are considered as non-modifiable, their CVD-associated risk can be prevented if early identified. The correct and early identification of dyslipidaemia is important for a better patient management and could definitely contribute to CVD prevention. This thesis intended the most complete characterisation of the dyslipidaemia in the Portuguese population, both biochemically and molecularly. Reference values based on population-specific percentiles for lipid and lipoprotein biomarkers were provided for the first time in the Portuguese population, namely total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), triglycerides (TG), apolipoprotein A1 (apoA1), apolipoprotein B (apoB), small, dense LDL-C (sdLDL-C), lipoprotein(a) [Lp(a)], as well apoB/apoA1 and sdLDL-C/LDL-C ratios, and non-HDL-C and remnant cholesterol. To our knowledge, the sdLDL-C percentiles were the first to be established in an European population. The percentiles were estimated through a rigorous methodology and compared with other population percentiles by a very visual and feasible method, showing relevant differences. These newly determined reference values for lipid biomarkers were then used to characterise the dyslipidaemia in our population, and can now be used in the clinic for a better patient care and management. More than cholesterol per se, our study highlighted apoB and sdLDL-C as important biomarkers to be used in dyslipidaemia evaluation. Individuals presenting extreme phenotypes were further investigated to assess possible monogenic causes, and three individuals were found to have familial hypercholesterolemia (FH), the most common genetic dyslipidaemia and one of the most common disorders that confer an increased cardiovascular risk. Finally, in an attempt to explore the causes for the FH phenotype, a polygenic risk score was validated for the first time in the Portuguese population. A total of 289 index cases were identified with monogenic FH and other causes for their dyslipidaemia, and also 100 were identified with polygenic hypercholesterolaemia, representing 53.21% of the cohort. From the monogenic causes, 91.35% have a mutation in LDLR, 4.84% in APOB, 1.04% in PCSK9 and 2.08% had mutations in phenocopies genes (LIPA, APOE, ALB), suggesting that all those monogenic and polygenic causes should be always investigated for a better patient identification. This study provided the most complete characterisation of the dyslipidaemia in the Portuguese population, and important evidences for dyslipidaemia evaluation has been produced. The results obtained have application, not only for Portugal or a south European populations, but also might have an worldwide utility for the dyslipidaemia assessment. Together, the results obtained provide useful information on an important cardiovascular risk factor and should help to tackle and identify at risk situations that need urgent measures.
- Development and Validation of Screening Methods Applied to Familial Hypercholesterolemia DiagnosisPublication . Albuquerque, João; Antunes, Marília; Antunes, Marília; Bourbon, Mafalda; Soares, RaquelFamilial hypercholesterolemia (FH) is an inherited disorder of lipid metabolism, characterized by increased low density lipoprotein cholesterol (LDLc) levels. If untreated, the severe dyslipidemia from birth leads to the early development of atherosclerosis, representing a major risk factor for cardiovascular disease (CVD). The early diagnosis of FH is associated with a signi cant reduction in CVD risk, supporting the introduction of risk mitigation strategies, such as cascade screening of rst degree relatives, and adequate lipid lowering therapy (LLT) as precociously as possible. The importance of genetic testing is emphasized by evidence that individuals with a con rmed pathogenic variant possess a signi cant increase in the risk of CVD when compared to subjects with FH-like phenotype for whom a causative variant is not detected. Nevertheless, molecular testing is still not available as a rst line diagnosis tool, and previous selection and strati cation of subjects to undergo this procedure should be made. Currently used clinical criteria, typically based on LDLc levels, family history of hypercholesterolemia and/ or premature CVD and presence of physical signs like tendon xanthomas, present the limitation of retaining a high number of false positive cases. This may constitute a heavy burden in terms of healthcare costs, and limits the access to the genetic study of a larger universe of true FH cases. The main purpose of this work was to develop alternative classi cation methods for FH diagnosis, based on di erent biochemical and clinical indicators, with improved ability to screen for FH cases in comparison to traditional clinical criteria. The metrics used for comparison range from the areas under the receiver operating characteristics (AUROC) and precision-recall (AUPRC) curves, to several operating characteristics (OC), to agreement tests, among others
- Gene-environment interactions in Autism Spectrum Disorder (ASD)Publication . Santos, João Xavier; Vicente, Astrid Moura; Nunes, AnaAutism Spectrum Disorder (ASD) is a heterogeneous neurodevelopmental disorder characterized by deficits in social communication and interaction and repetitive and restricted behaviors. While heritability estimates support a role for gene-environment interactions in ASD etiology, there is a paucity of strategies that integrate both components. The objective of this work was to identify gene-environment interactions involved in ASD risk. Through a systematic literature review we identified neurotoxic xenobiotics previously implicated in ASD, including air pollutants and endocrine disruptors. Using a school-based screening strategy we provide an updated prevalence estimate for 7-9 years old children from Centro Region of Portugal, of 0.5% (95% CI: 0.3-0.7). Leveraging public air quality monitoring data we estimated early-life exposure to criteria air pollutants in 217 ASD-subjects, and show that exposure to particulate matter during critical neurodevelopmental windows is associated with a higher clinical severity of ASD. In silico inspection of large genetic datasets (N=6224) showed that ASD-subjects carry predicted-damaging variants in a panel of 77 genes involved in the regulation of detoxification and physiological barriers (blood-brain barrier and placenta) permeability (XenoReg genes). Database query indicates that these genes interact with ASD implicated xenobiotics. Through biochemical analyses of neonatal dried blood spots and the piloting of an early-life exposures assessment questionnaire we retrospectively collected environmental data for 70 ASD-children. The integration of environmental and sequencing data revealed a group of 13 patients for whom gene-environment interactions likely contributed to disease etiology. We present evidence that genetically-susceptible subjects might be at higher risk of ASD due to an increased vulnerability to early-life exposures. Possible underlying neuropathological mechanisms, including neuroinflammation, oxidative stress, endocrine disruption and epigenetics, warrant experimental validation. This work reinforces the need for clinical stratification and for monitoring early-life exposures, providing knowledge that, prospectively, may be translated to personalized medicine strategies applied in clinical practice.
- Genetic factors involved in stroke susceptibility and in outcome at three monthsPublication . Gomes Pires Manso, Helena Isabel; Vicente, Asdrid Moura; Silva, Pedro João Neves eStroke is a significant cause of death and disability in developed countries. It is a multifactorial disease, resulting from the interplay between genes and well-known lifestyle/environmental risk factors. Numerous studies have attempted to identify the genetic risk factors predisposing to stroke, but few have investigated the genetic factors involved in stroke outcome. This work aimed at the identification of genes contributing to stroke and influencing patient’s outcome after three months. Four inflammatory genes (IL1B, IL6, MPO and TNF) and two genes involved in the nitric oxide metabolism (NOS1 and NOS3) were tested for association with stroke. The results suggest that the IL6 and MPO influence stroke susceptibility through independent effects and non-additive interactions. Furthermore, they provided novel evidence for the involvement of the NOS1 gene in stroke susceptibility. Several studies have shown the important impact of inflammation, oxidative stress, neurogenesis, angiogenesis and matrix metalloproteinases in stroke-associated brain damage and/or stroke recovery. Association analyses were thus carried out to assess the role of candidate genes involved in inflammatory processes (IL1B, IL6, MPO and TNF) and oxidative stress (NOS1 and NOS3), as well as matrix metalloproteinase genes (MMP2 and MMP9) and growth factor genes (BDNF, FGF2 and VEGFA) in patient’s outcome at three months. MMP2 genetic variants were found associated with patient’s outcome, and the results also indicate that two epistatic interactions between the BDNF and FGF2 genes and between the FGF2 and VEGFA genes influence this phenotype. A genome-wide association study was performed in stroke outcome using DNA pooled samples, to provide novel insights into the mechanisms involved in stroke recovery. The BBS9 and GLIS3 genes were found associated with patient’s outcome at three months. Taken together, these results suggest that stroke susceptibility and outcome are modulated by a combination of main gene effects and gene-gene interactions, independently of stroke risk factors and/or severity parameters, highlighting the complexity of mechanisms predisposing to stroke and influencing recovery afterwards.
- Iron homeostasis in immune mononuclear cells: a potential role in atherogenesisPublication . Marques, Liliana Alves da Silva; Costa, Luciana Maria Gonçalves da; Canonne-Hergaux, François; Zilhão, Rita Maria Pulido Garcia[PT] A aterosclerose (AT) é uma doença inflamatória caracterizada pela formação de lesões designadas “placas ateroscleróticas” na parede de vasos sanguíneos. A formação destas lesões tem início na disfunção endotelial decorrente da ação de vários fatores de risco e que resulta na acumulação e modificação de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (nomeadamente LDL oxidado (oxLDL)). A acumulação subendotelial de oxLDL promove a ativação das células endoteliais e o consequente recrutamento de células imunitárias, incluindo monócitos e linfócitos do sangue periférico. Os monócitos infiltrados diferenciam-se em macrófagos que, por ingestão de oxLDL, acumulam lípidos no seu interior e se diferenciam nas chamadas “células esponjosas” (do inglês “foam cells”), que são características das placas ateroscleróticas. Vários autores observaram a acumulação de ferro em placas ateroscleróticas, frequentemente associada a “células esponjosas” derivadas de macrófagos. Em 1981, Sullivan propôs a chamada “hipótese do ferro” na qual o nível de ferro armazenado no organismo poderia constituir um fator de risco no desenvolvimento e progressão da AT. De acordo com esta hipótese, a reduzida frequência de desenvolvimento de AT em doentes com hemocromatose hereditária – caracterizados por macrófagos deficientes em ferro apesar da elevada sobrecarga de ferro sistémica – sugere que a retenção de ferro no macrófago promovida pela hepcidina (Hepc) poderá constituir um mecanismo pró-aterogénico crucial na possível associação do ferro à aterogénese. De facto, estudos recentes indicam que a Hepc pode desempenhar um papel pró-aterogénico e que a promoção da saída de ferro mediada pela ferroportina-1 (Fpn1) poderá constituir um mecanismo de resistência do macrófago à diferenciação em “células esponjosas”. Por outro lado, e apesar do seu potencial papel como ferroxidase envolvida na saída de ferro em macrófagos, a ceruloplasmina (Cp) é também capaz de oxidar outros substratos tais como as partículas de LDL. Adicionalmente, visto que a sua expressão é fortemente induzida em condições pró-inflamatórias, a Cp tem sido proposta como um potencial fator pró-aterogénico. Neste contexto, o principal objetivo do presente estudo foi clarificar a regulação da expressão de proteínas envolvidas no metabolismo do ferro nas células imunitárias que infiltram as placas ateroscleróticas, com particular interesse na proteína exportadora de ferro Fpn1 e na Cp como sua potencial parceira neste processo. Numa primeira fase, o objetivo do estudo foi caracterizar a expressão das duas isoformas da Cp em linfócitos, monócitos e macrófagos bem como avaliar o seu potencial envolvimento como ferroxidase na saída de ferro no macrófago mediada pela Fpn1. Os resultados obtidos demostraram que, para além da isoforma solúvel da Cp (sCp) já descrita em outros estudos, os linfócitos, monócitos e macrófagos expressam também uma isoforma membranar desta proteína. A diminuição da expressão da Cp membranar após o tratamento com PIPLC – uma enzima que corta especificamente proteínas com âncoras GPI – demonstrou que pelo menos parte da Cp associada à membrana corresponde à isoforma GPI-Cp nestas células. Adicionalmente, os resultados obtidos pelo nosso grupo de investigação permitiram concluir que a regulação da expressão da Cp em células imunitárias varia de acordo com o tipo de célula, com o seu estado de ativação e inclusivé com o tipo de isoforma. De facto, neste estudo observou-se que condições de stress oxidativo promoveram a diminuição do nível de mRNA de ambas as isoformas da Cp, ao passo que condições pró-inflamatórias induziram o aumento significativo e exclusivo do nível de mRNA da isoforma solúvel (sCp). A expressão da Cp nas células imunitárias que se encontram envolvidas na formação e desenvolvimento das placas ateroscleróticas (monócitos/macrófagos e linfócitos) pode constituir uma fonte de Cp na placa e, consequentemente, um mecanismo adicional para a oxidação de partículas de LDL em condições pró-inflamatórias, o que é corroborado pela co-localização da Cp e oxLDL anteriormente descrita em áreas pró-ateroscleróticas na parede do vaso. Efetivamente, a hipótese da Cp constituir um fator pró-aterogénico é apoiada por vários estudos que observaram uma associação entre o elevado nível de Cp sérica e o risco de desenvolvimento da AT. Contudo, a expressão da Cp em células imunitárias pode estar também associada ao efluxo de ferro nestas células. Estudos recentes demonstraram que após estimulação com ferro, a expressão de Fpn1 em macrófagos aumenta significativamente em macrófagos, sendo recrutada para a membrana plasmática, onde se encontra enriquecida em microdomínios denominados de “jangadas lipídicas” (do inglês “lipid rafts”). Neste estudo, o padrão pontilhado da distribuição da Cp observado à superfície celular de monócitos, macrófagos e hepatócitos imortalizados (HepG2) é indicativo de que esta proteína se encontra concentrada em domínios membranares. Os resultados obtidos confirmaram que parte da Cp expressa em macrófagos bem como em células HepG2 se encontra localizada nas “jangadas lipídicas” e demonstraram ainda uma co-localização parcial entre a GPI-Cp e a Fpn1 em macrófagos estimulados com uma elevada concentração de ferro, o que sugere que a Cp poderá participar como ferroxidase no efluxo de ferro mediado pela Fpn1. Contudo, dado o caráter parcial da co-localização da GPI-Cp e Fpn1, é possível que a sCp ou uma outra ferroxidase possam estar também envolvidas no transporte de ferro pela Fpn1 em macrófagos estimulados com sobrecarga de ferro. Um estudo recente sugere que a proteína precursora do péptido β-amilóide (APP) poderá estar envolvida no efluxo de ferro mediado pela Fpn1 em neurónios, o que é corroborado pela acumulação de ferro nestas células em ratinhos App-/-. Os resultados aqui apresentados confirmaram a expressão da APP em macrófagos e demonstraram que condições de elevada concentração de ferro promovem o aumento da expressão da APP bem como a sua co-localização com a Fpn1 nas “jangadas lipídicas”. Estes resultados estão de acordo com a hipótese de que a APP possa colaborar com a Fpn1 no efluxo de ferro em macrófagos estimulados com sobrecarga de ferro. Deste modo, é proposto um modelo no qual ambas as isoformas da Cp bem como a APP poderão estar envolvidas no efluxo de ferro mediado pela Fpn1 em macrófagos, podendo apresentar papéis sobrepostos mas também complementares. Numa segunda fase, propusemo-nos a clarificar o efeito da presença das partículas de oxLDL na expressão de algumas proteínas-chave no metabolismo do ferro em macrófagos. Os nossos resultados demonstraram que a estimulação de macrófagos com oxLDL levou à polarização do fenótipo Mox descrito por Kadl et al, bem como à acumulação intracelular de lípidos. A análise da expressão génica revelou que a exposição às partículas de oxLDL promoveu o aumento significativo da transcrição da heme oxigenase-1 (HO-1, gene Hmox1) e da Fpn1. Este aumento da transcrição de Hmox1 e Fpn1 não foi observado na presença de partículas de LDL nativo ou acetilado, o que sugere que este efeito é específico da modificação oxidativa das partículas de LDL. Tratamento de macrófagos Nrf2-/- e Nrf2+/+ com oxLDL mostrou que o aumento do nível de mRNA da Hmox1 e da Fpn1 induzido por oxLDL é mediado, pelo menos em parte, pelo fator de transcrição Nrf2. A exposição dos macrófagos a oxLDL conduziu ainda ao aumento significativo da transcrição da Hamp1 (gene da Hepc), interleucina-6 (IL-6, gene Il6) e da cadeia pesada da ferritina (H-Ft, gene Fth1), bem como a diminuição significativa da transcrição de ambas as isoformas da Cp. Contudo, e ao contrário do observado na HO-1, o aumento significativo do nível de mRNA da Fpn1 induzido por oxLDL não foi traduzido num aumento significativo a nível proteico. Este resultado sugere que a síntese da Fpn1 se encontra limitada no fenótipo Mox, provavelmente através de um mecanismo de regulação pós-transcricional influenciado pelo nível intracelular de ferro. Estes resultados sugerem ainda que, apesar da forte indução da transcrição da Fpn1, o efluxo de ferro nos macrófagos Mox se mantém provavelmente residual devido ao nível proteico basal da Fpn1. Contudo, como uma consequência a longo prazo da redução da transcrição da Cp e/ou do aumento da Il6 e Hamp1, é possível que o efluxo de ferro possa estar diminuído nos macrófagos Mox. Por outro lado, a estimulação simultânea de macrófagos com oxLDL (ativador do fenótipo Mox) e com lipopolissacarídeo combinado com interferão-γ (LPS/IFNγ, ativadores do fenótipo M1) induziram a diferenciação de um fenótipo misto entre Mox e M1 (Mox/M1), o que demonstrou que o fenótipo Mox não é predominante sobre o fenótipo M1 nestas condições. Os macrófagos Mox/M1 apresentaram acumulação intracelular de lípidos à semelhança dos macrófagos Mox, sendo caracterizados por um aumento significativo da transcrição da Hmox1, Il6, Fth1 e Cp (especificamente a isoforma sCp) e por uma diminuição significativa da transcrição da Fpn1 à semelhança dos macrófagos M1. Estes resultados sugerem que macrófagos expostos a um ambiente rico em oxLDL e em condições pró-inflamatórias como LPS/IFNγ promovem a acumulação intracelular de lípidos e de ferro em conjunto com o aumento da produção de sCp e de citocinas pró-inflamatórias tais como a IL-6, provavelmente contribuindo para a oxidação das partículas de LDL e para a inflamação local, o que poderá ter um papel pró-aterogénico. De acordo com estudos recentes, é o aumento de expressão de Fpn1 que desencadeia um mecanismo que conduz ao transporte reverso de colesterol e consequente resistência ao desenvolvimento de “células esponjosas”. Deste modo, podemos assumir que a expressão basal (Mox) ou diminuída de Fpn1 (M1, Mox/M1) não confere proteção contra a formação das “células esponjosas”, o que é apoiado pelos resultados de elevada acumulação intracelular de lípidos observada em macrófagos Mox e Mox/M1. Concluindo, os resultados apresentados neste estudo estão de acordo com a “hipótese do ferro” proposta por Sullivan e indicam potenciais mecanismos quer para a acumulação de ferro em macrófagos, quer para a oxidação de LDL, ambos favorecendo a diferenciação de “células esponjosas” nas placas ateroscleróticas, o que contribui para o desenvolvimento e instabilidade das lesões e consequentemente para a progressão da AT.
- A systems medicine approach to study Autism Spectrum Disorder based on genomic and clinical dataPublication . Asif, Muhammad; Moura Vicente, Astrid; Moreira Couto, Francisco JoséAutism Spectrum Disorder (ASD) is characterized by highly heterogeneous clinical phenotypes and complex genetic architecture, rendering ASD difficult to diagnose particularly in very young children. While many genetic factors are implicated in ASD, the architecture of genotype/phenotype correlations is still very unclear. This work aimed at delineating ASD etiology by analyzing patient’s genetic and clinical data, and functional annotation data using integrative systems biology approaches. Specifically, the objectives of this thesis were to identify ASD underlying biological mechanisms, disrupted by rare variants in patients, and then to find their associations with the ASD phenotype, as defined by analysis of patient’s clinical outcomes. The significance of the parental phenotype for ASD etiology models was also studied in this work. In the second chapter, to correctly infer biological meaning from a large number of putative disease-causing genetic variants, a systematic functional annotation pipeline, called Functional annotation of Variants (FunVar) was proposed. The developed pipeline was applied to Copy Number Variants (CNVs) from ASD patients. Results showed that rare CNVs spanning brain genes disrupted a wide range of biological processes (N = 98), including nervous system development and protein polyubiquitination. To minimize the misinterpretation of results, 33 highly similar biological process terms were grouped. For this purpose, a semantic similarity measure was employed to assess functional similarity between terms. Most of the identified biological processes dysregulated by rare CNVs disrupting brain genes had previously been implicated in ASD, thus indicating the usefulness of the FunVar pipeline in interpreting the biological role of genetic variants in disease development. To predict the clinical outcome from biological processes defined by rare CNVs in ASD subjects, a novel machine learning-based integrative systems biology approach was developed. Agglomerative Hierarchical Clustering was used to identify ASD phenotypic subgroups from the clinical reports of a large population sample of ASD patients. Analysis of multidimensional clinical data identified two distinct phenotypic clusters that differed in overall adaptive behaviour profiles, verbal status, severity and cognitive abilities, defining a milder and a more severe phenotype. Functional enrichment analysis of rare CNVs targeting brain genes in the same patients, using the FunVar pipeline, identified 15 statistically significant biological processes, generally consistent with reported literature for ASD. Random Forest feature importance analysis showed that all these biological processes contributed positively to the classification of ASD phenotype, as defined by the identified clusters. The top two biological processes (regulation of cellular component organization and cell projection organization), which contributed most in discriminating milder and severe ASD phenotype, were previously implicated in ASD. To predict phenotypic subgroups of patients from biological processes disrupted by rare CNVs in brain genes, a Naive Bayes machine learning classifier was trained and tested on the clustered patient and disrupted biological processes datasets. For a subset of individuals that had higher Gene Ontology (GO) term information content, the Naive Bayes classifier was able to make predictions of the severe clinical outcome from biological processes defined by genetic alterations, with a good precision but low sensitivity. This study showed that genotype-phenotype correlations can be established in ASD and ASD phenotype predictions can be made from biological processes putatively disrupted by brain-gene CNVs. However, improved GO annotations and larger datasets will be needed for generalized predictions that can be translated into the clinics. In chapter 4, to predict novel disease genes a supervised machine learning based approach was developed. The proposed approach first computes GO-based functional similarities among genes, using semantic similarity measures, for any given disease-associated and non-associated genes. Multiple machine learning classifiers can be built on calculated gene’s functional similarities to find hidden associations between disease and non-disease causing genes. The traced hidden associations are then used to predict new disease genes. The developed approach was implemented on known ASD genes, obtain SFARI ASD genes database to predict new ASD genes. Machine learning classifiers trained and tested on calculated ASD gene’s functional similarities outperformed the existing state-of-the-art method. Classifier built on functional similarities of high confidence ASD and non-ASD genes showed an improved performance (over the reported classifier). Moreover, we provided an easy to use workflow of the methodology that was made available to the research community to efficiently identify new disease genes. Finally, in chapter 5, to elucidate the significance of the parental Broad Autism Phenotype (BAP) for ASD etiology models, parental phenotypic profiles, assessed using Social Responsiveness Scale (SRS) and Broad Autism Phenotype Questionnaire (BAPQ), and CNVs inheritance information from ASD children, were investigated. Analysis showed that parents of ASD children from this dataset present BAP traits at lower rates than previously reported, and that mothers and fathers have distinct profiles. There was no correlation between SRS scores from ASD children and their parents. Spousal pairs were weakly correlated on SRS scores, indicating the phenomenon of assortative mating. Lastly, no evidence was found for the transmission of parental BAP traits to their children through CNVs disrupting putative ASD genes. However, putative ASD genes in databases are mainly evidenced by studies focusing on rare variants, including CNVs, which have lower heritability rates. As common variants account for largest proportion of ASD liability, future studies are needed to assess their role in the transmission of the parental BAP. This work developed integrative systems medicine methods to improve the identification of biological processes from genetic variants in a genetically complex, clinically heterogeneous disorder, based on machine learning and semantic similarity analysis. Overall, findings applying these methods indicate that complex genotype-phenotype correlations can be established in ASD. Furthermore, clinical subgroups, defined by clustering patients based on multidimensional clinical profiles can be predicted from the biological characterization of genetic variants. The correct identification of disrupted biological processes, associated with phenotypically distinct subgroups of patients, will be important for early detection and prognosis, which have implications for early intervention and for the discovery of potential therapeutic targets for ASD.
- Tackling the molecular basis of lipid metabolism: from candidate genes testing in a disease cohort to multi-omics approaches in unselected populationsPublication . Rossi, Niccolò; Bourbon, Mafalda; Falchi, MárioDyslipidemia, broadly defined as an unhealthy deviation of plasma lipid levels, is a well-known heritable risk factor for c ardiovascular diseases (CVD), the first cause of death worldwide. Uncovering the genetic basis of p lasma lipids is, therefore, fundamental for CVD prevention and treatment. In this work, I tackled dyslipidemia from two different perspectives, namely genetics of severe dyslipidemia in a disease cohort and multi-omics of plasma lipids variation in unselected populations. First, I aimed to investigate if mutations in genes involved in miscellaneous monogenic dyslipidemia can mimic a Familial Hypercholesterolemia-like phenotype. By knocking-down dyslipidemia genes in cultured cells, I observed that sitosterolemia and hypertriglyceridemia causing genes are negative regulators o f LDL-uptake in vitro. Targeted sequencing of 1 85 FH mutation-negative individuals from the Portuguese FH study and subsequent cascade family screening for c andidate pathogenic variants, highlighted nine variants in ABCG5, ABCG8 and GPD1 co-segregating with the FH-phenotype. Mutations in these three genes, in heterozygosity, were associated with increased plasma LDL-cholesterol (LDL-C) as compared to the normal population (β = +71.38±9.57, +76.11±10.14 and +65.96±8.77 mg/dL, respectively). Rare genetic variants underlying extreme dyslipidemia tend to be conserved across ethnic groups. Instead, the study of rare variations underlying non-monogenic dyslipidemia in multi-ethnic populations remains challenging. Here, I looked for rare single nucleotide variants, individually or in aggregate, associated with plasma LDL-C from whole-genome sequencing data in 1,751 participants f rom the TwinsUK c ohort and replicated my findings in 2,587 individuals from the Qatar Genome Programme. I identified a conserved locus located upstream the KCNJ2 gene associated with LDL-C levels, at both single and aggregate variants levels in the two cohorts, and with myocardial infarction risk in TwinsUK. Loci identified by association studies have the potential to reveal novel genes and pathways involved in dyslipidemia biology. However, individual genes do not work alone, but rather interact with one another and jointly affect human health. I constructed gene co-expression networks based on RNA sequencing data generated from subcutaneous adipose and skin tissues, and lymphoblastoid cell lines from 856 subjects from the TwinsUK cohort. First, by testing the enrichment of co-expression modules for l ipid-related gene ontologies and GWAS hits, I defined a lipid functional gene module. Within this module, the expression level of the long non-coding RNA LINC00263 and transcription factor Srebf1, a key player in adipogenesis, were found to be highly correlated (Pearson’s ρ = 0.62; P = 3.71x10 -81) . In addition, I observed that LINC00263 predicted interactors are specifically expressed in adipocytes and are enriched for lipid-related pathways. Thus, I propose LINC00263 as a novel candidate lipid regulator in subcutaneous adipose tissue. Together, the results presented in this thesis provide new insights into dyslipidemia complex aetiology both at the genomic and transcriptomic level, and improve CVD risk assessment and prevention.
- uORF-mediated translational regulation of PERK: implications for cell homeostasis and human diseasePublication . Fernandes, Rafael; Romão, Luísa; Bourbon, MafaldaUpstream open reading frames (uORFs) are cis-acting elements located within the 5’ leader sequence (or 5’ untranslated region; 5’UTR) of transcripts that can regulate translation of the correspondent main open reading frame (mORF). During basal conditions, uORFs are typically considered to be repressors of downstream translation, as they can impede the ribosomes to access the mORF or even induce mRNA degradation by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. However, during stress conditions, phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) allows the expression of several stress-responsive proteins through uORF-mediated mechanisms, while global mRNA translation is inhibited. During endoplasmic reticulum (ER) stress, for instance, the accumulation of unfolded proteins leads to activation of the ER-resident PKR-like ER kinase (PERK) that phosphorylates eIF2α as part of the stress-protective mechanisms of the unfolded protein response (UPR) and the integrated stress response (ISR). This results in the selective uORF-mediated translation of downstream effectors, like the activating transcription factor 4 (ATF4), the CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) and the growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), which drive stress resolution or, in the case of a prolonged stress, cell death. The dual role of PERK in regulating cell fate has been reported to be involved in the outcome of several human diseases, including diabetes, neurodegenerative disorders and cancer. Moreover, mutations in the EIF2AK3 gene that encodes PERK have been implicated in the development of the rare genetic disease, Wolcott-Rallison Syndrome (WRS). Interestingly, data from ribosome-profiling (Ribo-seq) studies suggested the existence of uORFs within PERK 5’UTR, which could be involved in the regulation of PERK expression. In this work, we aimed to study the translational regulatory role of five AUG- and three non-AUG-uORFs identified in the PERK 5’UTR and assess its impact in cell homeostasis and human disease. While uORF2 and the non-AUG-uORFs 5, 6 and 7 do not seem to have a significant regulatory role, uORF1, uORF3, uORF4 and uORF8 together present a strong repressive effect over mORF translation in basal conditions, possibly by providing a barrier to the scanning ribosomes and precluding translation reinitiation at the mORF, without affecting the PERK mRNA levels. Curiously, we found that when we induce PERK overexpression, it leads to the spontaneous activation of a portion of PERK in the absence of any stress stimulus, possibly highlighting the biological relevance of its uORF-mediated translational regulation in maintaining its physiological basal levels. Conversely, during stress conditions, increased bypass of uORF1 results in a modest degree of translational de-repression, which may help to counterbalance the increased rate of PERK protein turnover observed in these conditions. We also found that alteration of the PERK uORFs by mutations found in WRS patients modify PERK expression, providing a possible link with the disease phenotype. Finally, we tested the impact of PERK unbalanced expression in the viability of HCT116 cells but, at least in our experimental conditions, no differences were found. Altogether, we provide a new example of a transcript containing uORFs that fine-tune mORF translation. Moreover, we highlight the importance of including 5’UTRs, like the one of PERK, in the screening of stress-related mutations and the necessity of functional studies to assess their relevance in the pathogenesis of human diseases. This may provide vital information for the development of new therapeutic strategies.