Browsing by Author "Rodrigues Neno, Vanessa Isabel"
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- Caraterização dos domínios da proteína adaptadora Ezrina essenciais à estabilização membranar do canal CFTR-F508delPublication . Rodrigues Neno, Vanessa Isabel; Matos, Paulo Henrique Carrasquinho deA Fibrose Quística (FQ) é a doença genética autossómica recessiva mais prevalente em Caucasianos. Esta doença é causada por mutações no gene CFTR que codifica a glicoproteína CFTR, um canal transportador de iões cloreto expresso em células epiteliais de vários órgãos. Atualmente estão identificadas cerca de 2000 mutações, sendo a mais comum a F508del - que corresponde à deleção do aminoácido fenilalanina na posição 508 e está presente em 90% dos doentes, em pelo menos um dos alelos. Esta mutação prejudica o folding e o tráfego do canal para a membrana plasmática (MP) afetando assim a função da CFTR. Ainda assim, a CFTR-F508del que consegue atingir a MP apresenta ainda defeitos no transporte de cloreto e na sua permanência e estabilidade na superfície das células. Consequentemente, a ausência funcional do canal CFTR nas células epiteliais causa deficiências em vários órgãos e sistemas, dos quais se destacam a insuficiência pancreática, a infertilidade masculina e os problemas respiratórios, de longe a manifestação com maior mortalidade, decorrente de infeções recorrentes e da inflamação crónica das vias respiratórias, que acabam por levar à falência pulmonar. Nos últimos anos têm sido feitos diversos estudos para identificar estratégias que permitam corrigir e resgatar a CFTR-F508del para a MP. A pesquisa de compostos para este efeito – denominados “corretores” – levou à descoberta de várias novas moléculas. O corretor mais promissor é o composto VX-809 que permite corrigir parcialmente o folding da CFTR-F508del e, consequentemente, promove o seu resgate para a MP. Contudo, os ensaios clínicos para este composto não mostraram melhorias significativas na maturação da CFTR-F508del em biopsias rectais, nem na função pulmonar dos doentes. Estudos posteriores demonstraram que o canal corrigido é muito instável sendo rapidamente removido da MP por endocitose. O grupo de acolhimento tem investigado este fenómeno, procurando caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos, por forma a encontrar estratégias que permitam estabilizar a CFTR-F508del corrigida com o VX-809 na MP. Em estudos recentes do grupo mostrou-se que a ativação da proteína Ezrina e a interação do seu domínio FERM com a proteína NHERF1 estabilizam a CFTR-F508del corrigida farmacologicamente na MP através da formação do complexo macromolecular CFTR-NHERF1-Ezrina. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu em identificar que subdomínios da proteína Ezrina são essenciais para esta estabilização da CFTR-F508del e utilizar esta informação para desenvolver um péptido recombinante bioativo. No desenho deste péptido de fusão foram ainda incluídos domínios de transdução proteica, de modo possibilitar a sua entrega às células alvo, e uma sequência péptido sinal eucariota, permitindo a sua síntese e secreção a partir de células de mamífero, o que possibilitou a sua produção e isolamento. Os resultados obtidos mostraram que o péptido bioativo produzido promove a estabilização na superfície celular da CFTR-F508del resgatada farmacologicamente. Foi também possível observar, através de imunofluorescência confocal, que o péptido de fusão é capaz de atravessar as membranas celulares e que possui um efeito autócrino ao ser secretado por células epiteliais brônquicas que expressam constitutivamente CFTR-F508del. Finalmente, o efeito aditivo do co-tratamento com VX-809 e a administração ectópica de péptido produzido em células HEK 293 foi demonstrado pelo aumento da atividade da CFTR-F508del em ensaios de influxo de iodeto. O segundo objetivo deste trabalho consistiu em explorar a alteração conformacional da proteína adaptadora NHERF1, que determina a estabilização da CFTR-F508del resgatada na MP, para produzir um sensor de FRET que possa vir a ser utilizado em ensaios de alto rendimento na pesquisa de alternativas químicas ou bioquímicas ao péptido bioativo produzido. Os resultados preliminares demonstraram a viabilidade do método, mas evidenciaram a necessidade de restringir a localização do sensor à MP para permitir a automação da metodologia em ensaios de alto rendimento. Por fim, analisou-se a expressão da GTPase variante RAC1b em amostras de tecido pulmonar, comparando indivíduos saudáveis com doentes de FQ (F508del+/+). A RAC1b é uma variante de splicing com propriedades antagónicas da GTPase RAC1, molécula que participa na ativação da Ezrina e é necessária à estabilização endógena da CFTR na MP. Os resultados obtidos não evidenciaram qualquer aumento de expressão desta variante em pulmões FQ F508del+/+. Não obstante, ao dosear-se a expressão de citoqueratina 8, verificou-se que a composição epitelial das amostras FQ era deficitária, pelo que a expressão de RAC1b detetada pode encontrar-se subestimada. Assim, pensa-se que os objetivos propostos para este trabalho de mestrado foram predominantemente atingidos, quer no que respeita ao desenvolvimento do péptido bioativo derivado da Ezrina, quer ao nível da construção e testes preliminares do sensor de FRET baseado na NHERF1. Assim, só não foi possível cumprir integralmente o último objetivo, pois a análise dos níveis de expressão de RAC1b em tecidos epiteliais brônquicos de doentes com FQ (F508del+/+) revelou-se inconclusiva.