Browsing by Author "Machado, Miguel P."
Now showing 1 - 6 of 6
Results Per Page
Sort Options
- Caracterização molecular de hemoglobinopatias na população portuguesa – um subestudo do projeto INSEFPublication . Santos, Daniela; Barreto, Marta; Kislaya, Irina; Lopes, Pedro; Mendonça, Joana; Machado, Miguel P.; Vieira, Luís; Matias-Dias, Carlos; Faustino, PaulaA anemia é um problema de saúde pública a nível mundial que ocorre quando o número de glóbulos vermelhos em circulação ou a sua capacidade de transporte de oxigénio é insuficiente para atender às necessidades do organismo. A anemia pode ter uma origem ambiental, por exemplo devido a carência nutricional em ferro, ou uma origem genética, onde se enquadram as anemias hereditárias originadas por alterações nos genes codificantes das cadeias globínicas da hemoglobina. Estas anemias hereditárias são denominadas por hemoglobinopatias, têm transmissão autossómica recessiva e incluem as talassémias e as variantes da hemoglobina. As talassémias, no estado de portador, apresentam-se geralmente associadas a um fenótipo hematológico de microcitose e/ou hipocromia e, eventualmente, anemia. Tendo em conta os movimentos migratórios recentes, sobretudo dos continentes africano e sul americano para a Europa, o padrão de distribuição destas patologias nalguns países da Europa tem-se alterado. Os últimos estudos de prevalência de hemoglobinopatias efetuados em Portugal foram realizados há mais de duas décadas. Assim, este trabalho teve como principal objetivo contribuir para o conhecimento mais recente das hemoglobinopatias em Portugal, sobretudo das talassémias. Para concretizar este objetivo foram analisados os participantes no estudo epidemiológico Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico (INSEF)* que constituem uma amostragem da população residente em Portugal, continental e ilhas, em 2015. Em 4808 participantes no INSEF foi caracterizado o fenótipo hematológico e naqueles que apresentaram hipocromia e/ou microcitose (n = 204) foram analisados os genes da β-globina (HBB) e da α-globina (HBA2 e HBA1). A pesquisa de deleções/inserções no agrupamento génico da α-globina foi efetuada por Gap-PCR e Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). O gene HBB foi estudado através de PCR-longo seguido de Next-Generation Sequencing (NGS). As variantes detetadas por NGS foram avaliadas in silico através das ferramentas bioinformáticas PolyPhen-2, Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) e varSEAK, de modo a analisar o seu impacto ao nível da estrutura e função da respetiva proteína e ao nível do splicing. As variantes consideradas patogénicas ou possivelmente patogénicas foram confirmadas por sequenciação de Sanger. Identificámos a presença da deleção α-talassémica de 3,7 kb em 53 indivíduos, da deleção de 4,2 kb em 1 indivíduo e ainda, em 2 indivíduos, a presença dos genes da α-globina triplicados. Relativamente ao estudo do gene HBB, foram identificadas 10 variantes genéticas diferentes, patogénicas ou possivelmente patogénicas, em 22 indivíduos, sendo que 7 tipos diferentes de mutações são responsáveis por β-talassémia [vulgarmente conhecidas por Cd39 (C>T), IVS-I-6 (T>C), IVS-I-110 (G>A), IVS-I-1 (G>A), Cd15 (G>A), Cd6(-A) e Cd41/42 (-CTTT)] e 3 por variantes de hemoglobina (Hb S, Hb C e Hb D-Portugal). Obtivemos neste subgrupo da população INSEF com fenótipo hematológico anómalo (n = 204) uma frequência de 26,6% para a α-talassémia, 10,8% para a β-talassémia e 1,5% para variantes de hemoglobina. Assim, os nossos resultados revelaram que 37,7% destes casos sintomáticos têm uma origem genética – uma hemoglobinopatia. Uma vez que, salvo raríssimas exceções, os portadores de β-talassémia apresentam o fenótipo de microcitose e hipocromia, os nossos resultados permitem sugerir uma prevalência geral de 0,5% de portadores de β-talassémia para a população residente em Portugal continental e ilhas em 2015. Este valor é semelhante ao anteriormente descrito para Portugal continental (Martins et al, J Med Genet, 1993, 30:235). A mesma extrapolação não poderá ser realizada para determinar a prevalência de α-talassémia uma vez que sabemos que uma proporção significativa destes portadores não manifesta qualquer alteração hematológica. Quanto às variantes de hemoglobina, uma vez que na grande maioria não afetam os índices hematimétricos, os 3 casos detetado justificam-se pela co-herança com α-talassémia ou da co-existência de anemia ferropénica. Assim, a determinação da prevalência de variantes de hemoglobina bastante importantes, como seja a Drepanocitose (presença de hemoglobina S), requerem outro tipo de abordagem metodológica. Observámos, ainda, que dos 204 indivíduos com microcitose e/ou hipocromia, 76 também apresentavam anemia. Contudo, no inquérito INSEF de autorreporte apenas 2 desses indivíduos referiram ter conhecimento desta condição. Para além disso, verificámos que grande maioria dos portadores de hemoglobinopatia detetados perceciona a sua saúde como sendo normal e, eventualmente, desconhece (não declarou ter conhecimento) de que é portador de uma doença genética. Este estudo permitiu-nos concluir que as α- e as β-talassémias, no seu estado de heterozigotia, são responsáveis por uma fração considerável dos fenótipos de microcitose e/ou hipocromia, acompanhados ou não de anemia, na população residente no nosso país. Para além disso, os nossos resultados apontam para a necessidade de sensibilização dos médicos de Medicina Geral e Familiar para estas patologias e para o reforço das estratégias de deteção, de informação e de acompanhamento dos portadores de uma hemoglobinopatia em Portugal. *O INSEF (Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico), desenvolvido no âmbito do Projeto Pré-definido do Programa Iniciativas em Saúde Pública, foi promovido pelo Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge através do Departamento de Epidemiologia e beneficiou de apoio financeiro concedido pela Islândia, Liechtenstein e Noruega, através das EEA Grants.
- Caracterização molecular de hemoglobinopatias na população portuguesa: um subestudo do projeto INSEFPublication . Santos, Daniela; Barreto, Marta; Kislaya, Irina; Lopes, Pedro; Mendonça, Joana; Machado, Miguel P.; Vieira, Luís; Dias, Carlos; Faustino, PaulaA anemia é um problema de saúde pública a nível mundial que ocorre quando o número de glóbulos vermelhos em circulação ou a sua capacidade de transporte de oxigénio é insuficiente para atender às necessidades do organismo. A anemia pode ter uma origem ambiental, por exemplo devido a carência nutricional em ferro, ou uma origem genética, onde se enquadram as anemias hereditárias originadas por alterações nos genes codificantes das cadeias globínicas da hemoglobina. Estas anemias hereditárias são denominadas por hemoglobinopatias, têm transmissão autossómica recessiva e incluem as talassémias e as variantes da hemoglobina. As talassémias, no estado de portador, apresentam-se geralmente associadas a um fenótipo hematológico de microcitose e/ou hipocromia e, eventualmente, anemia. Tendo em conta os movimentos migratórios recentes, sobretudo dos continentes africano e sul americano para a Europa, o padrão de distribuição destas patologias nalguns países da Europa tem-se alterado. Os últimos estudos de prevalência de hemoglobinopatias efetuados em Portugal foram realizados há mais de duas décadas. Assim, este trabalho teve como principal objetivo contribuir para o conhecimento mais recente das hemoglobinopatias em Portugal, sobretudo das talassémias. Para concretizar este objetivo foram analisados os participantes no estudo epidemiológico Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico (INSEF)* que constituem uma amostragem da população residente em Portugal, continental e ilhas, em 2015. Em 4808 participantes no INSEF foi caracterizado o fenótipo hematológico e naqueles que apresentaram hipocromia e/ou microcitose (n = 204) foram analisados os genes da β-globina (HBB) e da α-globina (HBA2 e HBA1). A pesquisa de deleções/inserções no agrupamento génico da α-globina foi efetuada por Gap-PCR e Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). O gene HBB foi estudado através de PCR-longo seguido de Next-Generation Sequencing (NGS). As variantes detetadas por NGS foram avaliadas in silico através das ferramentas bioinformáticas PolyPhen-2, Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) e varSEAK, de modo a analisar o seu impacto ao nível da estrutura e função da respetiva proteína e ao nível do splicing. As variantes consideradas patogénicas ou possivelmente patogénicas foram confirmadas por sequenciação de Sanger. Identificámos a presença da deleção α-talassémica de 3,7 kb em 53 indivíduos, da deleção de 4,2 kb em 1 indivíduo e ainda, em 2 indivíduos, a presença dos genes da α-globina triplicados. Relativamente ao estudo do gene HBB, foram identificadas 10 variantes genéticas diferentes, patogénicas ou possivelmente patogénicas, em 22 indivíduos, sendo que 7 tipos diferentes de mutações são responsáveis por β-talassémia [vulgarmente conhecidas por Cd39 (C>T), IVS-I-6 (T>C), IVS-I-110 (G>A), IVS-I-1 (G>A), Cd15 (G>A), Cd6(-A) e Cd41/42 (-CTTT)] e 3 por variantes de hemoglobina (Hb S, Hb C e Hb D-Portugal). Obtivemos neste subgrupo da população INSEF com fenótipo hematológico anómalo (n = 204) uma frequência de 26,6% para a α-talassémia, 10,8% para a β-talassémia e 1,5% para variantes de hemoglobina. Assim, os nossos resultados revelaram que 37,7% destes casos sintomáticos têm uma origem genética – uma hemoglobinopatia. Uma vez que, salvo raríssimas exceções, os portadores de β-talassémia apresentam o fenótipo de microcitose e hipocromia, os nossos resultados permitem sugerir uma prevalência geral de 0,5% de portadores de β-talassémia para a população residente em Portugal continental e ilhas em 2015. Este valor é semelhante ao anteriormente descrito para Portugal continental (Martins et al, J Med Genet, 1993, 30:235). A mesma extrapolação não poderá ser realizada para determinar a prevalência de α-talassémia uma vez que sabemos que uma proporção significativa destes portadores não manifesta qualquer alteração hematológica. Quanto às variantes de hemoglobina, uma vez que na grande maioria não afetam os índices hematimétricos, os 3 casos detetado justificam-se pela co-herança com α-talassémia ou da co-existência de anemia ferropénica. Assim, a determinação da prevalência de variantes de hemoglobina bastante importantes, como seja a Drepanocitose (presença de hemoglobina S), requerem outro tipo de abordagem metodológica. Observámos, ainda, que dos 204 indivíduos com microcitose e/ou hipocromia, 76 também apresentavam anemia. Contudo, no inquérito INSEF de autorreporte apenas 2 desses indivíduos referiram ter conhecimento desta condição. Para além disso, verificámos que grande maioria dos portadores de hemoglobinopatia detetados perceciona a sua saúde como sendo normal e, eventualmente, desconhece (não declarou ter conhecimento) de que é portador de uma doença genética. Este estudo permitiu-nos concluir que as α- e as β-talassémias, no seu estado de heterozigotia, são responsáveis por uma fração considerável dos fenótipos de microcitose e/ou hipocromia, acompanhados ou não de anemia, na população residente no nosso país. Para além disso, os nossos resultados apontam para a necessidade de sensibilização dos médicos de Medicina Geral e Familiar para estas patologias e para o reforço das estratégias de deteção, de informação e de acompanhamento dos portadores de uma hemoglobinopatia em Portugal.
- Novel mutation in addition to functional TMPRSS6 gene polymorphisms originate an IRIDA-like phenotype in an African childPublication . Faleiro, Bárbara D.; Maia, Raquel; Batalha, Sara; Mendonça, Joana; Machado, Miguel P.; Vieira, Luís; Lavinha, João; Faustino, PaulaIron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA) is a rare autosomal recessive anemia often unresponsive to oral iron intake and partially responsive to parenteral iron treatment. The disease originates from mutations in TMPRSS6 gene, encoding Matriptase 2, a transmembrane serine protease that plays an essential role in down-regulating hepcidin. Once TMPRSS6 is mutated, the corresponding protein is absent or inactive at the hepatocyte membrane leading to uncontrolled high levels of hepcidin and impaired iron absorption. This study aimed to investigate a 4-year-old boy of sub-Saharan ancestry (Mozambique/Angola), presenting with microcytic hypochromic anemia, low transferrin saturation, normal ferritin, and having a partial response to intravenous iron treatment. He is a -α3.7-thalassemia carrier. TMPRSS6 was screened for variants by Next-Generation Sequencing using Nextera XT libraries in a MiSeq platform (Illumina). Genetic variants found were validated by Sanger sequencing. In silico analyses were performed in HSF, SIFT, Poly-Phen2 and Missense3D softwares. A novel missense mutation (c.871G>A) was found in heterozygosity, in TMPRSS6 exon 8. In silico analysis indicates the conserved amino acid change (G291S) may be damaging to the protein stability. Due to its location in the CUB1 domain, it may also affect the enzyme activation and substrate recognition. Additionally, 3 SNPs previously associated with a greater risk of developing iron deficiency anemia (K253E, V736A and Y739Y) were also identified in TMPRSS6. Although IRIDA is known as an autosomal recessive disease, we conclude that, in this case, the result of a digenic inheritance of the novel damaging mutation (c.871G>A; G291S) and the 3 common modulating SNPs in the same gene and a co-inheritance of the α-thalassemia HBA deletion may lead to an IRIDA-like phenotype. Further functional studies of the mutated protein as well as family studies should be conducted.
- Rare autosomal dominant hereditary hemochromatosis associated with SLC40A1 gene: ferroportin disease or type 4 hereditary hemochromatosis?Publication . Simão, Rita; Fleming, Rita; Mendonça, Joana; Machado, Miguel P.; Vieira, Luís; Tavares, Wilson; Lavinha, João; Faustino, PaulaFerroportin (FPN1), encoded by the SLC40A1 gene, is the unique cellular iron exporter identified in mammals. FPN1 transfers iron from the intestine and macrophages into the bloodstream. This function is negatively regulated by hepcidin. Mutations in SLC40A1 may affect FPN1 function, originating distinct autosomal dominant diseases: (i) the Ferroportin Disease (FD), due to loss-of-function mutations, is characterized by decreased iron export from enterocytes and severely affected iron transfer in macrophages, giving rise to a marked iron accumulation in spleen and liver; and (ii) the Type 4 Hereditary Hemochromatosis (HH), resulting from gain-of-function mutations conferring resistance to hepcidin-mediated FPN1 degradation and consequently high cellular iron export. In this study, 335 individuals suspected of having non-classic HH were enrolled. Six genes related with iron metabolism were analysed by SSCP, dHPLC or NGS. The latter used TruSeq or Nextera XT libraries and a MiSeq platform (Illumina). Genetic variants found were validated by Sanger sequencing. Predictive consequences at protein level were evaluated using Polyphen-2 and SIFT softwares. From all patients analysed, three SLC40A1 pathogenic variants were detected in heterozygosity in three women: two missense, c.238G>A, p.Gly80Ser and c.610G>A, p.Gly204Ser; and one deletion, c.485_487delTTG; p.Val162del. These variants had been reported in public databases, but they were not known to be present in the Portuguese population. The p.Gly80Ser and the p.Val162del are FPN1 loss-of-function mutations and were found associated with hyperferritinemia and low transferrin saturation (FD). In contrast, the p.Gly204Ser induced a gain of FPN1 function with a full iron export capacity giving the patient a type 4-HH phenotype, which includes iron overload, hyperferritinemia and high transferrin saturation. Detailed clinical evaluation of the suspected patients are useful to unravel the effect of different mutations in FPN1 function, expression and regulation.
- The protein Matriptase-2 damaged by a novel missense mutation in the TMPRSS6 gene originates an IRIDA-like phenotype in an African childPublication . Faleiro, Bárbara D.; Maia, Raquel; Batalha, Sara; Mendonça, Joana; Machado, Miguel P.; Lavinha, João; Faustino, PaulaIron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA) is a rare autosomal recessive anemia usually unresponsive to oral iron intake and partially responsive to parenteral iron treatment. This disease is the result of mutations in TMPRSS6 gene, encoding Matriptase-2, a transmembrane serine protease that plays a key role in down-regulating hepcidin, allowing iron bioavailability for erythropoiesis. Once TMPRSS6 is mutated, the corresponding protein is absent or inactive at the hepatocyte membrane leading to uncontrolled high levels of hepcidin and impaired iron absorption. This study investigates the case of a 4-year-old boy, of sub-Saharan ancestry (Mozambique/Angola), presenting with microcytic hypochromic anemia, low transferrin saturation, normal ferritin, and having a partial response to intravenous iron treatment. The subject is a -α3.7-thalassemia carrier. TMPRSS6 was screened for variants by Next-Generation Sequencing using Nextera XT libraries in a MiSeq platform (Illumina). Genetic variants found were validated by Sanger sequencing. In silico analyses were performed in HSF, SIFT, Poly-Phen2 and Missense3D software. In order to run a Missense3D analysis, we predicted a 3D Structure for matriptase-2 in the software Phyre2. A novel missense mutation (c.871G>A) was found in heterozygosity, in TMPRSS6 exon 8. In silico analysis indicates the conserved amino acid change (G291S) may be damaging to the protein stability. Due to its location in the CUB1 domain, it may also affect the enzyme activation and substrate recognition. Additionally, 3 SNPs previously associated with a greater risk of developing iron deficiency anemia (K253E, V736A and Y739Y) were also identified in TMPRSS6. Although IRIDA is noted as an autosomal recessive disease, we infer that, in this case, the result of a digenic inheritance of the novel damaging mutation (c.871G>A; G291S) and 3 common modulating SNPs in the same gene in addition to the co-inheritance of the α-thalassemia allele, may add up to an IRIDA-like phenotype. Further functional studies of the mutated protein as well as family studies should be conducted.
- Widening the Spectrum of TMPRSS6 Gene Pathogenic Variants Related with Hereditary Iron DeficiencyPublication . Pessoa, Vera; Oliveira, Alexandra; Santos, Daniela; Mendonça, Joana; Machado, Miguel P.; Ferrão, José; Vieira, Luís; Lopes, Pedro; Kislaya, Irina; Matias-Dias, Carlos; Barreto, Marta; Faustino, PaulaIron-Refractory Iron-Deficiency Anemia (IRIDA) is a rare autosomal recessive hypochromic microcytic anemia derived from loss-of-function mutations in the TMPRSS6 gene, which encodes Matriptase-2, a negative regulator of hepcidin expression. IRIDA patients have high hepcidin levels that prevent iron absorption and recycling. Very few studies concerning this pathology have been carried out in the Portuguese population and its molecular basis is still largely unknown. In this study, we aimed to identify genetic variants in TMPRSS6 in a sample of the Portuguese population with a hematological phenotype suggestive of iron deficiency. In addition, we intended to evaluate the performance of NGS for genetic screening of this large gene. We studied 100 adults with anemia and/or microcytosis and/or hypochromia collected by the Portuguese National Health Examination Survey (INSEF). Other possible genetic causes for these abnormal phenotypes, namely α- and β-thalassemia, were discarded after HBA1, HBA2 and HBB genetic screening. The TMPRSS6 gene (18 coding regions, exon/intron boundaries and regulatory regions) was amplified in 3 long-PCR fragments that were screened by NGS using Nextera XT libraries in a MiSeq platform. The genetic variants found were validated by Sanger sequencing (transcript ENST00000676104.1). Several known variants were identified along with two unreported mutations, c.1585T>C (p.Cys529Arg) and c.1580T>G (p.Phe527Cys). These novel mutations were classified as pathogenic by in silico analyses through Polyphen2, SIFT, and Missense3D. Moreover, Phyre2 software was used to produce a 3D structure of the mutated proteins, based on alignments with known protein structures, as there is no 3D model for Matriptase-2 on online databases. The two novel mutations were found in heterozygosity, explaining the mild abnormal hematological phenotypes and serum iron biomarkers presented by both patients. Functional studies should be performed to validate these findings. Our results widened the spectrum of TMPRSS6 pathogenic variants underlying hereditary iron deficiency-related pathologies. In addition, NGS revealed to be an appropriate tool for TMPRSS6 genetic screening.