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- Pesquisa de Fatores de Patogenicidade de Escherichia coli isoladas de Géneros Alimentícios e de Ambientes de Produção AlimentarPublication . Coval, Catarina Pinho; Silva, Gabriela Jorge da; Saraiva, Maria MargaridaEscherichia coli faz parte da microbiota do trato intestinal de organismos de sangue quente. No entanto, algumas estirpes possuem fatores de virulência que afetam processos celulares nos humanos causando doenças do trato gastrointestinal (e extraintestinal). As estirpes enteropatogénicas são classificadas com base nos seus mecanismos de patogenicidade, local e mecanismo de aderência, da seguinte forma: E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli verotoxigénica/produtora de Shiga toxina (VTEC/STEC), entre outras. As estirpes são transmitidas maioritariamente via fecal-oral, através da ingestão de produtos contaminados, água ou alimentos, devido às más práticas agrícolas, e más práticas de higiene e de fabrico na produção e distribuição alimentar. Os métodos fenótipos são frequentemente utilizados para o isolamento e a identificação do patotipo é confirmada por métodos moleculares, através da deteção de genes de virulência específicos. De forma a isolar e detetar estirpes patogénicas de E. coli em alimentos para consumo humano, o principal objetivo deste trabalho foi montar um protocolo para a deteção de fatores de virulência de E. coli patogénicas, que possa ser usado na rotina laboratorial, por PCR convencional e, sempre que possível, em PCR multiplex, que permite num só ensaio detetar simultaneamente vários genes, e consequentemente identificar com maior rapidez a estirpe. O método por PCR é mais rápido, tem menores custos e apresenta alta sensibilidade e especificidade. Propus-me a otimizar as condições da PCR para deteção de 11 genes de virulência de cinco patotipos diferentes:• EAEC: genes pCVD432, astA, aggR e/ou aaiC;• EIEC: gene ipaH;• EPEC: genes eae e/ou bfpA;• ETEC: genes eltB e/ou estA;• VTEC/STEC: genes stx1 e/ou stx2.O isolamento e identificação do patotipo permitirá a análise filogenética e a investigação de surtos, o que poderá permitir estabelecer uma relação entre uma toxinfeção alimentar e o género alimentício que a provocou.O trabalho experimental foi iniciado pela otimização de condições de extração de ADN em estirpes padrão, e posteriormente, nas amostras. O processo de otimização da PCR foi complexo tendo-se feito vários ensaios com variação das condições de PCR, nomeadamente, o tempo de emparelhamento e/ou o tempo da extensão, a temperatura de emparelhamento, a concentração de primers e a concentração de ADN na mistura da PCR, de forma a obter os produtos amplificados esperados. Foi possível otimizar individualmente a PCR para 10 dos 11 genes (dos quais não se conseguiu otimizar as condições para o gene bfpA). Conseguiu-se otimizar uma PCR multiplex para os genes característicos de E. coli verotoxigénica/produtora de Shiga toxina: stx1 e stx2. Das amostras estudadas (n=100), e tendo sido realizadas “pools” de 10 amostras, encontrou-se uma baixa percentagem de genes de virulência e diversidade de patotipos: 6% EAEC e 1% ETEC. O gene mais frequentemente encontrado foi o astA (6%) da EAEC. Todos os genes detetados estavam presentes em alimentos crus ou que podem ter sido adicionados pós-processamento pelos manipuladores de alimentos com as mãos. Apesar dos resultados não serem alarmantes, indicam a presença de patotipos associados a reservatórios humanos em alimentos prontos para consumo e por isso, deve-se continuar a monitorizar a presença de patotipos de E. coli em géneros alimentícios e as suas vias de transmissão de forma a efetivar ações de melhoria que promovam a Segurança Alimentar. Deve-se continuar a alertar a população e, em especial, os manipuladores de alimentos, para os riscos da contaminação de alimentos, principalmente os que serão consumidos crus, com bactérias de origem fecal. Este trabalho poderá contribuir em prol da Saúde Pública visto que a identificação dos diferentes patotipos de E. coli pode contribuir para detetar potenciais reservatórios, fontes de contaminação e vias de transmissão, para além de poder contribuir também para a instituição de medidas de controlo imediatas e para a prevenção, através de vacinas e novos tratamentos, de doenças diarreicas provocadas por E. coli.