Browsing by Author "Almeida, Vanessa"
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- Desenvolvimento de uma técnica de PCR em Tempo Real para deteção do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1Publication . Almeida, Vanessa; Pádua, Elizabeth; Crespo, Ana[PT] As crianças verticalmente infetadas por VIH-1 têm elevado risco de progressão para SIDA nos primeiros anos de vida. Por um lado, este facto evidencia a importância do diagnóstico precoce da infeção permitindo tratamento atempado, e por outro lado, fundamenta ainda a procura constante da melhoria dos ensaios experimentais de diagnóstico. A técnica de nested PCR implementada no laboratório para diagnóstico precoce é sensível e específica, mas obriga a uma manipulação de produtos amplificados com maior risco da ocorrência de contaminações. É também considerado um método moroso já que associa a duas reações de amplificação sequenciais uma eletroforese em gel de agarose para deteção dos produtos amplificados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio experimental sensível e específico, alternativo à técnica de nested PCR, que pudesse conduzir à obtenção de ganhos no tempo de saída de resultados e na redução do risco de ocorrência de contaminações. Diferentes ensaios experimentais de PCR em Tempo Real foram desenvolvidos para a amplificação de fragmentos do VIH-1 (região LTR e pol) e efetuada uma avaliação prévia de resultados com a utilização de 3 grupos de amostras de referência: amostras positivas (n=15), amostras com ADN VIH-1 quantificado (n=8) e amostras negativas (n=11, positivas para VIH-2). Nos ensaios, foram diretamente testadas amostras de ADN viral extraído de CMSP ou sintetizado a partir de plasma, e também, amostras correspondentes a produtos de PCR gerados por uma prévia amplificação do ADN através de PCR Convencional. Foi selecionado o algoritmo experimental que revelou melhor desempenho na deteção da infeção VIH-1 para análise de amostras clinicas. Estas amostras foram obtidas entre 2009 e 2011, e correspondem a amostras colhidas a mães infetadas (positivas VIH-1, n=149) e a filhos em que não ocorreu a transmissão do vírus (amostras negativas, n=20). O algoritmo experimental em Tempo Real escolhido correspondeu à amplificação de fragmentos de VIH-1 (região LTR) utilizando a combinação dos primers HL456N e HL602C com a sonda TaqMan SHL478N, a partir de amostras de ADN previamente submetidas a PCR Convencional com os primers externos HL456N e HL650C. Em resultado da prévia avaliação com amostras de referência, este algoritmo revelou sensibilidade de 86,7% e um limite de deteção ADN VIH-1 de 0,8 cópias/amostra. Com amostras clínicas foi obtida uma sensibilidade de 75,2 % e de especificidade de 100%. A confirmação da infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 87,5% dos casos (112 casos positivos entre 128 estudados). Foi também obtido um valor de Kappa de 0,417 que mostrou uma concordância moderada entre resultados esperados e obtidos. Comparativamente, na técnica de nested PCR eram conhecidos valores de sensibilidade e especificidade respetivamente de 81,9% e 100% e uma concordância estimada pelo valor de Kappa de 0,565. A confirmação dos casos de infeção com primeiras e segundas amostras foi conseguida em 95,3% dos casos (122 casos positivos entre 128 estudados). Embora se tenha conseguido informação útil e obtido ganhos em tempo através do algoritmo experimental desenvolvido, este apresenta sensibilidade inferior à técnica de nested PCR utilizada no laboratório. Deste modo, para além do aumento da população/amostras em estudo, que se concluiu ser necessário para melhor tratamento estatístico dos resultados, será também essencial um incremento da sensibilidade dos ensaios que poderá ser obtido explorando outras regiões genómicas alvo alternativas às utilizadas no presente estudo.
- Effects of physical exercise training in DNA damage and repair - could the difference be in hOGG1 Ser326Cys polymorphism?Publication . Soares, Jorge; Silva, Amélia; Silva, Patrícia; Almeida, Vanessa; Matos, Manuela; TeixeiraGaivão, João Paulo; Mota, Isabel; Silva, AnaAcute physical exercise is associated with increased oxygen consumption, which could result in an increased formation of reactive oxygen species (ROS). ROS can react with several organic structures, namely DNA, causing strand breaks and a variety of modified bases in DNA. Physical exercise training seems to decrease the incidence of oxidative stress-associated diseases, and is considered as a key component of a healthy lifestyle. This is a result of exercise-induced adaptation, which has been associated with the possible increase in antioxidant activity and in oxidative damage repair enzymes, leading to an improved physiological function and enhanced resistance to oxidative stress (Radak et al. 2008). Human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (hOGG1) is involved in the base excision repair (BER) pathway and encodes an enzyme responsible for removing the most common product of oxidative damage in DNA, 8-hydroxyguanine (8-OH-G). The genetic polymorphism of hOGG1 at codon 326 results in a serine (Ser) to cysteine (Cys) amino acid substitution (Ser326Cys). It has been suggested that the carriers of at least one hOGG1Cys variant allele exhibit lower 8-OH-G excision activity than the wild-type (Wilson et al. 2011). The aim of this study was to investigate the possible influence of hOGG1 Ser326Cys polymorphism on DNA damage and repair activity in response to 16 weeks of combined physical exercise training, in thirty healthy Caucasian men. Comet assay was carried out using peripheral blood lymphocytes and enabled the evaluation of DNA damage, both strand breaks and FPG-sensitive sites, and DNA repair activity. Genotypes were determined by PCR-RFLP analysis. The subjects with Ser/Ser genotype were considered as wild-type group (n=20), Ser/Cys and Cys/Cys genotype were analyzed together as mutant group (n=10). Regarding differences between pre and post-training in the wild-type group, the results showed a significant decrease in DNA strand breaks (DNA SBs) (p=0.002) and also in FPG-sensitive sites (p=0.017). No significant differences were observed in weight (p=0.389) and in lipid peroxidation (MDA) (p=0.102). A significant increase in total antioxidant capacity (evaluated by ABTS) was observed (p=0.010). Regarding mutant group, the results showed a significant decrease in DNA SBs (p=0.008) and in weight (p=0.028). No significant differences were observed in FPG-sensitive sites (p=0.916), in ABTS (p=0.074) and in MDA (p=0.086). No significant changes in DNA repair activity were observed in both genotype groups. This preliminary study suggests the possibility of different responses in DNA damage to physical exercise training, considering the hOGG1 Ser326Cys polymorphism.
- Effects of physical exercise training in DNA damage and repair activity in humans with different genetic polymorphisms ofhOGG1(Ser326Cys)Publication . Soares, Jorge Pinto; Silva, Ana Inês; Silva, Amélia M.; Almeida, Vanessa; Teixeira, João Paulo; Matos, Manuela; Gaivão, Isabel; Mota, Maria PaulaThe main purpose of this pilot study was to investigate the possible influence of genetic polymorphisms of the hOGG1 (Ser326Cys) gene in DNA damage and repair activity by 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1 enzyme) in response to 16 weeks of combined physical exercise training. Thirty-two healthy Caucasian men (40-74 years old) were enrolled in this study. All the subjects were submitted to a training of 16 weeks of combined physical exercise. The subjects with Ser/Ser genotype were considered as wild-type group (WTG), and Ser/Cys and Cys/Cys genotype were analysed together as mutant group (MG). We used comet assay in conjunction with formamidopyrimidine DNA glycoslyase (FPG) to analyse both strand breaks and FPG-sensitive sites. DNA repair activity were also analysed with the comet assay technique. Our results showed no differences between DNA damage (both strand breaks and FPG-sensitive sites) and repair activity (OGG1) between genotype groups (in the pre-training condition). Regarding the possible influence of genotype in the response to 16 weeks of physical exercise training, the results revealed a decrease in DNA strand breaks in both groups, a decrease in FPG-sensitive sites and an increase in total antioxidant capacity in the WTG, but no changes were found in MG. No significant changes in DNA repair activity was observed in both genotype groups with physical exercise training. This preliminary study suggests the possibility of different responses in DNA damage to the physical exercise training, considering the hOGG1 Ser326Cys polymorphism.
- Role of mitochondrial antioxidant defense systems in fatty acid β-oxidation defectsPublication . Rocha, Hugo; Ferreira, Rita; Vitorino, Rui; Almeida, Vanessa; Santa, Cátia; Lopes, Lurdes; Vilarinho, Laura; Amado, FranciscoMitochondrial fatty acid oxidation (FAO) plays a pivotal role in energy homeostasis, namely during periods of fasting or metabolic stress. FAO defects are a group of inherited metabolic disorders that encompass at least twelve distinct enzyme or transporter deficiencies, and can present with a wide range of clinical symptoms with various degrees of severity. Besides recent advances, many doubts still remain on the degree and characteristics of mitochondrial dysfunction on FAOD and its contribution to the clinical phenotype.