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- Suppression of nonsense mutations as a therapeutic approach to treat genetic diseasesPublication . Brito, Francesca; Romão, Luísa; Crespo, Ana[PT] Algumas das mutações que ocorrem em células somáticas ou na linha germinal podem resultar na formação de codões de terminação prematura da tradução (CTPs ou codões nonsense). Um terço das mutações associadas a doenças genéticas resulta na produção de CTPs. Em geral, a introdução dum CTP num transcrito induz a terminação prematura da tradução e a activação do mecanismo de decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense (nonsense-mediated mRNA decay; NMD). O NMD é um mecanismo de controlo de qualidade que impede a produção de proteínas truncadas na extremidade C-terminal tóxicas para a célula. No decorrer dos últimos anos, tem sido desenvolvida uma nova terapia, designada como terapia de supressão, que utiliza compostos de baixo peso molecular para induzir a maquinaria de tradução a alterar um CTP para um codão sense. O objectivo da terapia de supressão é estimular a capacidade de competição de tRNAs aminoacil com o complexo de terminação para a ligação ao CTP no local A do ribossoma, de forma a suprimir especificamente a terminação em CTPs e não em codões de terminação naturais. Embora a talassémia seja uma das doenças genéticas mais comuns e as mutações nonsense no gene da beta-globina (β-globina) estejam muito frequentemente associadas à beta-talassémia (β-talassémia), a utilização da terapia de supressão nestes casos ainda não foi investigada de forma detalhada. Resultados preliminares obtidos pelo nosso laboratório indicam que o aminoglicósido G418 tem a capacidade de suprimir uma mutação nonsense no codão 39 do mRNA da β-globina, em células eritróides em cultura. De forma a confirmar o princípio de que a terapia de supressão pode restaurar os níveis de β-globina, testámos se o composto G418 tem a capacidade de induzir níveis significativos de supressão em células HeLa transfectadas com plasmídeos que contêm o gene da β-globina humana normal (βWT) ou o equivalente com mutação nonsense no codão 39 (β39). Segundo os resultados obtidos, há um ligeiro aumento nos níveis de transcrito β39 o que pode ser indicador de um possível efeito da droga. Como não nos foi possível verificar o efeito da droga nos níveis de proteína é necessário trabalho futuro para avaliar o seu efeito nos níveis de expressão proteica.
- The mutational spectrum of WT1 in male infertilityPublication . Seabra, Catarina M.; Quental, Sofia; Lima, Ana C; Carvalho, Filipa; Gonçalves, João; Fernandes, Susana; Pereira, Iris; Silva, Júlia; Marques, Patrícia I.; Sousa, Mário; Barros, Alberto; Seixas, Susana; Amorim, António; Lopes, Alexandra M.PURPOSE: We evaluated the impact of WT1 mutations in isolated severe spermatogenic impairment in a population of European ancestry. WT1 was first identified as the gene responsible for Wilms tumor. It was later associated with a plethora of clinical phenotypes often accompanied by urogenital defects and male infertility. The recent finding of WT1 missense mutations in Chinese azoospermic males without major gonadal malformations broadened the phenotypic spectrum of WT1 defects and motivated this study. MATERIALS AND METHODS: We analyzed the WT1 coding region in a cohort of 194 Portuguese patients with nonobstructive azoospermia and in 188 with severe oligozoospermia with increased depth for the exons encoding the regulatory region of the protein. We also analyzed a group of 31 infertile males with a clinical history of unilateral or bilateral cryptorchidism and 1 patient with anorchia. RESULTS: We found 2 WT1 missense substitutions at higher frequency in patients than in controls. 1) A novel variant in exon 1 (p.Pro130Leu) that disrupted a mammalian specific polyproline stretch in the self-association domain was more frequent in azoospermia cases (0.27% vs 0.13%, p = 0.549). 2) A rare variant in a conserved residue in close proximity to the first zinc finger (pCys350Arg) was more frequent in severe oligozoospermia cases (0.80% vs 0.13%, p = 0.113). CONCLUSIONS: Results suggest a role for rare WT1 damaging variants in severe spermatogenic failure in populations of European ancestry. Large multicenter studies are needed to fully assess the contribution of WT1 genetic alterations to male infertility in the absence of other disease phenotypes.
- Advantages and Versatility of Fluorescence-Based Methodology to Characterize the Functionality of LDLR and Class Mutation AssignmentPublication . Etxebarria, A.; Benito-Vicente, A.; Alves, A.C.; Ostolaza, H.; Bourbon, M.; Martin, C.Familial hypercholesterolemia (FH) is a common autosomal codominant disease with a frequency of 1∶500 individuals in its heterozygous form. The genetic basis of FH is most commonly mutations within the LDLR gene. Assessing the pathogenicity of LDLR variants is particularly important to give a patient a definitive diagnosis of FH. Current studies of LDLR activity ex vivo are based on the analysis of 125I-labeled lipoproteins (reference method) or fluorescent-labelled LDL. The main purpose of this study was to compare the effectiveness of these two methods to assess LDLR functionality in order to validate a functional assay to analyse LDLR mutations. LDLR activity of different variants has been studied by flow cytometry using FITC-labelled LDL and compared with studies performed previously with 125I-labeled lipoproteins. Flow cytometry results are in full agreement with the data obtained by the 125I methodology. Additionally confocal microscopy allowed the assignment of different class mutation to the variants assayed. Use of fluorescence yielded similar results than 125I-labeled lipoproteins concerning LDLR activity determination, and also allows class mutation classification. The use of FITC-labelled LDL is easier in handling and disposal, cheaper than radioactivity and can be routinely performed by any group doing LDLR functional validations.