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- Estudo do efeito mutagénico de um nanomaterial de dióxido de titânio num modelo de ratinho transgénicoPublication . Louro, Henriqueta; Tavares, Ana; Vital, Nádia; Lavinha, João; Silva, Maria JoãoUma das principais preocupações relativamente aos efeitos adversos na saúde humana decorrentes do uso dos nanomateriais manufaturados (NMs) é o seu potencial efeito carcinogénico. Sabe-se que grande parte dos agentes carcinogénicos atua por uma via genotóxica, i.e., através da indução e acumulação de alterações irreversíveis no genoma das células somáticas. Neste sentido, os ensaios de genotoxicidade (de curto-termo) são utilizados para caracterizar o potencial efeito carcinogénico de xenobióticos, sendo propostas várias abordagens baseadas na combinação de testes de genotoxicidade in vitro e in vivo. Em particular, os agentes que apresentem resultados inconclusivos in vitro devem ser testados in vivo, uma vez que a utilização de modelos animais, apesar de dever ser restringida, tem o valor incontornável de fazer intervir toda a complexidade inerente a um organismo superior. No âmbito do projeto NANOGENOTOX (www.nanogenotox.com), foram caracterizados os efeitos genotóxicos de NMs representativos de três classes: sílica amorfa sintética, dióxido de titânio (TiO2) e nanotubos de carbono em várias linhas celulares. Face a alguns resultados inconclusivos in vitro, no presente estudo pretendeu-se caracterizar os efeitos mutagénicos associados à exposição a um NM de TiO2 (anatase), recorrendo-se a um modelo de ratinho transgénico baseado em plasmídeo contendo o gene bacteriano LacZ. Este modelo pode ser usado de forma integrada, permitindo a determinação da frequência de mutações induzidas em vários órgãos, bem como a análise de instabilidade cromossómica (ensaio do micronúcleo). Assim, grupos de cinco ratinhos foram tratados por via intravenosa em dois dias consecutivos, com duas doses de TiO2 preparado segundo um protocolo de dispersão estandardizado. As doses foram selecionadas com base nos dados de toxicocinética e bioacumulação previamente obtidos por parceiros do projeto. Em simultâneo, foram utilizados um grupo de controlo negativo injetado com o meio de dispersão do NM e um grupo de controlo positivo exposto a etilnitrosureia (ENU). Decorridas 42h após a última injeção, realizou-se o ensaio do micronúcleo em reticulócitos do sangue periférico e, ao fim de 28 dias, sacrificaram-se os animais e recolheram-se os órgãos para análise de lesões no DNA (ensaio do cometa em células hepáticas e esplénicas) e de mutações no transgene. A análise dos resultados dos ensaios do cometa e do micronúcleo não revelou propriedades genotóxicas do TiO2 nos ratinhos. Resultados preliminares da frequência de mutação no transgene isolado a partir de células hepáticas parecem estar concordantes, embora esta análise ainda esteja em curso. Em conclusão, espera-se que a integração dos resultados destes três endpoints e a sua interpretação global contribuam para o “corpo de evidência” relativamente à genotoxicidade associada a este NM de dióxido de titânio, permitindo concluir acerca da sua segurança para a saúde humana.
- Caracterização da genotoxicidade de nanomateriais manufaturados numa linha celular de epitélio brônquico humanoPublication . Tavares, Ana; Louro, Henriqueta; Vital, Nádia; Antunes, Susana; Lavinha, João; Silva, Maria JoãoOs nanomateriais manufaturados (NMs) apresentam propriedades físico-químicas específicas que lhes conferem caraterísticas mecânicas, óticas, elétricas e magnéticas únicas e vantajosas para aplicações industriais e biomédicas. Contudo, o desenvolvimento exponencial das nanotecnologias contrasta com a avaliação ainda insuficiente dos seus eventuais perigos, nomeadamente ao nível dos potenciais efeitos lesivos do genoma e seu impacto na saúde humana e no ambiente. O presente trabalho, desenvolvido no âmbito do Projeto NANOGENOTOX (www.nanogenotox.com), teve como objetivo contribuir para a caracterização dos efeitos genotóxicos representativos de três classes de NMs utilizados em produtos de consumo - sílica sintética amorfa, dióxido de titânio (TiO2) e nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNTs) - numa linha celular derivada do epitélio respiratório humano. As propriedades físico-químicas dos NMs testados, bem como o seu comportamento em meio aquoso, foram previamente determinados por outros participantes do projeto através de vários métodos, incluindo dynamic light scattering e microscopia eletrónica de transmissão. Para a caracterização dos efeitos genotóxicos de cada NM recorreu-se a uma linha celular de epitélio brônquico humano (células BEAS-2B) expostas a várias concentrações de cada um dos NMs dispersos num meio aquoso, de acordo com um protocolo desenvolvido e estandardizado para o efeito. Foram utilizados, em simultâneo, controlos negativos e positivos incluindo, como controlo nanoparticulado, o óxido de zinco (ZnO). Perante a incerteza sobre qual o método mais adequado para testar a genotoxicidade dos NMs, selecionou-se a combinação de dois ensaios complementares: o ensaio do cometa que permite a quantificação de quebras ao nível do DNA e o ensaio do micronúcleo, um dos métodos mais sensíveis para detetar a indução de instabilidade cromossómica. Globalmente, os resultados de ambos os ensaios foram concordantes, sendo que não se identificaram efeitos genotóxicos inequívocos após exposição das células BEAS-2B aos NMs estudados. No caso do NM de TiO2, observou-se um ligeiro aumento de quebras no DNA após 24h de exposição, apesar de não se ter detetado indução de quebras cromossómicas pelo ensaio do micronúcleo, sugerindo a indução de um efeito lesivo transitório ao nível do DNA. Por sua vez, apenas a concentração mais elevada do ZnO nanoparticulado induziu um aumento significativo de quebras no DNA, sendo, no entanto, já citotóxica. Estes resultados serão comparados com os obtidos noutros Laboratórios em condições experimentais similares (comparação inter-laboratorial), para avaliação da sua consistência e, também, da adequação destes ensaios in vitro na avaliação da genotoxicidade dos NMs. Para além disso, espera-se que a integração dos presentes resultados com os obtidos em ensaios in vivo, contribua para uma caracterização mais completa e fidedigna da genotoxicidade destes nanomateriais. (*Ambas as autoras contribuiram igualmente para o trabalho.)