Browsing by Author "Oliveira, Mariana"
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- Epidemiologia e frequência de Aspergillus em doentes com suspeita de patologia respiratória fúngicaPublication . Oliveira, Mariana; Sabino, Raquel; Rebelo, Maria TeresaO género Aspergillus é composto por centenas de espécies de fungos ubíquos que são agentes patogénicos oportunistas do ser humano, particularmente dos indivíduos imunocomprometidos e/ou com danos estruturais nos pulmões resultado de patologias prévias como tuberculose pulmonar. Aspergilose é o nome dado ao espetro de patologias causadas por Aspergillus e que se estendem desde a reação hipersensível do hospedeiro aos fungos até à infeção invasiva cuja taxa de letalidade é elevada. O tratamento destas patologias depende essencialmente dos antifúngicos da classe dos azóis, contudo a emergência de resistência por A. fumigatus sensu stricto assim como a resistência intrínseca das espécies crípticas pode comprometer esta terapêutica. O diagnóstico de aspergilose está dependente da deteção laboratorial direta e/ou indireta de Aspergillus nas amostras biológicas dos pacientes através das técnicas culturais e imunoenzimáticas, mas a sensibilidade e a especificidade destas técnicas varia amplamente. Posto isto, este trabalho foi realizado com os seguintes objetivos: (i) a vigilância de Aspergillus em pacientes com sintomas de patologia respiratória fúngica, nomeadamente em grupos de risco de aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia) e (ii) a otimização da deteção molecular de Aspergillus e/ou de outros fungos potencialmente patogénicos através de PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e de técnicas de next generation sequencing, respetivamente. No âmbito do estudo da epidemiologia de aspergilose em doentes com suspeita de infeção fúngica do trato respiratório foram analisadas retrospetivamente as amostras respiratórias de 146 pacientes que se encontravam conservadas no Laboratório Nacional de Referência de Infeções Parasitárias e Fúngicas. Cinquenta e sete destes pacientes (39,0%) foram positivos para Aspergillus através das técnicas cultural, imunoenzimática e molecular. Cinquenta e oito colónias de Aspergillus foram isoladas e identificadas através de sequenciação dos genes para a calmodulina ou a β-tubulina e por PCR em tempo real. Detetaram-se 6 secções de Aspergillus distintas, sendo a mais frequente a Nigri (42,1%) seguida de Fumigati (33,3%) e de Flavi (8,6%). Quanto às espécies, as mais frequentemente identificadas foram A. niger sensu stricto (33,9%) seguida de A. fumigatus sensu stricto (32,1%). Identificaram-se também 9 espécies crípticas cuja frequência foi 21,4%. Paralelamente ao estudo epidemiológico indicado, analisou-se o perfil de suscetibilidade aos azóis de Aspergillus da secção Fumigati que haviam sido isolados de produtos respiratórios e conservados em coleção de culturas no âmbito do programa de Vigilância em Aspergillus. Os isolados identificados como Aspergillus fumigatus sensu stricto (n=45), A. lentulus (n=4), A. udagawae (n=2) e A. pseudofelis (n=1) foram inoculados em meios de screening com voriconazol, itraconazol e posaconazol e o seu crescimento foi caracterizado. Os resultados foram corroborados pelas técnicas de E-test e através de PCR multiplex em tempo real para deteção de mutações no gene Cyp51A. Nenhum isolado de A. fumigatus sensu stricto revelou resistência aos azóis, mas foi detetada menor suscetibilidade ao voriconazol num isolado da espécie A. udagawae e ao voriconazol (CMI = 1 μg/ml) e ao itraconazol (CMI = 2 μg/ml) em A. pseudofelis. Com o objetivo de comparar os resultados obtidos por técnicas convencionais com os das técnicas moleculares, o DNA extraído do sobrenadante de 44 amostras respiratórias que haviam sido previamente analisadas através de ELISA para deteção de galactomanano e/ou pela técnica cultural foi sujeito ao PCR multiplex em tempo real com o kit AsperGenius® e compararam-se os resultados obtidos pelas várias técnicas. Verificou-se que o PCR multiplex em tempo real permitiu obter uma taxa de positividade superior à das técnicas convencionais de diagnóstico de aspergilose, particularmente nos pacientes em risco de desenvolver aspergilose pulmonar crónica (VIH positivo e tuberculose pulmonar ativa ou prévia). Procedeu-se também à otimização da amplificação e vii sequenciação por técnicas de next generation sequencing da região ITS e do gene calmodulina do DNA extraído de amostras respiratórias. Este estudo piloto de análise metagenómica permitiu detetar os fungos Pneumocystis e Cryptococcus mo micobioma dos pacientes VIH positivo que frequentemente desenvolvem pneumocistose e criptococose. Detetaram-se também outros fungos potencialmente patogénicos nomeadamente dos géneros Aspergillus, Trichosporon, Saccharomyces e Schizophyllum. Conclui-se assim que a distribuição de Aspergillus é complexa e diversa e que a resistência aos azóis não aparenta ser um problema nas estirpes analisadas, contudo a monitorização contínua é fundamental. Essa monitorização deve incluir não só as técnicas de determinação do perfil de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos como a identificação molecular das espécies, particularmente devido à elevada frequência com que as espécies crípticas foram detetadas neste trabalho assim como a resistência intrínseca aos antifúngicos que algumas delas apresentaram. Conclui-se também que as técnicas moleculares têm uma grande capacidade de detetar rápida e eficazmente fungos potencialmente patogénicos nas amostras biológicas humanas pelo que esforços para a sua otimização, padronização e validação clínica devem ser realizados no futuro.
- Molecular detection of Aspergillus in samples collected from patients with suspicion of respiratory fungal infectionPublication . Oliveira, Mariana; Simões, Helena; Veríssimo, Cristina; Sabino, RaquelThe aim of this study was to determine the potential of the real-time multiplex PCR to detect Aspergillus spp. DNA in respiratory samples from a cohort of patients with suspicion of respiratory fungal infection. This is of particular importance in patients who are HIV positive and frequently misdiagnosed with pulmonary tuberculosis, when they suffer from aspergillosis. In this study, we have tested patients with a higher risk to develop chronic pulmonary aspergillosis (CPA): HIV+ patients as well as patients with active tuberculosis or with a previous Mycobacterium infection.
- Pulmonary mycobiome of patients with suspicion of respiratory fungal infection – an exploratory studyPublication . Oliveira, Mariana; Pinto, Miguel; Veríssimo, Cristina; Sabino, RaquelObjective: This pilot study aimed to characterize the pulmonary mycobiome of patients with suspicion of fungal infection of the respiratory tract as well as to identify potentially pathogenic fungi colonizing/infecting their lungs. Methods: A cohort of 10 patients was analyzed, including HIV+ patients and patients with active infection caused by Mycobacterium species. Their respiratory samples (bronchoalveolar lavage fluid/ bronchial secretions) were pre-treated with lyticase and proteinase K; DNA was extracted using the High Pure PCR Template Preparation kit following the manufacturer’s instructions. The internal transcribed spacer region 1 (ITS1) and calmodulin gene were amplified by PCR and the resulting amplicons were sequenced using the Illumina MiSeq platform with pair-end reads of 150 bp. The obtained results were analyzed using the PIPITS pipeline as described by Gweon et al. [1]. Operational taxonomic units (OTU) to which less than 0.1% of the total reads attributed were disregarded. Results: Thirty-seven different OTU were identified from which two belonged to the Plantae kingdom, 11 had less than the 0.1% threshold of the total reads and were therefore disregarded. The remaining 24 different OTU (grouped in 17 phylotypes), were considered as part of the pulmonary mycobiome of patients. Two phyla were identified: Basidiomycota (33.3%) and Ascomycota (54.2%). Regarding the Basidiomycota phylum, reads were classified in three classes (Agaricomycetes, Tremellomycetes and Walleomycetes), while for the Ascomycota phylum four different taxonomical classes were identified: Pneumocystidomycetes, Dothideomycetes, Eurotiomycetes and Saccharomycetes, with the latter being the most frequent class. Twelve fungal genera were identified, being Candida the most frequently detected. The median number of fungal genera detected in patients’ pulmonary mycobiome was six (ranging from two up to nine). The genus Papilotrema and the potentially pathogenic genera Cryptococcus and Pneumocystis were exclusively found in the pulmonary mycobiome of HIV+ + patients. Other potentially pathogenic fungi such as Aspergillus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces spp. and Schizophyllum spp. were also detected. Conclusion: This pilot study illustrates how the pulmonary mycobiome is rich and highly variable in patients with fungal infections. The obtained results suggest that the described metagenomic analysis may possess a great ability to quickly and effectively detect potentially pathogenic fungi in the mycobiome of patients, making it a promising future diagnostic tool. Thus, further optimization, standardization and clinical validation of these NGS methodologies should be warranted in the future.
- Trends on Aspergillus Epidemiology-Perspectives from a National Reference Laboratory Surveillance ProgramPublication . Sabino, Raquel; Gonçalves, Paulo; Martins Melo, Aryse; Simões, Daniela; Oliveira, Mariana; Francisco, Mariana; Viegas, Carla; Carvalho, Dinah; Martins, Carlos; Ferreira, Teresa; Toscano, Cristina; Simões, Helena; Veríssimo, CristinaIdentification of Aspergillus to species level is important since sibling species may display variable susceptibilities to multiple antifungal drugs and also because correct identification contributes to improve the knowledge of epidemiological studies. Two retrospective laboratory studies were conducted on Aspergillus surveillance at the Portuguese National Mycology Reference Laboratory. The first, covering the period 2017-2018, aimed to study the molecular epidemiology of 256 Aspergillus isolates obtained from patients with respiratory, subcutaneous, or systemic infections and from environmental samples. The second, using our entire collection of clinical and environmental A. fumigatus isolates (N = 337), collected between 2012 and 2019, aimed to determine the frequency of azole-resistant A. fumigatus isolates. Aspergillus fumigatus sensu stricto was the most frequent species in both clinical and environmental samples. Overall, and considering all Aspergillus sections identified, a high frequency of cryptic species was detected, based on beta-tubulin or calmodulin sequencing (37% in clinical and 51% in environmental isolates). Regarding all Fumigati isolates recovered from 2012-2019, the frequency of cryptic species was 5.3% (18/337), with the identification of A. felis (complex), A. lentulus, A. udagawae, A. hiratsukae, and A. oerlinghauensis. To determine the frequency of azole resistance of A. fumigatus, isolates were screened for azole resistance using azole-agars, and 53 possible resistant isolates were tested by the CLSI microdilution reference method. Nine A. fumigatus sensu stricto and six Fumigati cryptic isolates showed high minimal inhibitory concentrations to itraconazole, voriconazole, and/or posaconazole. Real-time PCR to detect cyp51A mutations and sequencing of cyp51A gene and its promoter were performed. The overall frequency of resistance to azoles in A. fumigatus sensu stricto was 3.0%. With this retrospective analysis, we were able to detect one azole-resistant G54R mutant A. fumigatus environmental isolate, collected in 2015. The TR34/L98H mutation, linked to environmental transmission route of azole resistance, was the most frequently detected mutation (N = 4; 1.4%). Our findings underline the demand for correct identification and susceptibility testing of Aspergillus isolates.