Browsing by Author "Oliveira, Márcia E."
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- Expanding the MTM1 mutational spectrum: novel variants including the first multi-exonic duplication and development of a locus-specific databasePublication . Oliveira, Jorge; Oliveira, Márcia E.; Kress, Wolfram; Taipa, Ricardo; Melo Pires, Manuel; Hilbert, Pascale; Baxter, Peter; Santos, Manuela; Buermans, Henk; den Dunnen, Johan; Santos, RosárioMyotubular myopathy (MIM#310400), the X-linked form of Centronuclear myopathy (CNM) is mainly characterized by neonatal hypotonia and inability to maintain unassisted respiration. The MTM1 gene, responsible for this disease, encodes myotubularin – a lipidic phosphatase involved in vesicle trafficking regulation and maturation. Recently, it was shown that myotubularin interacts with desmin, being a major regulator of intermediate filaments. We report the development of a locus-specific database for MTM1 using the Leiden Open Variation database software (http://www.lovd.nl/MTM1), with data collated for 474 mutations identified in 472 patients (by June 2012). Among the entries are a total of 25 new mutations, including a large deletion encompassing introns 2–15. During database implementation it was noticed that no large duplications had been reported. We tested a group of eight uncharacterized CNM patients for this specific type of mutation, by multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA) analysis. A large duplication spanning exons 1–5 was identified in a boy with a mild phenotype, with results pointing toward possible somatic mosaicism. Further characterization revealed that this duplication causes an in-frame deletion at the mRNA level (r.343_444del). Results obtained with a next generation sequencing approach suggested that the duplication extends into the neighboring MAMLD1 gene and subsequent cDNA analysis detected the presence of a MTM1/MAMLD1 fusion transcript. A complex rearrangement involving the duplication of exon 10 has since been reported, with detection also enabled by MLPA analysis. It is thus conceivable that large duplications in MTM1 may account for a number of CNM cases that have remained genetically unresolved.
- Expanding the mutation spectrum of the MTM1 gene: the first multi-exonic duplication and establishment of the MTM1 locus-specific databasePublication . Oliveira, Jorge; Oliveira, Márcia E.; Brekelmans, Roel; Melo-Pires, Manuel; Guimarães, António; den Dunnen, Johan; Santos, Manuela; Santos, RosárioCentronuclear myopathies (CNM) are a group of diseases with variable onset and severity sharing as a distinctive histological feature, a high frequency of muscle fibers with centralized nuclei. Myotubular myopathy (MIM#310400) the X-linked form of CNM is characterized by neonatal hypotonia and inability to maintain unassisted respiration. The MTM1 gene, responsible for this disease, encodes myotubularin, a protein involved in myofiber differentiation and muscle cell architecture. In this work, eight patients were subjected to MTM1 MLPA analysis, selected according to the following criteria: (i) muscle biopsy compatible with CNM and (ii) exclusion of MTM1 point mutations by sequencing. We identified the first gross duplication spanning exons 1–5 (c.-76-?_342+?dup) in a 7 year old boy with progressive tetraparesis, ophtalmoparesis, facial diparesis and independent ambulation, the clinical course being milder than the classical myotubular myopathies. Analysis at the mRNA level revealed both normal transcripts and a mutated isoform lacking exon 6 (r.343_444del), suggesting somatic mosaicism. As suspected, this duplication was not detected in the patient’s mother. Considering the phenotypic expression in the patient, this mutational event most likely occurred de novo during early embryogenesis. We also describe the implementation of a locus-specific database (LSDB) for this gene using the Leiden Open Variation database (LOVD) software. The MTM1-LOVD (http://www.lovd.nl/MTM1) contains 372 mutation entries identified in 370 patients (last accessed March 2011). A total of 223 unique MTM1 mutations are listed in this LSDB, including: 207 point mutations, 15 single or multi-exonic deletions and the large duplication described in the present work. Despite the significant advances in this field during the last decade about one third of the CNM cases remain genetically unresolved. Here we show that gross MTM1 gene duplications may account for a fraction of these cases.
- Haplotype analysis of newly diagnosed Portuguese and Brazilian families with fibrinogen amyloidosis caused by the FGA p.Glu545Val variantPublication . Tavares, Isabel; Oliveira, Márcia E.; Maia, Nuno; Moreira, Luciana; Castro Lacerda, Pedro; Santos, Josefina; Santos, Rosário; Pinho Costa, Paulo; Lobato, LuísaBackground: Fibrinogen A alpha-chain (AFib) amyloidosis is an autosomal dominant disease with an endemic foci in the district of Braga, northern Portugal [1]. Among the 16 amyloidogenic mutations identified in the fibrinogen A alpha-chain gene (FGA) [2,3], the c.1634A > T (p.Glu545Val) mutation (rs121909612) is the most common and, so far, the only one identified in Portugal. A first study using three common polymorphisms showed a single haplotype, associated with the FGA p.Glu545Val mutation in Irish–American and Polish–Canadian kindreds [4]. However, the origin of this amyloidogenic variant in diverse regions and its migration in the different populations are still unclear. Therefore, we proceeded to a preliminary study using two FGA haplotype markers in newly identified Portuguese and Brazilian carriers to investigate the possibility of a common ancestor.
- Nova abordagem no diagnóstico diferencial de doentes Portugueses com LGMD2A (ou Calpainopatia)Publication . Oliveira, Márcia E.; Maia, Nuno; Vieira, Emília; Evangelista, Teresinha; Melo Pires, Manuel; Peixoto Silveira, Fernando; Santos, RosárioINTRODUÇÃO A Distrofia Muscular das Cinturas tipo 2A (Limb girdle muscular dystrophy type 2A, LGMD2A) ou Calpainopatia é umas das formas mais frequentes de Distrofia Muscular das Cinturas (LGMD), de transmissão autossómica recessiva. Clinicamente, os doentes afectados com LGMD2A são caracterizados por fraqueza progressiva dos músculos das cinturas escapular e pélvica [1]. Recentemente, foram descritos casos de LGMD2A com apresentação autossómica dominante [2]. Mutações no gene CAPN3 são responsáveis pela LGMD2A, que codifica a proteína muscular Calpaína-3 (CAPN3), uma protease de cisteína dependente de iões cálcio. Esta proteína é predominantemente expressa no músculo esquelético, onde se encontra associada à titina (uma proteína muscular “gigante” envolvida na contracção-relaxamento muscular) [3]. Além da sua função proteolítica, a CAPN3 apresenta também actividade autolítica. Diversos estudos realizados têm vindo a demonstrar que o mecanismo de autólise da CAPN3 é fundamental para a activação e regulação da sua actividade proteolítica [4]. A análise proteica muscular dos doentes LGMD2A tem revelado que a maioria destes apresenta alterações na abundância da CAPN3 muscular (ausência/diminuição da abundância) por comparação com amostras controlo, através de análise por western-blotting. Paralelamente, verifica-se também a existência de um pequeno grupo de doentes com abundância normal da CAPN3 no músculo, mas cujas mutações no gene CAPN3 surpreendentemente se encontram associadas à perda da função autolítica da proteína [5]. OBJECTIVOS Dado o largo espectro de mutações detectadas nos doentes com diagnóstico molecular de LGMD2A realizado na Unidade de Genética Molecular do CGMJM, com este trabalho pretendeu-se complementar o estudo molecular num pequeno grupo de doentes LGMD2A Portugueses, na tentativa de estabelecer correlações genótipo/fenótipo. MATERIAIS E MÉTODOS Amostras de biópsia muscular de 9 doentes LGMD2A diagnosticados molecularmente e de controlos foram sujeitas a análise das proteínas musculares para estudo de abundâncias e teste da função autolítica, por western-blotting e densitometria. Adicionalmente, foram realizados estudos de expressão do gene CAPN3 por PCR em tempo real quantitativo. RESULTADOS E DISCUSSÃO A CAPN3 não foi observada em 5 amostras musculares (5 em 9) após immunoblotting, sugerindo alterações ao nível da pós-transcrição da proteína nestes doentes. O teste da função autolítica da CAPN3 foi efectuado nos doentes que apresentaram abundância “normal” nas biópsias musculares (3 em 9). Os resultados obtidos sugerem que 2 destes doentes perderam a actividade autolítica da CAPN3. Uma vez que apenas um alelo mutado foi detectado num destes 2 doentes após o seu estudo molecular, este teste foi importante para confirmar o diagnóstico de LGMD2A neste doente. A técnica de PCR em tempo real quantitativo foi realizada para avaliar diferenças nos níveis de expressão do gene CAPN3 entre os doentes e amostras musculares controlo. Surpreendentemente, nenhuma redução na expressão do gene CAPN3 foi observada nas amostras analisadas (num total de 5). Adicionalmente, duas delas (relativas a doentes com apenas 1 alelo mutado identificado) apresentaram aumento da expressão do gene CAPN3 muito superior (~3,5 a 5,5 vezes) aos controlos, sugerindo a exclusão do diagnóstico de LGMD2A nestes doentes. CONCLUSÕES FINAIS Com esta nova abordagem de estudo foi possível: i) confirmar ou excluir o diagnóstico de LGMD2A em casos com resultados inconclusivos; ii) atribuir um defeito quantitativo ou funcional dos doentes com LGMD2A; iii) sugerir outras causas de envolvimento (outros factores que não a CAPN3), principalmente em doentes não confirmados molecularmente. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Zatz M et al. Neuromuscular Disord 2003, 13:532-544. [2] Vissing J et al. Neuromuscul Disord 2011, 21:750. [3] Kramerova I et al. Biochimica et Biophysica Acta 2007, 128-144. [4] Groen EJ et al. Brain 2007, 130:3237-3249. [5] Fanin M et al. Eur J Hum Genet 2009, 17:598-603.
- O Papel da neuropatologia no diagnóstico das distrofias das cinturas autossómicas recessivasPublication . Monteiro, Cecília; Taipa, Ricardo; Alves, Ivânia; Vieira, Emília; Oliveira, Márcia E.; Melo Pires, Manuel; Santos, Rosário; Guimarães, AntónioINTRODUÇÃO As distrofias das cinturas (DC) autossómicas recessivas representam um grupo heterogéneo de doenças caracterizadas por fraqueza e atrofia muscular progressivas, com idade de início variável. Embora o diagnóstico definitivo seja genético, a biópsia muscular é utilizada para orientação da investigação. OBJECTIVO Verificar a relação entre o estudo neuropatológico e o diagnóstico genético nas DC, procurando determinar padrões histoenzimológicos e imunohistoquímicos característicos. MÉTODOS Selecção das biópsias realizadas na Unidade de Neuropatologia do HSA entre 1980 e 2011 com diagnóstico final de DC e correlação com os respectivos resultados genéticos realizados na Unidade de Genética Molecular do CGMJM. RESULTADOS Foram registadas 132 biópsias, 77 das quais com estudo genético: 18 γ-sarcoglicanopatias (23%), 7 calpainopatias (9%), 7 disferlinopatias (9%), 6 α-sarcoglicanopatias (8%) e 6 β-sarcoglicanopatias (8%); 10 correspondem a mutações menos frequentes ou mutações de outras doenças não-DC (FKRP, ANO5, TCAP, DYS, LMNA, SMA) e 23 doentes apresentaram testes genéticos negativos. O resultado neuropatológico foi confirmado pela genética em 15 γ-sarcoglicanopatias (num total de 16 propostas), 6 disferlinopatias (9 propostas), 5 α-sarcoglicanopatias (5 propostas) e 1 calpainopatia (7 propostas); uma β-sarcoglicanopatia foi proposta no estudo neuropatológico (aguarda resultado genético). O diagnóstico neuropatológico nas 6 β-sarcoglicanopatias confirmadas geneticamente foi “DC não especificada” na maioria. A revisão dessas biópsias mostrou que todas apresentam ausência ou redução marcada de pelo menos 3 dos 4 sarcoglicanos. O estudo histoenzimológico não contribuiu para o diagnóstico diferencial das diferentes DC, à excepção das calpainopatias - pela presença de fibras lobuladas, 7 biópsias foram descritas como sugestivas de calpainopatia, sendo que apenas num doente esse diagnóstico foi confirmado. As biópsias do grupo de calpainopatias confirmadas geneticamente, em que este diagnóstico não foi sugerido, não apresentavam fibras lobuladas ou infiltrados inflamatórios. DISCUSSÃO A ausência de marcação para γ-sarcoglicano, associada a restantes marcações normais ou ligeiramente alteradas sugere o diagnóstico de γ-sarcoglicanopatia, e a ausência completa ou redução marcada de 3 das 4 sarcoglicanos, pode ser considerada para o diagnóstico de β-sarcoglicanopatia. As fibras lobuladas foram inespecíficas na orientação para o diagnóstico de calpainopatia. Realçamos a importância do estudo imunohistoquímico completo, que pode ajudar a identificar padrões de expressão das proteínas da membrana, permitindo orientar o estudo genético.
- Refining the molecular characterization of calpainopathy (LGMD2A) patientsPublication . Maia, Nuno; Vieira, Emília; Santos, Rosário; Oliveira, Márcia E.Introduction: Mutations in the gene CAPN3 are responsible for calpainopathy or limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A), one of the most frequent forms of LGMD. The gene CAPN3 codes for calpain-3 (or CAPN3), a muscle-specific calcium-dependent protease functionally regulated via its autolytic activity. Most of the patients show differences in CAPN3 abundance in muscle samples as compared to control muscles, by immunoblot analysis. Interestingly, a smaller group of patients with normal protein abundance presents abnormal CAPN3 autolytic function. We intend to complement the molecular studies already carried out on small group of Portuguese LGMD2A patients in order to establish genotype/phenotype correlations. Materials and methods: Muscle biopsy samples of 9 LGMD2A patients diagnosed in our laboratory were subjected to protein analysis and functional tests by western blotting and densitometry analyses. Additionally, gene expression studies were performed using real-time quantitative PCR. Results and discussion: The autolytic CAPN3 biochemical test was used in the patients that presented “normal” CAPN3 abundance in muscle biopsies (3 out of 9). The data obtained suggested that two of these patients had lost CAPN3 autolytic activity. Although, only one mutated allele had been found in one of these 2 patients after molecular genetic testing, this biochemical test was important in providing a differential diagnosis of LGMD2A in these patients. Real-time quantitative PCR was done in order to quantify differences in the expression level of the CAPN3 gene between patients’ samples and controls. Interestingly, no reduction of CAPN3 expression was observed in the samples tested (= 5). Additionally, two of them presented an overexpression of CAPN3 gene as compared to controls. Once again, in these 2 patients only one mutated allele had been detected. In these cases, the data suggests that the diagnosis of calpainopathy may be excluded in these 2 patients.
- Short-term complications after renal transplantation in AFibE526V (p.Glu545Val) amyloidosisPublication . Tavares, Isabel; Silvano, José; Moreira, Luciana; Oliveira, Márcia E.; Silva, Roberto; Sampaio, Susana; Costa, Paulo Pinho; Lobato, LuísaIntroduction: Fibrinogen Aa chain (AFib) amyloidosis is an autosomal dominant disease that typically presents with predominant renal involvement and has a predictable progressive clinical course [1]. The p.Glu545Val AFib gene (FGA) mutation is at the origin of all AFib amyloidosis cases (AFibE526V [p.Glu545Val]) that have been identified in Portugal so far, and accounts for the disease in 17 families. Current treatment of AFib amyloidosis comprises both supportive measures and disease-modifying approaches, such as liver transplantation [2,3]. Renal transplantation (RTx) is a supportive therapy with risk of premature graft loss due to amyloid recurrence or other unexpected complications related to progression of extrarenal amyloid deposition. The aim of this study was to evaluate the outcome of Portuguese patients with AFibE526V (p.Glu545Val) amyloidosis after RTx.